专利名称：金核/铂壳纳米棒模拟酶溶液的用途及检测过氧化氢、葡萄糖和胆固醇的方法
金核/铂壳纳米棒模拟酶溶液的用途及检测过氧化氢、葡 萄糖和胆固醇的方法技术领域
本发明属于分析化学技术领域。具体而言，本发明涉及金核/钼壳纳米棒模拟酶 溶液用作催化剂的用途以及一种基于金核/钼壳纳米棒模拟酶溶液直接检测过氧化氢或 通过检测中间产物过氧化氢间接检测其他物质的方法。更具体地，本发明提供水溶性葡萄 糖和脂溶性胆固醇的检测方法。
背景技术：
因高效率和高选择性的催化活性，天然酶在生物化学领域扮演着重要角色。但天 然酶在储存、运输和使用过程中容易受到外在物理、化学因素的影响，如温度、PH值等，而变 性失活。此外，天然酶的价格相对昂贵且制备纯化繁琐。这些缺点限制了它的应用范围。因 此，开发具有酶特征活性、结构比天然酶更稳定的模拟酶在化学工业、农业和生物医药领域 也是极其重要的。
近年来，研究人员发现在体相中呈现化学惰性的金属化合物在纳米尺度下表现 出新颖的类过氧化物酶活性。这些纳米颗粒在不同pH和不同温度下表现出比辣根过氧 化物酶更加稳定的催化特征，是一类新型模拟酶。中国科学院生物物理研究所阎锡蕴研 究小组发现四氧化三铁纳米颗粒具有类过氧化物酶催化活性；并利用这一特性，设计了 两种免疫检测方法，实现了对乙肝病毒表面抗原和肌钙蛋白的检测(L. Z. Gao，J. Zhuang, L. Nie, J. B. Zhang, Y. Zhang, N. Gu, T. Wang, J. Feng, D. L. Yang, S. Perrett, X. Y. Yan, Nature Nanotechnology, 2007, 2, 577-583)。随后，汪尔康等人利用四氧化三铁纳米颗粒类过氧 化物酶特性，实现了对过氧化氢和葡萄糖的检测(H. Wei, E. K. Wang, Anal. Chem. 2008,80, 2250-2254)。之后，氧化石墨烯也被发现具有类过氧化物酶特性，并成功用于模型体系葡萄 糖的检测。与上述纳米颗粒不同的是，我们最近的研究工作表明，贵金属纳米颗粒(如钼) 具有类过氧化物酶和氧化酶双重活性。与其他只具有单一类酶活性的纳米颗粒相比，双功 能活性的模拟酶具有更多的优势。(W. W. He，Y. liu, J. S. Yuan, J. J. Yin, X. C. Wu, X. N. Hu, K. Zhang, J. B. Liu, C. Y. Chen, Y. L. Ji, Y. T. Guo, Biomaterials. 2011，32，1139-1147)通常， 对于具体的测试样品，如血液中，还存在有其他还原性的干扰物质，如尿酸、维生素C、胆红 素和谷胱甘肽等，它们可消耗H2O2，将其还原为H2O,这样就会影响下一步的显色反应，使实 际测得的吸光度下降，致使结果偏低。而金核/钼壳纳米结构类氧化酶活性可以用来预处 理待测试样本，从而显著降低样本中还原性物质的干扰(见实施例)。因此，与其他类过氧 化物酶活性的纳米颗粒相比，本发明利用金核/钼壳纳米结构的双功能酶特性，可预先消 除还原性物质(如抗坏血酸等)对检测的干扰，提供了一种抗还原性物质干扰的检测方法。
对类过氧化物酶活性，底物之一是过氧化氢，因而可以用来直接检测过氧化氢。此 外，许多生化反应的中间产物涉及到过氧化氢，因而可以通过检测过氧化氢间接检测其他 物质，从而搭建一个基于与过氧化氢产生相关的其它物质的检测平台。在本专利中，我们以 水溶性葡萄糖和脂溶性胆固醇作为两类典型的检测实例。葡萄糖是动、植物体内的主要组成部分，葡萄糖浓度的测定在食品分析质量监控、生物化学和临床化学中都占有很重要的 地位。胆固醇是体内其它所有类固醇的前体，例如糖皮质类固醇、性激素、胆汁酸和维生素 D，血液中胆固醇的含量是用于诊断冠心病、动脉硬化、脑血栓和其他多种疾病的重要参数。 葡萄糖和胆固醇在其特定氧化酶的作用下产生过氧化氢，从而可以通过两步反应实现其特 异性检测。目前常用的检测葡萄糖或胆固醇法的方法之一是基于葡萄糖氧化酶(glucose oxidase,GOD)或胆固醇氧化酶(cholesterol oxidase,CHOD)的特异性催化氧化反应结合 过氧化物酶(peroxidase, POD)催化氧化显色底物的方法。首先利用GOD催化葡萄糖氧化 成葡萄糖酸或CHOD催化胆固醇氧化成胆留-4-烯-3-酮，同时产生H2O2, H2O2在过氧化物 酶催化下氧化无色的还原型色原生成有色的氧化型色素，然后根据氧化型色素在特定波长 的吸光度求出样品中葡萄糖或胆固醇的含量。但天然酶对热敏感、稳定性差、来源有限以及 受催化条件局限等缺点限制了它们的广泛应用。发明内容
本发明利用金核/钼壳纳米棒模拟酶，避免了非水溶剂对天然酶活性的影响，实 现了对非水溶性的物质一胆固醇的检测，并得到了与水溶性物质相同的线性检测区间。
本发明的一个目的是，提供金核/钼壳纳米棒模拟酶溶液作为类过氧化物酶或类 氧化酶用作催化剂的用途。
本发明的另一个目的是，提供基于金核/钼壳纳米棒模拟酶溶液检测过氧化氢的 方法，该方法可用于过氧化氢的比色检测，从5 X 10_5到I X 10_3mol/L浓度范围内对过氧化 氢检测呈现好的线性响应。
本发明的再一目的是，提供基于金核/钼壳纳米棒模拟酶溶液并结合葡萄糖氧化 酶来比色检测葡萄糖的方法，该方法可实现抗维生素C干扰的葡萄糖的灵敏、特异检测，该 方法对于葡萄糖比色检测的线性响应范围为5X 10_5到4X 10_4mol/L。
本发明的再一目的是，提供基于金核/钼壳纳米棒模拟酶溶液并结合胆固醇氧化 酶来比色检测胆固醇的方法，该方法可完成胆固醇的灵敏、特异检测，该方法对于胆固醇比 色检测的线性响应范围为3X 10_5到3X 10_4mol/L。
在本说明书中，术语“类过氧化物酶”指显示出过氧化物酶的催化活性的物质。具 体地，本发明的类过氧化物酶催化氧化还原反应，并以过氧化物作为电子受体，从而氧化底 物。
在本说明书中，术语“类氧化酶”指显示出氧化酶的催化活性的物质。具体地，本 发明的类氧化酶催化氧化还原反应，并以分子氧作为电子受体，氧化底物。
在本说明书中，术语“ABTS”是化合物“2，2' —联氮一双(3 —乙基苯并噻唑 啉-6-磺酸)二铵盐”的缩写名称，但二者互换地使用。
本发明的技术方案如下
本发明提供金核/钼壳纳米棒模拟酶溶液作为类过氧化物酶或类氧化酶用作催 化剂的用途。
本发明还提供一种基于金核/钼壳纳米棒模拟酶溶液测定过氧化氢含量的方法， 该方法包括以金核/钼壳纳米棒模拟酶溶液为催化剂，使邻苯二胺(OPD)和过氧化氢水溶 液反应，产生有色物质，测定生成的有色物质，以确定过氧化氢的含量。
优选地，所述金核/钼壳纳米棒模拟酶溶液的浓度为O. 033 O. 133nM，优选为 O.033nMo
优选地，所述邻苯二胺(OPD)的浓度为ImM 3. 3mM,优选为3. 3mM。
优选地，所述反应是在pH值为3. 5 6. 5，优选为4. 5，反应温度为30°C 70°C， 优选为37°C，反应时间为10 60分钟，优选为30分钟的条件下进行的。
优选地，检测的过氧化氢含量的线性范围是5Χ1(Γ5 lXl(T3mol/L，优选为 5 X 10 5 6 X 10 4mol/L0
本发明还提供一种基于金核/钼壳纳米棒模拟酶溶液抗维生素C干扰测定葡萄糖的方法，该方法包括以葡萄糖氧化酶为催化剂使葡萄糖氧化生成过氧化氢，然后根据以上所述的方法来测定过氧化氢的含量，从而确定葡萄糖的含量。
优选地，检测的葡萄糖含量的线性范围是5X 10_5 4X 10_4mol/L。
本发明还提供一种基于金核/钼壳纳米棒模拟酶溶液测定胆固醇的方法，该方法包括以胆固醇氧化酶为催化剂使胆固醇氧化生成过氧化氢，然后根据以上所述的方法来测定过氧化氢的含量，从而确定胆固醇的含量。
优选地，检测的胆固醇含量的线性范围是3X 1(Γ5 3Χ l(T4mol/L
以下将对本发明进行详细描述。
本发明提供金核/钼壳纳米棒模拟酶溶液作为类过氧化物酶或类氧化酶用作催化剂的用途。
本发明的金核/钼壳纳米棒模拟酶溶液含有一种由圆柱状金纳米棒内核和包覆于所述圆柱状金纳米棒内核外表面的岛状多孔钼壳层构成的金核/钼壳结构。
所述的金核/钼壳纳米棒模拟酶溶液的制备方法可以包括如下步骤
I)制备金晶种溶液
向十六烷基三甲基溴化铵水溶液加入四氯金酸水溶液，然后在搅拌的条件下再加入硼氢化钠水溶液，制得第一混合溶液；
所述第一混合溶液中的十六烷基三甲基溴化铵、四氯金酸和硼氢化钠的质量配比为O. 75 O. 0025 0.006;继续搅拌第一混合溶液3分钟，然后静置2 5小时，得到含金晶种的金晶种溶液，该金晶种溶液中金浓度为O. 25mM ；
2)制备金纳米棒溶液
向十六烷基三甲基溴化铵水溶液中依次加入四氯金酸水溶液、硝酸银水溶液和硫酸水溶液；混合均匀后再加入抗坏血酸水溶液，然后向其中加入步骤(I)制备的金晶种溶液，制得第二混合液；再将所述第二混合溶液置入30°C恒温水浴中水浴12 16小时，得到含金纳米棒的金纳米棒溶液；
所述第二混合液中的十六烷基三甲基溴化铵、四氯金酸、硝酸银、硫酸、抗坏血酸与金晶种的质量配比为 5 O. 025 O. 0025 O. 0075 O. 5 O. 04 O. 000015 ；
3)制备纯化的金纳米棒溶液
将步骤2)制备的金纳米棒溶液经离心分离，得到纯化的金纳米棒溶液，并通过加入去离子水，控制纯化的金纳米棒溶液中金纳米棒的浓度为O. 5mM ；
4)制备金核/钼壳纳米棒模拟酶溶液
将步骤3)得到的纯化的金纳米棒溶液与四氯亚钼酸钾溶液混合并摇匀，再加入抗坏血酸水溶液得第三混合溶液；所述第三混合溶液中的抗坏血酸、四氯亚钼酸钾与金纳 米棒的质量配比为5 20 I 3 10;
将上述混合均匀的第三混合溶液置入30 V的恒温水浴中反应2 3小时，溶液由 枣红色变成了暗灰色；之后再向第三溶液中加入十六烷基三甲基溴化铵水溶液，并使加入 十六烷基三甲基溴化铵后的溶液中的十六烷基三甲基溴化铵浓度为O. 03M ;然后再进行离 心分离，得到金核/钼壳纳米棒模拟酶溶液；
5)金核/钼壳纳米棒模拟酶溶液的改性
将步骤4)得到的金核/钼壳纳米棒模拟溶液在每分钟12000转的转速下离心分 离5分钟，弃去上清液，向沉淀中加入与上清液等体积的改性溶液，所述改性溶液由浓度为 lmg/mL的聚苯乙烯磺酸钠溶液和浓度为3. OmM的氯化钠溶液组成的混合液；再将所述混合 液进行超声10 25分钟，然后静置3 10小时，得到改性的金核/钼壳纳米棒模拟酶溶 液；
6)改性的金核/钼壳纳米棒模拟酶溶液的纯化
将步骤5)制得的改性的金核/钼壳纳米棒模拟酶溶液，在每分钟12000转的转 速下尚心分尚5分钟,弃去尚心分尚后的上清液,加入与上清液等体积的去尚子水,分散均 匀，得到经纯化的改性的金核/钼壳纳米棒模拟酶溶液。
所述十六烷基三甲基溴化铵水溶液的浓度为O.1M ;所述四氯金酸水溶液的浓度 为24. 7mM ;所述硼氢化钠水溶液的浓度为O. OlM ;所述硝酸银水溶液的浓度为IOmM ;所述 硫酸水溶液的浓度为O. 5M ;所述抗坏血酸水溶液的浓度为O.1M ;所述四氯亚钼酸钾的浓度 为 2. OmM。
本发明还提供一种基于金核/钼壳纳米棒模拟酶溶液测定过氧化氢含量的方法， 该方法包括以金核/钼壳纳米棒模拟酶溶液为催化剂，使邻苯二胺(OPD)或2，2' —联氮 一双(3—乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)和过氧化氢水溶液反应，产生有色或 发光物质，测定生成的有色或发光物质，以确定过氧化氢的含量。
优选地，所述金核/钼壳纳米棒模拟酶溶液的浓度为O. 033 O. 133nM，优选为 O. 033nMo
优选地，所述邻苯二胺(OPD)的浓度为ImM 3. 3mM,优选为3. 3mM。
优选地，所述反应是在pH值为3. 5 6. 5，优选为4. 5，反应温度为30°C 70°C， 优选为37°C，反应时间为10 60分钟，优选为30分钟的条件下进行的。
优选地，检测的过氧化氢含量的线性范围是5 X 10_51 X 10_3mol/L，优选为 5 X 10 5 6 X 10 4mol/L0
该检测方法的反应原理如下
金核/铂壳纳米棒模拟酶 邻苯二胺+过氧化氢- 2,2’-二氣基偶氮苯+水
在本发明的一个实施方案中，利用金核/钼壳纳米棒模拟酶比色测定过氧化氢的 步骤如下
(I)取2. 8ml O.1M pH 4. 5的磷酸缓冲溶液，依次向其中加入邻苯二胺(OPD)、金 核钼壳纳米棒模拟酶溶液和过氧化氢水溶液，并使邻苯二胺的浓度为3. 3mM，金核钼壳纳米棒模拟酶的浓度为O. 033nM ;然后将上述溶液混合均匀；所述混合溶液中固定金核/钼壳纳米棒模拟酶与邻苯二胺的摩尔比为1: 4X IO9 ;只改变加入过氧化氢水溶液的浓度为0， O. 05，O. 1,0. 2,0. 4,0. 6,0. 8，1,2,4,5,10，50，100，IOOOmM ；
(2)将步骤⑴中所得混合液在37°C水浴中反应30分钟；
(3)取100 μ I终止液(10Μ H2SO4和O. 5Μ Na2SO3)加入到步骤(2)中所得混合液；
(4)用紫外-可见吸收分光光度计测定上述混合溶液紫外吸收光谱。
本发明还提供一种基于金核/钼壳纳米棒模拟酶溶液测定葡萄糖的方法，该方法包括以葡萄糖氧化酶为催化剂使葡萄糖氧化生成过氧化氢，然后根据以上所述的方法来测定过氧化氢的含量，从而确定葡萄糖的含量。
优选地，检测的葡萄糖含量的线性范围是5 X 1(Γ5 4Χ l(T4mol/L。
该检测方法的反应原理如下
葡萄糖氧化酶氧气+葡萄糖- 过氧化氢+葡萄糖酸
金核/铂壳纳米棒模拟酶邻苯二胺+过氧化氢- 2,2’-二氣基偶氮苯+水
在本发明的一个实施方案中，利用金核/钼壳纳米棒模拟酶并结合葡萄糖氧化酶来比色检测葡萄糖的步骤如下
(I)取500ml IOmM pH = 7. O的磷酸缓冲溶液中，向其中加入20 μ I 10mg/mL的葡萄糖氧化酶和待测的葡萄糖磷酸缓冲溶液，然后将上述溶液混合均匀，于37°C反应30 分钟，得到葡萄糖反应液；所述混合溶液中只改变加入葡萄糖磷酸缓冲溶液的浓度为0， O. 05，O. 1,0. 2,0. 4,0. 6,0. 8, l,2mM ；
(2)取2. 4ml O.1M pH 4. 5的磷酸缓冲溶液，依次加入邻苯二胺(OPD)、金核钼壳纳米棒模拟酶溶液，并使邻苯二胺的浓度为3. 3mM,金核钼壳纳米棒模拟酶的浓度为 O. 033nM，以及上述步骤(I)的葡萄糖反应液中；所述混合溶液中固定金核/钼壳纳米棒模拟酶与邻苯二胺的摩尔比为1: 4X109;
(3)将步骤⑵中所得混合液在37 °C水浴中反应30分钟；
(4)取100 μ I终止液(10Μ H2SO4和O. 5Μ Na2SO3)加入到步骤(2)中所得混合液；
(5)用紫外-可见吸收分光光度计测定上述混合溶液紫外吸收光谱。
本发明还提供一种基于金核/钼壳纳米棒模拟酶溶液测定胆固醇的方法，该方法包括以胆固醇氧化酶为催化剂使胆固醇氧化生成过氧化氢，然后根据以上所述的方法来测定过氧化氢的含量，从而确定胆固醇的含量。
优选地，检测的胆固醇含量的线性范围是3Χ 1(Γ5 3Χ l(T4mol/L。
该检测方法的反应原理如下
权利要求
1.金核/钼壳纳米棒模拟酶溶液作为类过氧化物酶或类氧化酶用作催化剂的用途。
2.一种基于金核/钼壳纳米棒模拟酶溶液测定过氧化氢含量的方法，该方法包括以金核/钼壳纳米棒模拟酶溶液为催化剂，使邻苯二胺(OPD)或2，2' —联氮一双(3—乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)和过氧化氢水溶液反应，产生有色物质，测定生成的有色物质，以确定过氧化氢的含量。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述金核/钼壳纳米棒模拟酶溶液的浓度为 O. 033 O. 133nM，优选为 O. 033nM。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述邻苯二胺(OPD)的浓度为ImM 3.3mM，优选为 3. 3mM。
5.根据权利要求2至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述反应是在pH值为3.5 6.5，优选为4. 5，反应温度为30°C 70°C，优选为37°C，反应时间为10 60分钟，优选为30分钟的条件下进行的。
6.根据权利要求2至5中任一项所述的方法，其特征在于，检测的过氧化氢含量的线性范围是 5X10—5 lXl(T3mol/L，优选为 5 X 1(Γ5 6 X l(T4mol/L。
7.一种基于金核/钼壳纳米棒模拟酶溶液测定葡萄糖的方法，该方法包括以葡萄糖氧化酶为催化剂使葡萄糖氧化生成过氧化氢，然后根据权利要求2至6中任一项所述的方法来测定过氧化氢的含量，从而确定葡萄糖的含量。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，检测的葡萄糖含量的线性范围是5Χ1(Γ5 4Xl(T4mol/L。
9.一种基于金核/钼壳纳米棒模拟酶溶液测定胆固醇的方法，该方法包括以胆固醇氧化酶为催化剂使胆固醇氧化生成过氧化氢，然后根据权利要求2至6中任一项所述的方法来测定过氧化氢的含量，从而确定胆固醇的含量。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，检测的胆固醇含量的线性范围是3Χ1(Γ5 3Xl(T4mol/L。
全文摘要
本发明涉及金核/铂壳纳米棒模拟酶溶液的用途及检测过氧化氢、葡萄糖和胆固醇的方法。本发明检测过氧化氢的方法包括以金核/铂壳纳米棒模拟酶溶液为催化剂，使邻苯二胺(OPD)和过氧化氢水溶液反应，产生有色物质，测定生成的有色物质，以确定过氧化氢的含量。本发明检测葡萄糖或胆固醇的方法包括以葡萄糖氧化酶或胆固醇氧化酶为催化剂使葡萄糖或胆固醇氧化生成过氧化氢，然后再检测生成的过氧化氢的含量，从而确定葡萄糖或胆固醇的含量。本发明的方法简单、经济、环保且高效。
文档编号G01N33/52GK102998413SQ201110275358
公开日2013年3月27日 申请日期2011年9月16日 优先权日2011年9月16日
发明者刘建波, 吴晓春 申请人:国家纳米科学中心