一种具有四种模拟酶活性的铂纳米材料及其制备方法
【专利摘要】本发明公开一种 具有四种模拟酶活性的铂纳米材料及其制备方法，其是 以柠檬酸根离子为修饰剂，利用硼氢化钠还原氯铂酸，制备柠檬酸修饰的铂纳米材料。铂纳米材料制备简单快速，粒径小，水溶液分散性和稳定性高。所得铂纳米材料同时具有四种模拟酶活性，包括过氧化物酶、氧化酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶。铂纳米材料的四种模拟酶活性可通过制备过程中使用的柠檬酸根离子浓度来调控。
【专利说明】一种具有四种模拟酶活性的铂纳米材料及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及同时具有四种模拟酶活性(过氧化物酶、氧化酶、过氧化氢酶、超氧化 物歧化酶）的一种钼纳米材料及其制备方法，属于纳米技术和仿生【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 酶是生物体内非常重要，具有催化活性的蛋白质，它催化效率高、专一性强、反应 条件温和，生物体的生长、发育、繁殖等生命活动都离不开酶的催化作用。然而天然酶来源 有限，提纯困难，价格昂贵。同时，天然酶容易受到多种物理、化学因素的影响而失去活性， 所以在实际应用中对实验的操作条件较为苛刻，使其应用受到了极大的限制。由于纳米人 工模拟酶具有催化效率高、稳定、经济和规模化制备的特点。纳米材料在医学、化工、食品、 农业和环境等领域的应用研究便应运而生。纳米人工模拟酶的发现，不仅推动了纳米科技 的基础研究还拓展了纳米材料的应用。
[0003] 自2007年四氧化三铁纳米粒子被证实拥有过氧化物模拟酶活性，继而越来越多 无机纳米材料被发现拥有模拟酶活性，如氧化铈已被证实拥有氧化物酶活性，纳米氧化铜 拥有高活性的过氧化物酶活性等。由于上述纳米人工模拟酶的优点，可以通过利用不同的 模拟酶活性，构建不同的方法或者应用于未来未知的领域。虽然纳米人工模拟酶已得到大 量的研究，但是目前所发现的多为单功能模拟酶以及少数的一些双功能模拟酶，因此研究 开发多功能纳米人工模拟酶具有重要的理论和实际意义。
[0004] 本发明提供了一种同时具有包括过氧化物酶、氧化酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化 酶四种模拟酶活性的钼纳米材料及其制备方法。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种以柠檬酸根离子为修饰剂的钼纳米材料及其制备方法， 利用硼氢化钠为还原剂，氯钼酸为前体，制备柠檬酸修饰的钼纳米材料。所得材料具有四种 模拟酶活性，包括过氧化物酶、氧化酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶。通过制备方法条件可 调控四种模拟酶活性。
[0006] 为了实现上述检测方法的目的，本发明采用以下技术方案： 本发明所述的一种同时具有四种模拟酶活性的钼纳米材料，其特征是它由以下步骤制 成的：在柠檬酸三钠溶液中加入氯钼酸水溶液，混匀搅拌一段时间后，加入硼氢化钠水溶 液，继续混匀搅拌得到柠檬酸修饰的钼纳米材料，将水溶液冷冻干燥即得到钼纳米材料粉 末，所述的钼纳米材料具有过氧化物酶、氧化酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶活性。钼纳米 材料优选由以下步骤制成的：在0. 01飞ml、浓度为5?200 mmol/L柠檬酸三钠溶液中加入 0. 01~5 ml、浓度为1~100 mmol/L氯钼酸水溶液，混匀搅拌一段时间后，加入0. 05~0. 5 ml、 浓度为1〇~400 mmol/L硼氢化钠水溶液，继续混匀搅拌得到柠檬酸修饰的钼纳米材料。钼 纳米材料最优选由以下步骤制成的：将I ml浓度为16 mmol/L氯钼酸水溶液与I ml浓 度为40 mmol/L的柠檬酸三钠混合，并用38 ml的双蒸水稀释，暗处搅拌30分钟。随后加 入0. 2 ml浓度为50 mmol/L的硼氢化钠水溶液，加入时间控制在2分钟内，反应溶液颜色 从浅黄色变成棕黄色，暗处继续搅拌1小时得到柠檬酸修饰的钼纳米材料。
[0007] 所述的一种同时具有四种模拟酶活性的钼纳米材料，其特征是能催化过氧化氢氧 化3, 3'，5, 5' -四甲基联苯胺盐酸盐显色，具有过氧化物酶活性。
[0008] 所述的一种同时具有四种模拟酶活性的钼纳米材料，其特征是能催化氧气氧化 3, 3'，5, 5' -四甲基联苯胺盐酸盐显色，具有氧化酶活性。
[0009] 所述的一种同时具有四种模拟酶活性的钼纳米材料，其特征是能催化过氧化氢分 解为水和氧气，具有过氧化氢酶活性。
[0010] 所述的一种同时具有四种模拟酶活性的钼纳米材料，其特征是能抑制邻苯三酚的 自氧化，具有超氧化物歧化酶活性。
[0011] 所得到的钼纳米材料由86%的Pt°和14%的Pt4+组成，平均粒径为2. 5 ±0. 4 nm， 所得纳米粒子的晶面间距为〇. 223 nm，对应于钼晶体的111晶面。
[0012] 本发明所述的一种同时具有四种模拟酶活性的钼纳米材料的制备方法，其特征是 在0.01?5 ml、浓度为5?200 mmol/L柠檬酸三钠溶液中加入0.01?5 ml、浓度为1?100 mmol/ L氯钼酸水溶液，混匀搅拌一段时间后，加入0. 05~0. 5 ml、浓度为1(T400 mmol/L硼氢化钠 水溶液，继续混匀搅拌得到柠檬酸修饰的钼纳米材料。
[0013] 所制得的钼纳米材料的过氧化物酶、氧化酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶活性在 同样的氯钼酸、硼氢化钠的条件下能通过改变柠檬酸根离子的浓度来加以调控的。
[0014] 本发明采用如下的具体技术方案为： (一)钼纳米材料的制备：首先，将I ml浓度为16 mmol/L氯钼酸水溶液与I ml浓度 为40 mmol/L的朽1檬酸三钠混合，并用38 ml的双蒸水稀释，暗处搅拌30分钟。随后加入 0. 2 ml浓度为50 mmol/L的硼氢化钠水溶液(加入时间控制在2分钟内），反应溶液颜色从 浅黄色变成棕黄色，暗处继续搅拌1小时。所得的钼纳米材料浓度为78 mg/L，平均粒径为 2. 5±0. 4 nm，4°C保存。制备过程中使用的所有玻璃器皿均经过王水浸泡，并用双蒸水彻底 清洗，晾干。
[0015] (二）钼纳米材料模拟过氧化物酶：取0. I ml技术方案1制备后稀释50倍的钼纳 米材料溶液（1.56 mg/L)，加入2. 7 ml的磷酸盐缓冲液（pH=4. 5,20 mmol/L)、l ml浓度为2 mol/L的过氧化氢、0. 2 ml浓度为16 mmol/L的3, 3'，5, 5' -四甲基联苯胺盐酸盐，混合后 45°C水浴10分钟，目视观察颜色的变化或者根据体系在紫外652 nm处吸收值，利用朗伯比 尔定律可计算过氧化物酶活力。
[0016](三）钼纳米材料模拟氧化酶：取0.2 ml技术方案1制备的钼纳米材料溶液（78 mg/L)，加入3. 6 ml的磷酸盐缓冲液（pH=4. 5, 20 mmol/L)和0. 2 ml浓度为16 mmol/L的 3, 3'，5, 5' -四甲基联苯胺盐酸盐，混合后45°C水浴10分钟，目视观察颜色的变化或者根 据体系在紫外652 nm处吸收值，利用朗伯比尔定律可计算氧化酶活力。
[0017](四）钼纳米材料模拟过氧化氢酶：取I ml过氧化氢加入I. 9 ml磷酸盐缓冲液 (pH=7.8,50 mmol/L)，根据调节过氧化氢的浓度使其在紫外240 nm处的吸光值在0. 5? 0. 55。随后，取0. I ml技术方案1制备的钼纳米材料溶液（78 mg/L)加入上述2. 9 ml的 体系中，室温反应20分钟后吸入毛细管中观察或者根据紫外240 nm吸收值的变化速率可 计算过氧化氢酶活力。
[0018](五）钼纳米材料模拟超氧化物歧化酶：空白组取5 ill邻苯三酚（83. 3 ilmol/L) 加入2. 975 ml的Tris-盐酸缓冲液（pH=8. 2，50 mmol/L)，在4分钟内检测紫外325 nm吸 收值变化使邻苯三酚自氧化速率在0.07/每分钟。继而，实验组取5 ill邻苯三酚（83. 3 y mol/L)加入20 ill技术方案1制备后稀释50倍的钼纳米材料溶液（1. 56 mg/L)及2. 955 ml的Tris-盐酸缓冲液（pH=8. 2，50 mmol/L)，在4分钟内检测紫外325 nm吸收值变化并 计算邻苯三酚自氧化速率，根据实验组抑制的邻苯三酚自氧化速率可计算超氧化物歧化酶 活力。
[0019] 本发明的优点： (1)本发明所使用的钼纳米材料由柠檬酸作为稳定剂修饰在表面，硼氢化钠还原氯钼 酸得到，其制备过程简单快速。
[0020] (2)本发明制备的钼纳米材料粒径小，水溶液分散性和稳定性高。
[0021] (3)本发明制备的钼纳米材料具有四种模拟酶活性，包括过氧化物酶、氧化酶、过 氧化氢酶、超氧化物歧化酶。
[0022] (4)本发明制备的钼纳米材料的四种模拟酶活性可通过制备条件加以调节。
【专利附图】
【附图说明】
[0023] 图1为钼纳米材料的透射电镜图。
[0024] 图2为钼纳米材料的高分辨透射电镜图。
[0025] 图3为钼纳米材料的Pt (4f) X射线光电子能谱图。
[0026] 图4为钼纳米材料模拟过氧化物酶催化过氧化氢氧化3, 3'，5, 5' -四甲基联苯胺 盐酸盐显色的照片。图中A为当加入的为3, 3'，5, 5' -四甲基联苯胺盐酸盐时，其呈几乎 无色，B为当加入的为3, 3'，5, 5' -四甲基联苯胺盐酸盐+过氧化氢时，其呈几乎无色，C为 当加入的为3, 3'，5, 5' -四甲基联苯胺盐酸盐+钼纳米材料时，其呈几乎无色，D为当加入 的为3, 3'，5, 5' -四甲基联苯胺盐酸盐+过氧化氢+钼纳米材料时，其呈深蓝色。
[0027] 图5为钼纳米材料模拟氧化酶氧化3, 3'，5, 5' -四甲基联苯胺盐酸盐显色的照 片。图中A为当加入的为3, 3'，5, 5'-四甲基联苯胺盐酸盐时，其呈几乎无色，B为当加 入的为3, 3'，5, 5' -四甲基联苯胺盐酸盐+钼纳米材料时，其呈深蓝色，C为当B在通氮气 20分钟后、3, 3'，5, 5' -四甲基联苯胺盐酸盐+钼纳米材料体系的显色不明显。
[0028] 图6为钼纳米材料模拟过氧化氢酶在毛细管中分解过氧化氢产生气泡的照片。
[0029] 图7为钼纳米材料模拟过氧化氢酶分解过氧化氢，过氧化氢在240 nm处吸光值的 变化速率图。
[0030] 图8为钼纳米材料模拟超氧化物歧化酶影响邻苯三酚自氧化速率，邻苯三酚在紫 外325 nm处自氧化速率变化图。
【具体实施方式】
[0031] 实施例1 : 将I ml浓度为16 mmol/L氯钼酸水溶液与I ml浓度为40 mmol/L的朽1檬酸三钠混 合，并用38 ml的双蒸水稀释，暗处搅拌30分钟。随后加入0. 2 ml浓度为50 mmol/L的硼 氢化钠水溶液(加入时间控制在2分钟内），反应溶液颜色从浅黄色变成棕黄色，暗处继续搅 拌1小时。所得的钼纳米材料溶液浓度为78 mg/L，4°C保存。以上过程中使用的所有玻璃 器皿均经过王水浸泡，并用双蒸水彻底清洗，晾干。
[0032] 实施例2 : 取实施例1所得溶液滴涂在铜网上进行透射电镜检测。如图1所示，钼纳米粒子平均 粒径为2. 5±0. 4 nm。如图2所示，所得纳米粒子的晶面间距为0? 223 nm，对应于钼晶体的 111晶面。
[0033] 实施例3 : 取实施例1所得溶液冷冻干燥得到粉末，取所得粉末进行X射线光电子能谱测定。如 图3所示，所得到的钼纳米粒子由86%的Pt°和14%的Pt4+组成。
[0034] 实施例4 : 取实施例1制备的钼纳米材料溶液稀释50倍得浓度为1. 56 mg/L的钼纳米材料溶液。 取0. I ml浓度为1. 56 mg/L的钼纳米材料溶液，加入2. 7 ml的磷酸盐缓冲液（pH=4. 5, 20 mmol/L)、l ml浓度为2 mol/L的过氧化氢、0.2 ml浓度为16 mmol/L的3,3'，5,5'_四甲基 联苯胺盐酸盐，混合后45°C水浴10分钟，目视观察颜色的变化或根据体系在紫外652 nm处 吸收值，利用朗伯比尔定律计算过氧化物酶活力。如图4所示，当体系分别为3, 3'，5, 5四 甲基联苯胺盐酸盐，3, 3'，5, 5' -四甲基联苯胺盐酸盐+过氧化氢，3, 3'，5, 5' -四甲基联 苯胺盐酸盐+钼纳米材料时，显色体系几乎无色，当体系为3, 3'，5, 5' -四甲基联苯胺盐酸 盐+过氧化氢+钼纳米材料时，显色体系显深蓝色，说明钼纳米材料可以模拟过氧化物酶催 化过氧化氢氧化3, 3'，5, 5' -四甲基联苯胺盐酸盐，具有过氧化物酶活性。
[0035] 实施例5 : 取0. 2 ml实施例1制备的浓度为78 mg/L的钼纳米材料溶液，加入3. 6 ml的磷酸盐 缓冲液（pH=4. 5, 20 mmol/L)和0. 2 ml浓度为16 mmol/L的3, 3'，5, 5' -四甲基联苯胺盐 酸盐，混合后45°C水浴10分钟，目视观察颜色的变化或根据体系在紫外652 nm处吸收值， 利用朗伯比尔定律可计算氧化酶活力。如图5所示，当体系为3,3'，5,5' -四甲基联苯胺 盐酸盐，显色体系几乎无色，当体系为3, 3'，5, 5' -四甲基联苯胺盐酸盐+钼纳米材料时， 显色体系显深蓝色，进而将未反应的体系通氮气除氧20分钟，体系3, 3'，5, 5' -四甲基联 苯胺盐酸盐+钼纳米材料则显色不明显，说明钼纳米材料可以模拟氧化酶在有氧气的情况 下氧化3, 3'，5, 5' -四甲基联苯胺盐酸盐，具有氧化酶活性。
[0036] 实施例6 : 取I ml过氧化氢加入1.9 ml磷酸盐缓冲液（pH=7. 8,50 mmol/L)，调节过氧化氢的 浓度使其在240 nm处的吸光值为0. 5?0. 55。随后，取0. I ml实施例1制备的浓度为78 mg/L的钼纳米材料溶液加入上述2. 9 ml的体系中，室温反应20分钟后吸入毛细管中观察。 如图6所示，钼纳米材料可模拟过氧化氢酶在毛细管中分解过氧化氢产生明显的气泡。
[0037] 实施例7 : 取I ml过氧化氢加入1.9 ml磷酸盐缓冲液（Ph=7. 8,50 mmol/L)，调节过氧化氢的 浓度使其在240 nm处的吸光值为0. 5?0. 55。随后，取0. I ml实施例1制备的浓度为78 mg/L的钼纳米材料溶液加入上述2. 9 ml的体系中，室温反应20分钟，根据紫外240 nm吸 收值的变化速率计算过氧化氢酶活力。如图7所示，过氧化氢的吸光值在没有钼纳米材料 存在的时候基本保持不变，而在钼纳米材料存在时随时间延长逐渐减小。
[0038] 实施例8 : 空白组取5 ill邻苯三酚（83.3 iimol/L)加入2. 975 ml的Tris-盐酸缓冲液（pH=8. 2， 50 mmol/L)，在4分钟内检测紫外325 nm吸收值变化使邻苯三酚自氧化速率在0.07/每 分钟。继而，实验组取5 ill邻苯三酚（83. 3 ii mol/L)加入20 ill实施例1制备后稀释 50倍浓度为1. 56 mg/L的钼纳米材料溶液及2. 955 ml的Tris-盐酸缓冲液（pH=8. 2，50 mmol/L)，在4分钟内检测紫外325 nm吸收值变化并计算邻苯三酚自氧化速率，根据实验组 抑制的邻苯三酚自氧化速率计算超氧化物歧化酶活力。结果如图8所示，加入钼纳米材料 的实验组其邻苯三酚自氧化速率得到明显的抑制，证明钼纳米材料能够模拟超氧化物歧化 酶。
[0039] 实施例9 : 将I ml浓度为16 mmol/L氯钼酸水溶液与I ml浓度为5 mmol/L的朽1檬酸三钠混 合，并用38 ml的双蒸水稀释，暗处搅拌30分钟。随后加入0. 2 ml浓度为50 mmol/L的硼 氢化钠水溶液(加入时间控制在2分钟内），反应溶液颜色从浅黄色变成棕黄色，暗处继续搅 拌1小时。所得的钼纳米材料溶液浓度为78 mg/L，4°C保存。以上过程中使用的所有玻璃 器皿均经过王水浸泡，并用双蒸水彻底清洗，晾干。
[0040] 实施例10 : 将I ml浓度为16 mmol/L氯钼酸水溶液与I ml浓度为200 mmol/L的朽1檬酸三钠混 合，并用38 ml的双蒸水稀释，暗处搅拌30分钟。随后加入0. 2 ml浓度为50 mmol/L的硼 氢化钠水溶液(加入时间控制在2分钟内），反应溶液颜色从浅黄色变成棕黄色，暗处继续搅 拌1小时。所得的钼纳米材料溶液浓度为78 mg/L，4°C保存。以上过程中使用的所有玻璃 器皿均经过王水浸泡，并用双蒸水彻底清洗，晾干。
[0041] 实施例11 : 分别取实施例1、实施例9、实施例10所制备的钼纳米材料，分别根据实施例4、实施例 5、实施例7、实施例8方法测定过氧化物酶、氧化酶、过氧化氢酶、超氧化歧化酶活性。如下 表1所示，钼纳米材料的四种模拟酶活性可通过制备中所使用的柠檬酸根离子浓度来加以 调节。
[0042] 表 1
【权利要求】
1. 一种同时具有四种模拟酶活性的钼纳米材料，其特征是它由以下步骤制成的：在柠 檬酸三钠溶液中加入氯钼酸水溶液，混匀搅拌一段时间后，加入硼氢化钠水溶液，继续混匀 搅拌得到柠檬酸修饰的钼纳米材料，将水溶液冷冻干燥即得到钼纳米材料粉末，所述的钼 纳米材料具有过氧化物酶、氧化酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶活性。
2. 根据权利要求1所述的一种同时具有四种模拟酶活性的钼纳米材料，其特征是能催 化过氧化氢氧化3, 3'，5, 5' -四甲基联苯胺盐酸盐显色，具有过氧化物酶活性。
3. 根据权利要求1所述的一种同时具有四种模拟酶活性的钼纳米材料，其特征是能催 化氧气氧化3, 3'，5, 5' -四甲基联苯胺盐酸盐显色，具有氧化酶活性。
4. 根据权利要求1所述的一种同时具有四种模拟酶活性的钼纳米材料，其特征是能催 化过氧化氢分解为水和氧气，具有过氧化氢酶活性。
5. 根据权利要求1所述的一种同时具有四种模拟酶活性的钼纳米材料，其特征是能抑 制邻苯三酚的自氧化，具有超氧化物歧化酶活性。
6. 根据权利要求1所述的一种同时具有四种模拟酶活性的钼纳米材料，其特征为钼 纳米材料由以下步骤制成的：在〇.〇1飞ml、浓度为5?200 mmol/L柠檬酸三钠溶液中加入 0. 01~5 ml、浓度为1~100 mmol/L氯钼酸水溶液，混匀搅拌一段时间后，加入0. 05、. 5 ml、 浓度为1〇~400 mmol/L硼氢化钠水溶液，继续混匀搅拌得到柠檬酸修饰的钼纳米材料。
7. 根据权利要求6所述的一种同时具有四种模拟酶活性的钼纳米材料，其特征为钼 纳米材料由以下步骤制成的：将I ml浓度为16 mmol/L氯钼酸水溶液与I ml浓度为40 mm〇l/L的朽1檬酸三钠混合，并用38 ml的双蒸水稀释，暗处搅拌30分钟；随后加入0. 2 ml 浓度为50 mmol/L的硼氢化钠水溶液，加入时间控制在2分钟内，反应溶液颜色从浅黄色变 成棕黄色，暗处继续搅拌1小时得到柠檬酸修饰的钼纳米材料。
8. 根据权利要求6或7所述的一种同时具有四种模拟酶活性的钼纳米材料，其特征是 所得到的钼纳米材料由86%的Pt°和14%的Pt 4+组成，平均粒径为2. 5±0. 4 nm，所得纳米 粒子的晶面间距为0. 223 nm，对应于钼晶体的111晶面。
9. 权利要求1-8任一所述的一种同时具有四种模拟酶活性的钼纳米材料的制备方 法，其特征是在0.01飞ml、浓度为5?200 mmol/L柠檬酸三钠溶液中加入0.01飞ml、浓度 为1~100 mmol/L氯钼酸水溶液，混匀搅拌一段时间后，加入0.05、. 5 ml、浓度为KT400 mm〇l/L硼氢化钠水溶液，继续混匀搅拌得到柠檬酸修饰的钼纳米材料。
10. 根据权利要求9所述的一种同时具有四种模拟酶活性的钼纳米材料的制备方法， 其特征是所制得的钼纳米材料的过氧化物酶、氧化酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶活性在 同样的氯钼酸、硼氢化钠的条件下能通过改变柠檬酸根离子的浓度来加以调控的。
【文档编号】B22F9/24GK104308139SQ201410488414
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年9月22日 优先权日:2014年9月22日
【发明者】陈伟, 何少斌, 吴钢伟, 邓豪华, 彭花萍 申请人:福建医科大学