专利名称：尿β－胶原降解产物检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型屈于医疗器械领域，具体地是涉及一种尿β-胶原降解产物检测试剂
品.O
背景技术：
I型胶原占骨有机基质90%以上，并主要在骨中合成。骨骼更新时，I型胶原被降解，短肽片段进入尿液。这些片段可用尿胶原降解产物检测试剂盒检测，并有文献报道此分析有助于患骨代谢疾病的病人抗骨吸收治疗后的研究。目前，市场上缺少特异性、灵敏度好，且操作简单的相关检测试剂盒。
实用新型内容本实用新型的目的之一是提供一种尿β -胶原降解产物检测试剂盒。实现上述目的的技术方案如下一种尿胶原降解产物检测试剂盒，包括盒体，盒体内主要有具有放置试剂瓶的下凹瓶位、位于下凹瓶位上的试剂瓶、以及置于塑料框架中的微孔板；其特征是，所述微孔板的微孔内包被有CTX-I抗原层，所述包被的CTX-I抗原量为0. 54-0. 66 μ g ；所述试剂瓶包括装有浓度为3. 8ug/ml-4. 2ug/ml的兔抗CTX抗体溶液的试剂瓶和装有过氧化物酶偶联羊抗兔抗体溶液的试剂瓶。更进一步地，所述尿β-胶原降解产物检测试剂盒还包括有1瓶具有Ilml的 CTX-I标准品的试剂瓶，5瓶分别具有0. 3ml的CTX-I标准品的试剂瓶，2瓶分别具有0. 5ml 的尿质控品的试剂瓶，1瓶具有12ml的底物溶液的试剂瓶，1瓶具有12ml的终止液的试剂瓶和1瓶具有20ml冲洗液的试剂瓶。所述尿β -胶原降解产物检测试剂盒还包括有用于检测时密封微孔板的封口膜。所述尿β -胶原降解产物检测试剂盒采用酶联免疫法，基于抗CTX-I抗体对可溶性CTX-I抗原或包被CTX-I抗原的微孔的竞争性结合。所述尿β-胶原降解产物检测试剂盒具有特异性、灵敏度和精密度都非常好的优点。
图1是本实用新型实施例1所述微孔板的结构示意图；图2是本实用新型实施例1所述盒体与下凹瓶位的结构示意图。
具体实施方式
本实用新型所述的尿β -胶原降解产物检测试剂盒，其检测方法为标准品、质控和待测样本加入微孔板中，再加入抗CTX-I抗体，18-22°c孵育1小时。洗涤微孔板，加入过氧化物酶偶联抗兔抗体，18-22°C下再孵育1小时。第二次洗涤微孔板后，与生色底物孵育 15分钟，终止显色反应，测量吸光度。[0013]实施例1(一 )、本实施例所述的尿β -胶原降解产物检测试剂盒的主要组成成份如下参见图1和图2，所述尿β -胶原降解产物检测试剂盒的盒体4内具有固定泡沫模具形成的下凹瓶位5 (共有13个下凹瓶位)，下凹瓶位5用于放置装有溶液的试剂瓶；位于塑料框架1中的微孔板2，微孔板2中的微孔3包被有CTX-I抗原层。具体组成如下1.微孔板预包被CTX-I抗原的6条微孔板Qx 8孔/每条)，置于塑料框架中。每个微孔包被CTX-I抗原的量为0.6yg。2. CTX-I标准品0试剂瓶一瓶(IlmL)可直接使用的缓冲溶液。3. CTX-I标准品1-5试剂瓶五瓶(0. 3mL/瓶)可直接使用的CTX-I标准品。4.尿质控品试剂瓶两瓶(0. 5mL/瓶)可直接使用的人尿，即尿质控品。5. 一抗溶液试剂瓶一瓶(12mL)可直接使用的兔抗CTX-I抗体，所述兔抗CTX-I抗体的浓度为4. Oug/ ml ο6.过氧化物酶偶联抗体试剂瓶—瓶(12mL)可直接使用的辣根过氧化物酶偶联的抗兔抗体。7.底物溶液试剂瓶一瓶(12mL)可直接使用的四甲基联苯胺(TMB)底物(溶于酸性缓冲液中)。请注意该生色底物可带浅蓝色。8.终止液试剂瓶一瓶(12mL)可直接使用的0. 18mol/L硫酸溶液。9.冲洗液50倍试剂瓶一瓶(20mL)含有去污剂和防腐剂的浓缩冲洗缓冲液。用前1 50的比例稀释。10.封口膜孵育时密封微孔板的粘性薄膜。( 二)、所述尿β -胶原降解产物检测试剂盒的制备方法如下一、包被CTX-I抗原的微孔板CTX-I 抗原购自 Nordic Bioscience Diagnostic A/S 公司。用 0· 05M PH 为 7· 4 的PBS缓冲液将CTX-I抗原稀释至CTX-I抗原含量为6. 0 μ g/ml。1)包被把稀释好的CTX-I抗原在每个微孔板的反应孔中加0. lml，37°C干燥》i，4°C密封保存。2)洗板次日弃去孔内液体，在纸巾上轻轻扣打以吸去残留液体，加入由洗涤液配制的冲洗液(约^0-300ul/孔)，漂洗3次，每次;3min。洗涤液含0.05% Tween 20的PBS ILPBS 中力口人 Tween_20500y L。[0044]3)封闭按200-250ul/孔加入封闭液，封闭液10mM的PBS缓冲液含10A的BSA，37°C封闭 1-2小时，也可4°C封闭过夜，然后弃去孔内封闭液。二、制备一抗溶液1)抗体制备取健康雄性家兔，采用皮下注射方式，对家兔5-8处部位进行免疫接种，初次免疫注射lmg/mL浓度的CTX抗原0. 2mL,第3周、第4周及第5周注射lmg/mL浓度的CTX抗原与不完全弗氏佐剂等体积混合溶液0. 4mL。拉颈处死家兔，收集血液，2000r/min离心30min后取上清，加入1 %的BSA、0. 1 % 的Tween20和0. 0075%的Bronidox 5L做为防腐剂和稳定剂，4°C密封保存。抗体纯化用Buffer A (0. 05M 硼酸，4. OM NaCl，pH 9.0)平衡 rProtein A 亲和层析柱，加少量血清抗体，用BufferB (0. 05M磷酸钠，0. 05M柠檬酸钠，0. 3MNaCl，pH3. 0)洗脱，收集蛋白进行效价评定。抗体效价的测定制备的兔抗CTX抗体用ELISA法测定效价，以OD值P > 1. 0的稀释度作为效价， 抗体效价达1 10000。2) 一抗溶液制备取制备后的兔抗CTX抗体，用lOmmol/L的PBS缓冲液和25mol/L的EDTA混合，取 12mL分装，4 °C密封保存。兔抗CTX抗体的浓度为4. Oug/ml。三、过氧化物酶偶联抗体通用羊抗兔抗体冻干粉购自英国Abcam公司。取羊抗兔抗体冻干粉0. Ig,与IOmL 浓度为lOmmol/L的PBS缓冲液混合。取HRP (辣根过氧化物酶)固体用去离子水稀释为5mg/ mL，采用简易过碘酸钠法将HRP与羊抗兔抗体交联。取制备后的HRP-抗兔抗体，用IOmmol/ L的PBS缓冲液和25mol/L的EDTA混合，加入1 %的BSA,0. 1 %的Tween 20和0. 0075%的 Bronidox5L做为防腐剂和稳定剂，取12mL分装，4°C密封保存。酶标抗体最佳工作浓度为 1 3000。四、标准品与质控品的制备1)来源CTX尿液样本取自某认证医院健康人群，-20°C下保存。2) CTX样本制备取CTX尿液样本，2000r/min离心IOmin后取上清，与10mmol/L的PBS缓冲液等体积混合，并加入1 %的BSA和0. 018%的Bronidox 5L做为防腐剂和稳定剂，4°C密封保存。3)质控品制备从CTX尿液样本中取高值、低值样本，制备内部质控。8000r/min离心IOmin后取上清，与10mmol/L的PBS缓冲液等体积混合，并加入1 %的BSA和0. 018%的Bronidox 5L做为防腐剂和稳定剂，各取0. 5mL分装，4°C密封保存。低值内部质控通常约为1000-1300 μ g/ L,高值内部质控通常约为2200-3500 μ g/L。4)标准品制备标准品0取IlmL浓度10mmol/L的PBS缓冲液，加入1 %的BSA和0. 018 %的
5BronidOX5L做为防腐剂和稳定剂，4°C密封保存。标准品1-5取已配制的CTX样本混合溶液，分别用lOmmol/L的PBS缓冲液稀释至 CTX 浓度为 ΙΟΟμ g/L、300y g/L、850y g/L、2500y g/L 禾口 7500 μ g/L。各取 0. 3mL 分装，4°C
密封保存。底物溶液、终止液、冲洗液和封口膜等可以按照常规购买。实施例2 运用实施例1所述的检测试剂盒对样品进行检测使用前，将所有溶液平衡至室温。在18 22°C下进行实验。确定实验所需微孔板数量。另外，每轮实验共需要16孔用于标准品和质控。将适当数量的微孔板置于塑料框架上。将未使用的微孔板与干燥剂一起密封于锡箔袋中。1.加入标准、质控和待测样本移取15 μ 1标准品，质控或待测样本于微孔板中。2.微孔板孵育向各孔加入100 μ 1 —抗溶液。用封口膜密封微孔板，在18_22°C，以300rpm在微孔板振荡器上孵育60 士 5分钟。3.冲洗冲洗液50x以1体积浓缩缓冲溶液+50体积蒸馏水的比例稀释。用稀释的冲洗缓冲液手工清洗微孔板5次。用洗板机，请参照产品说明或实验室指南。通常清洗3-5次。确保每次手工或自动清洗后将微孔板中的溶液倒干净。4.与过氧化物酶偶联抗体孵育向各孔加入100 μ 1过氧化物酶偶联抗体。用封口膜密封微孔板，在18_22°C以 300rpm在振荡器上孵育60 士 5分钟。5.冲洗见第3步。6.与底物溶液孵育向各孔加入100微升底物溶液，用封口膜密封，18_22°C，在振荡器上(300rpm)避光孵育15士2分钟。不要直接从盛TMB底物的小瓶吸取，将所需体积的TMB移入干净容器中使用。容器中剩余的底物应予丢弃，不要倒回瓶中。7.终止显色反应向各孔加入100微升终止液。8.测定吸光度在2小时内以650nm为参照测定450nm下的吸光度。检测范围如果待测样本的吸光度低于标准品5，应该用标准品0稀释样本并重新分析。参考值(参考范围)建议实验室建立自己的正常值和病理值的范围。各类人群的平均值和标准差举例
如下。所有样本均采自第二次晨尿。
权利要求1.一种尿β-胶原降解产物检测试剂盒，包括盒体，盒体内主要有具有放置试剂瓶的下凹瓶位、位于下凹瓶位上的试剂瓶、以及置于塑料框架中的微孔板；其特征是，所述微孔板的微孔内包被有CTX-I抗原层，所述CTX-I抗原量为0. 54-0. 66 μ g ；所述试剂瓶包括有浓度为3. 8ug/ml-4. 2ug/ml的兔抗CTX抗体溶液的试剂瓶和装有过氧化物酶偶联羊抗兔抗体溶液的试剂瓶。
2.根据权利要求1所述的尿胶原降解产物检测试剂盒，其特征是，所述尿胶原降解产物检测试剂盒还包括有1瓶具有Ilml的CTX-I标准品的试剂瓶，5瓶分别具有 0. 3ml的CTX-I标准品的试剂瓶，2瓶分别具有0. 5ml的尿质控品的试剂瓶，1瓶具有12ml 的底物溶液的试剂瓶，1瓶具有12ml的终止液的试剂瓶和1瓶具有20ml冲洗液的试剂瓶。
3.根据权利要求1所述的尿胶原降解产物检测试剂盒，其特征是，所述尿胶原降解产物检测试剂盒还包括有用于检测时密封微孔板的封口膜。
专利摘要本实用新型公开了一种尿β-胶原降解产物检测试剂盒，包括盒体，盒体内主要有具有放置试剂瓶的下凹瓶位、位于下凹瓶位上的试剂瓶、以及置于塑料框架中的微孔板；所述微孔板的微孔内包被有CTX-I抗原层，所述包被的CTX-I抗原量为0.54-0.66μg；所述试剂瓶包括装有浓度为3.8ug/ml-4.2ug/ml的兔抗CTX抗体溶液的试剂瓶和装有过氧化物酶偶联羊抗兔抗体溶液的试剂瓶。所述尿β-胶原降解产物检测试剂盒具有特异性、灵敏度和精密度都非常好的优点。
文档编号G01N33/532GK201945594SQ20112004765
公开日2011年8月24日 申请日期2011年2月25日 优先权日2011年2月25日
发明者郭志程 申请人:广州固康生物科技有限公司