专利名称：牛奶中雌激素的定量检测方法
技术领域：
本发明涉及食品检验领域，具体地说，涉及牛奶中雌激素的定量检测方法。
背景技术：
近十年来 ，雌激素作为典型的内分泌干扰物受到广泛关注。类雌激素内分泌干扰物(EDCs)是一类能够与雌激素受体结合，干扰体内正常激素分泌，导致生殖细胞质量下降，以及三致(致癌、致畸、致突变)等严重危害的化合物。雌激素会导致人类内分泌失衡，尤其是低剂量长期暴露对特定人群(如胎儿、新生婴儿以及青春期前的儿童)产生了严重的影响，如性早熟、肥胖等已演变为社会问题。雌激素的另一大危害就是其致癌作用。国外流行病学调查显示近几十年睾丸癌、子宫癌等发病率呈逐年上升趋势，患癌人数增长与食物结构的改变尤其是肉、蛋、奶等动物产品的增加显著相关。鉴于动物源性食品中雌激素对人类健康的重要影响，有必要对牛奶中雌激素含量进行监控，以保护婴幼儿等易暴露人群的健康。建立牛奶中雌激素高灵敏度检测方法，对于食品中雌激素含量的本底调查和开展风险评估工作，具有重要意义。实现雌激素的科学风险评估，高灵敏度检测方法是关键。欧盟指令2003/74/EC[42]规定动物产品中类固醇激素检测方法必须足够灵敏，能够区分正常生理水平以及滥用和误用导致的激素超标现象。但动物产品中雌激素往往在PPt (ng/L)级，一般的化学检测方法难以达到。利用色谱与质谱联用技术为检测痕量激素水平提供了可能。但由于雌激素结构稳定以及非极性特征，难以离子化或离子化效率低是其检测难点。另外，雌激素的液相色谱-串联质谱检测都需要使用负离子检测模式，灵敏度很低。即使运用先进的LC-MSMS (AP15000)检测雌激素，灵敏度也只能达到O. I μ g/kg，难以满足动物产品中雌激素痕量检测的要求。提高检测灵敏度是牛奶中雌激素检测的关键。利用衍生试剂测定牛奶中的雌激素，可大大提高检测灵敏度，但由于衍生化造成额外基质干扰，导入钠、钾等金属离子，对质谱检测器危害严重。因此建立高效的样品提取方法，有效去除基质干扰成为亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的是针对牛奶样品基质复杂，正常情况下雌激素含量低，检测方法要求极闻等问题，提供一种闻灵敏度、闻精准度、在线快速提取样品的分析技术，实现对牛奶样品中痕量雌激素的定量快速自动化测定。为了实现本发明目的，本发明的一种牛奶中雌激素的定量检测方法，包括以下步骤1)对牛奶样品进行衍生化预处理；2)通过在线固相萃取-二维液相色谱串联质谱分析，测定牛奶样品中雌激素的含量。其中所述雌激素为雌酮、α -雌二醇、β -雌二醇和雌三醇中的一种或多种。优选地，步骤I)中所述衍生化为丹磺酰氯衍生化。具体操作为取3mL牛奶样品，加入3种氘标记的雌激素内标蜗旋混匀；样品加入30%的三氯乙酸IOOyL沉降蛋白；混匀后加入等体积混合的乙酸乙酯和正己烷溶剂8mL，震荡提取lOmin，10000转离心IOmin后，分离上层溶液用氮气吹干；重复提取样品2次，将氮气吹干的残渣用ImL乙腈溶解，50°C孵育5min后蜗旋混匀30s，-20°C冷冻30min ;然后样品于10000转离心5min，将上层溶液转移至另一试管中蒸干，加入150 μ L碳酸氢钠缓冲液蜗旋重新溶解样品，然后加入150 μ L丹磺酰氯丙酮溶液混匀，50°C衍生化5min，用O. 22 μ m微孔滤膜过滤样品，装入进样瓶中供下一步检测使用。在线固相萃取-二维液相色谱串联质谱分析包括将进样瓶中的样品上样，进行在线固相萃取和二维液相色谱串联质谱分析。在线固相萃取二维液相色谱 串联质谱系统搭建如图I所示。在线固相萃取二维液相色谱串联质谱(online SPE LC-MS/MS)包括了双色谱泵，交换阀以及在线富集柱。其中泵A用于样品在线净化，泵B用于样品色谱柱分离分析。样品首先通过富集柱洗脱杂质并保留目标化合物，然后运用柱交换技术进入分析柱进行测定，实现样品的半自动化提取。I.绘制标准曲线，基质添加内标法定量称取8份空白牛奶样品，每份3mL，分别添加相同浓度的3种氘标记的雌激素内标，内标的终浓度为50ng/L，依次添加不同浓度的雌激素标准品，使其终浓度分别为Ong/L、2. 0ng/L、5. Ong/LUO. 0ng/L、20. 0ng/L、40. 0ng/L、80. Ong/L 和 lOOng/L ;样品上样，进行在线固相萃取-二维液相色谱串联质谱分析；以添加样品中被测组分峰面积和内标物峰面积的比值为纵坐标，以标准溶液中被测组分浓度与内标物浓度的比值为横坐标绘制标准曲线.
-^4 ，II.牛奶样品中雌激素的定量将步骤I)预处理后的牛奶样品上样，进行在线固相萃取-二维液相色谱串联质谱分析，用标准曲线对样品进行定量，样品溶液中待测物的响应值均应在仪器测定的线性范围内。所述固相萃取采用的样品净化、洗脱条件(包括流速和梯度)见表I。表I固相萃取采用的洗脱条件
步骤总时间(min) 流速UL/min) 流动相A(%) 流动相B (% )
00.00500— 45.055.0'
12. 50500— 45.055.0'
22.60500I. O99.0'
34.00500I. O99.0'
44.20100— 45.055.0'
513.00100I 45.055.0其中流动相A :0. 1%甲酸水；流动相B :0. 1%甲酸甲醇。优选地，固相萃取使用的样品净化柱为strata-X on-lineSPEcartridge (Phenomenex 公司)。所述液相色谱分析条件(梯度洗脱步骤及流速)见表2。表2液相色谱分析条件(梯度洗脱步骤及流速)
权利要求
1.牛奶中雌激素的定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤 1)对牛奶样品进行衍生化预处理； 2)通过在线固相萃取-二维液相色谱串联质谱分析，测定牛奶样品中雌激素的含量。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述雌激素为雌酮、a-雌二醇、0 -雌二醇和雌三醇中的一种或多种。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤I)中所述衍生化为丹磺酰氯衍生化。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，丹磺酰氯衍生化具体方法为 取3mL牛奶样品，加入3种氘标记的雌激素内标蜗旋混匀；样品加入30%的三氯乙酸IOOii L沉降蛋白；混勻后加入等体积混合的乙酸乙酷和正己烧溶剂8mL,震荡提取IOmin,10000转离心IOmin后，分离上层溶液用氮气吹干；重复提取样品2次，将氮气吹干的残渣用ImL乙腈溶解，50°C孵育5min后蜗旋混匀30s，_20°C冷冻30min ;然后样品于10000转离心5min，将上层溶液转移至另一试管中蒸干，加入150 y L碳酸氢钠缓冲液蜗旋重新溶解样品，然后加入150 ii L丹磺酰氯丙酮溶液混勻，50°C衍生化5min,用0. 22 u m微孔滤膜过滤样品，供下一步检测使用。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤2)具体操作为 I.绘制标准曲线 称取8份空白牛奶样品，每份3mL，分别添加相同浓度的3种氘标记的雌激素内标，内标的终浓度为50ng/L，依次添加不同浓度的雌激素标准品，使其终浓度分别为0ng/L、2. Ong/L、5. Ong/LUO. 0ng/L、20. 0ng/L、40. 0ng/L、80. Ong/L 和 lOOng/L ;样品上样，进行在线固相萃取-二维液相色谱串联质谱分析；以添加样品中被测组分峰面积和内标物峰面积的比值为纵坐标，以标准溶液中被测组分浓度与内标物浓度的比值为横坐标绘制标准曲线； II.牛奶样品中雌激素的定量 将步骤I)预处理后的牛奶样品上样，进行在线固相萃取-二维液相色谱串联质谱分析，用标准曲线对样品进行定量，样品溶液中待测物的响应值均应在仪器测定的线性范围内。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，固相萃取采用的洗脱条件为 其中流动相A 0. 1%甲酸水；流动相B 0. I %甲酸甲醇。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，液相色谱分析条件为步骤~ 总时间(min)~ 流速(uL/min) |流动相C(%) |流动相D(%) ~OOOO450500500 ~I2 5045050 050 0 —I9 50450TETo85 0 ~10.004505 095 0 ~11.004505 095 0 ~511.5045050 050 0 ~613.0045050 050 0 其中流动相c :0. 1%甲酸水；流动相D :0. I %甲酸乙腈。
8.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，质谱分析条件为离子源电喷雾离子化源(ESI)，正离子方式检测；离子源电压+5500V ;温度500°C ;源内气体I (GS1，N2)压力65psi ;气体2(GS2，N2)压力55psi ;气帘气体(N2)压力15psi ;扫描方式为多反应离子监测(MRM);碰撞气(CAD, N2)压力5psi0
全文摘要
本发明提供了一种牛奶中雌激素的定量检测方法，包括步骤1)对牛奶样品进行衍生化预处理；及2)通过在线固相萃取-二维液相色谱串联质谱分析，测定牛奶样品中雌激素的含量。本发明采用样品衍生化测定，极大提高了检测灵敏度；采用二维液相色谱-串联质谱系统进行检测，实现样品的在线自动化净化，极大提高了样品的检测效率；且本发明的分析方法回收率好、自动化程度高、操作简单易行，能够快速同步分析样品中多种痕量雌激素的含量。
文档编号G01N30/88GK102636604SQ20121002891
公开日2012年8月15日 申请日期2012年2月9日 优先权日2012年2月9日
发明者方美英, 李思聪, 杜一楠, 米晓霞, 郑晓春, 陈刚 申请人:中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所