专利名称：一种琼脂扩散法检测鸭黄病毒抗体的方法
技术领域：
本发明涉及用一种琼脂扩散法检测鸭黄病毒抗体的方法，属于动物传染病和免疫学领域。
背景技术：
自2010年以来在华东地区首次发生鸭黄病毒感染蛋鸭引发的鸭产蛋下降-死亡综合症的流行，并迅速传播到浙江、安徽、福建、江苏等省份的主要养殖场，之后传播到广东、山东、河南、河北等省市，到目前为止全国大部分主要水禽养殖地区均已受到该病的威胁。鸭子感染该病毒后，主要的临床表现为病鸭出现高热、沉郁、厌食等；蛋鸭出现产蛋量急剧下降甚至停产；肉鸭出现生长迟缓。该病的发病率高达100%，死亡率在59TlO%之间。该病毒属于黄病毒科、黄病毒属的坦布苏病毒。·
该病在我国属于首次报道，其病原的生物学特性，分子流行病学和分子致病机理等方面的研究均刚刚起步，而该病近年来在我国水禽养殖区域的广泛流行以及其造成的巨大经济损失，现有研究进展亟须不断深入推进，针对养殖场及基层兽医检疫部门技术欠缺，设备简单的现状，创建一种简便有效的检测其抗体的方法十分必要且紧迫。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种琼扩法检测鸭黄病毒抗体的方法。本发明的鸭黄病毒为鸭黄病毒，由安徽农业大学动物传染病实验室分离。该病毒株已于2012年4月18日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址中国，武汉，武汉大学；其保藏名称为鸭黄病毒AH-FlO株，保藏编号为CCTCC NO: V201213。琼脂扩散法检测鸭黄病毒抗体的方法的步骤如下(I)无菌采集感染鸭黄病毒的病鸭卵巢病变组织，将其研磨匀浆后反复冻融三次，12000r/min离心IOmin ;无菌条件下取其上清液,将上清液经O. 22um微孔滤膜过滤除菌后接种10日龄SPF (即无特定病原体)鸡胚，O. 2mL/枚，于38°C孵化箱孵育，弃去24小时内接种死亡的鸡胚,收获48小时至120小时内死亡鸡胚尿囊液，连续传至5代，收获病毒尿囊液；将第5代黄病毒尿囊液经3%。甲醛混合摇匀，于37°C摇床内灭活36小时，得到鸭黄病毒琼扩抗原；(2)用pH值为7. 2，浓度为1/15M的PBS缓冲液配制1%琼脂糖凝胶，制备琼扩平板，琼脂糖凝胶厚度在4. 8mm 5. 2mm之间,用七孔梅花打孔器打孔；将制备的琼扩抗原加入中间孔，其加入量为每孔25微升；将待检测的琼扩抗体按2倍稀释后的浓度依次加入周围六孔，即加入六孔的琼扩抗体的浓度分别是原琼扩抗体浓度的2—1，2_2，2_3，2_4，2_5，2_6 ;将琼扩平板于37°C湿盒中反应15小时后观察，读取琼扩效价。与已有技术相比，本发明有益效果体现在本发明建立了琼扩方法检验抗体的效价，检验结果重复性好，快速准确。确定了琼脂糖凝胶缓冲液的较好的类型及浓度。
图I是鸭血清抗体效价为I : 4时的琼扩结果图2是鸭血清抗体效价为I : 16时的琼扩结果
具体实施例方式以下通过具体实施例对本 发明技术方案做进一步解释说明。实施例I从安徽区域感染鸭黄病毒的病鸭中无菌条件下采集其卵巢等病变组织，将其研磨勻衆后反复冻融三次，12000r/min离心lOmin。无菌条件下取其上清液,将上清液经O. 22um微孔滤膜过滤除菌后接种10日龄SPF鸡胚，O. 2mL/枚，于38°C孵化箱孵育，弃去24小时内接种死亡的鸡胚,收获48小时至120小时内死亡鸡胚的尿囊液，将收获的一代病毒尿囊液接种10日龄SPF鸡胚，O. 2mL/枚，于38°C孵化箱孵育。收获48小时至120小时内死亡鸡胚的尿囊液，获取第二代病毒尿囊液，如此连续传至5代，收获尿囊液备用。在收获的第5代病毒尿囊液中按体积比加入3%。甲醛于37°C摇床灭活36小时，灭活完成后，按灭活病毒液96份，吐温-804份摇匀，即为制苗用抗原做为下步乳化的水相；白油佐剂做为下步乳化油相。按体积比油相3份、水相I份的比例取油相、水相搅拌乳化，制备成鸭黄病毒灭活油乳剂疫苗，并加入1%硫柳汞溶液使之终浓度为万分之一，摇匀备用。琼扩最适条件的确定使用制备的鸭黄病毒灭活疫苗胸部肌肉注射免疫产蛋蛋鸭，免疫剂量为ImL/只，三周后同样途径及方法进行第二次免疫，第二次免疫两周后对蛋鸭采血，提取血清，作为琼扩抗体。将第5代黄病毒尿囊液经3%。甲醛混合摇匀，于37°C摇床内灭活36小时，制备鸭黄病毒琼扩抗原。选用PBS缓冲液(即含O. 05%吐温一 20的ρΗ7· 4的磷酸盐缓冲液)，PB缓冲液(PB缓冲液的配制取 19ml O. 2mol/L 的 NaH2P04 和 81ml O. 2mol/L 的 Na2HP04 · 12H20,充分混合即为O. 2mol/L的PB缓冲液。)及质量浓度O. 85%的生理盐水三种缓冲液，在不同pH值的条件下；PB及PBS缓冲液的不同浓度，同份抗体的琼扩效价比较，筛选反应较好的缓冲液及pH值,结果见表一表一
缓冲液配置的溶液PH__PB和PBS的浓度
琼脂糖凝胶 6 8 I U 7.2 7.4 1/15M 1/10M I/ -jM
0.85%生理盐水 1:8 1:8 1:16 1:8---
PBS 缓冲液 1:16 1:16 1:32 1:16 1:32 1:16 1:16
PB 缓冲液 1:81:16 1:8 I Ib I 8 1:8由结果可知在pH值为7. 2，，浓度为1/15M的PBS缓冲液配制的1%琼脂糖凝胶具有较好的琼扩反应效果。实施例2对安徽多家蛋鸭场送检60份至少连续免疫两次的黄病毒灭活疫苗(相邻两次免疫时间间隔为15天左右)的鸭血清进行琼扩法检验其抗体。用浓度为1/15M的PBS缓冲液配制的1%琼脂糖凝胶，制备琼扩平板，琼脂糖凝胶厚度在4. 8mm 5. 2mm之间，用七孔梅花打孔器打孔 。将制备的琼扩抗原加入中间孔，琼扩抗体按2倍稀释后的浓度依次加入周围六孔(琼扩抗体的浓度分别是2—1，2_2，2_3，2_4，2_5，2_6)。抗原抗体加入量约为每孔25微升。将琼扩平板于37°C湿盒中反应15小时后观察，读取琼扩效价(如图I、图2所示)。琼扩效价统计见表二 表二
权利要求
1.一种琼脂扩散法检测鸭黄病毒抗体的方法，其特征在于该方法包括如下步骤 (1)无菌采集感染鸭黄病毒的病鸭卵巢病变组织，将其研磨匀浆后反复冻融三次，12000r/min离心IOmin ;无菌条件下取其上清液,将上清液经O. 22um微孔滤膜过滤除菌后接种10日龄SPF (即无特定病原体)鸡胚，O. 2mL/枚，于38°C孵化箱孵育，弃去24小时内接种死亡的鸡胚,收获48小时至120小时内死亡鸡胚尿囊液，连续传至5代，收获病毒尿囊液；将第5代黄病毒尿囊液经3%。甲醛混合摇匀，于37°C摇床内灭活36小时，得到鸭黄病毒琼扩抗原； (2)用pH值为7.2，浓度为1/15M的PBS缓冲液配制1%琼脂糖凝胶，制备琼扩平板，琼脂糖凝胶厚度在4. 8mm 5. 2mm之间，用七孔梅花打孔器打孔；将制备的琼扩抗原加入中间孔，其加入量为每孔25微升；将待检测的琼扩抗体按2倍稀释后的浓度依次加入周围六孔，即加入六孔的琼扩抗体的浓度分别是原琼扩抗体浓度的2—1，2_2，2_3，2_4，2_5，2_6 ;将琼扩平板于37°C湿盒中反应15小时后观察，读取琼扩效价。
全文摘要
本发明提供了一种琼脂扩散法检测鸭黄病毒抗体的方法，属于兽医传染病学和免疫学领域。所检测的鸭黄病毒为安徽某鸭场分离株，将病料接种SPF鸡胚，传至5代，获得稳定毒株，命名为鸭黄病毒AH-F10株。尿囊液经甲醛灭活加入白油佐剂乳化，制备灭活疫苗，连续两次免疫产蛋鸭获取鸭黄病毒阳性血清。该阳性血清与经甲醛灭活的鸭黄病毒液进行琼扩反应，可呈现清晰的沉淀带。通过不同缓冲液及缓冲液不同浓度对阳性血清琼扩效价的影响，确定该琼扩反应最适的缓冲液及缓冲液浓度。该方法可较为简便的诊断目前我国流行的鸭黄病毒病，做为流行病学调查的操作简便，效果明显，成本低廉的检测方法。
文档编号G01N33/559GK102914647SQ20121017172
公开日2013年2月6日 申请日期2012年5月29日 优先权日2012年5月29日
发明者王桂军, 王汉清, 张洪辉, 刘雪兰, 李槿年, 李郁, 魏建忠, 杨德康, 倪欣涛, 李宁 申请人:安徽农业大学