专利名称：用于新生儿胆道闭锁的诊断标记物的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体地说，是用于诊断新生儿胆道闭锁，区分胆道闭锁和其它婴儿胆汁淤积疾病(包括婴儿肝炎综合征、巨细胞病毒性肝炎和胆总管囊肿)的诊断标记物的应用。
背景技术：
胆道闭锁(Biliary atresia，BA)是一种破坏性的新生儿胆管炎症纤维阻塞，影响着不同长度的肝内和肝外胆管，是新生儿阻塞性黄疸最主要原因，也是小儿肝移植最主要 原因，40-50% JL童肝移植是由此引起的。肝门空肠吻合术(Kasai根治术)是胆道闭锁的首选治疗方案。手术时间对于Kasai手术的疗效有很大影响。研究发现,在出生后60天内进行Kasai手术,其术后黄疸消失率和五年的自体肝生存率显著升高，对肝移植的需求显著降低。由于缺乏有效的诊断标记物，患儿通常需要经过长时间的复杂诊断才能确诊，延误了最佳手术时间。不明原因的婴儿肝炎综合征是干扰胆道闭锁确诊的主要疾病。巨细胞病毒感染在胆道闭锁患儿中普遍存在，导致直接胆红素升高的巨细胞病毒性肝炎也是胆道闭锁诊断的干扰因素。胆道闭锁患儿需要尽早诊断，与婴儿肝炎综合征和病毒性肝炎区分。临床研究发现，胆道闭锁的血清总胆汁酸含量升高，但是该指标不能将胆道闭锁和其他的婴儿胆汁淤积疾病以及病毒性肝炎区分。最近的出版物公开了血清蛋白AP0C2作为胆道闭锁的诊断标记物，区分胆道闭锁和婴儿肝炎综合征(H. Wang等，2010，J PediatrGastroenterol Nutr. , 50 (4):411-6 ； Z. Song 等，2012, J Pediatr GastroenterolNutr.)。迄今为止的报道证明了用于区分胆道闭锁诊断和婴儿肝炎综合征的诊断标记物的重要。中国专利文献CN101221129B公开了磺酸化胆汁酸酶荧光毛细分析法及酶荧光定量试剂盒，适用于肝胆疾病的快速筛查和诊断，尤其适用于新生儿期黄疸、先天性胆道闭锁症的早期发现。但是关于用于新生儿胆道闭锁的诊断标记物目前还未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供血清牛磺鹅去氧胆酸和鹅去氧胆酸作为诊断标记物在制备诊断新生儿胆道闭锁的医疗器械中的应用。本发明的再一的目的是，提供血清鹅去氧胆酸作为诊断标记物在制备诊断新生儿胆道闭锁的医疗器械中的应用。为实现上述目的，本发明采取的技术方案是血清牛磺鹅去氧胆酸和鹅去氧胆酸作为诊断标记物在制备诊断新生儿胆道闭锁的医疗器械中的应用，所述的医疗器械的诊断标记物为血清中牛磺鹅去氧胆酸和鹅去氧胆酸的含量比值。所述的医疗器械的诊断闕值是血清中牛磺鹅去氧胆酸和鹅去氧胆酸的含量比值1610，当牛磺鹅去氧胆酸和鹅去氧胆酸的含量比值大于1610时，诊断为新生儿胆道闭锁。
所述的医疗器械是诊断试纸或试剂盒，所述的医疗器械的诊断样品是血清。为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是血清鹅去氧胆酸作为诊断标记物在制备诊断新生儿胆道闭锁的医 疗器械中的应用，所述的医疗器械的诊断标记物为血清中鹅去氧胆酸的含量。所述的医疗器械的诊断闕值是血清中鹅去氧胆酸的含量O. 024 μ mol/L,当血清中鹅去氧胆酸的含量小于O. 024 μ mol/L时，诊断为新生儿胆道闭锁。所述的医疗器械是诊断试纸或试剂盒，所述的医疗器械的诊断样品是血清。本发明优点在于
首次提出牛磺鹅去氧胆酸和鹅去氧胆酸作为胆道闭锁诊断标记物的应用，可用于区分胆道闭锁和其它婴儿胆汁淤积疾病，为患儿争取最佳手术时间，提高手术疗效。
附图I是血清胆汁酸检测总离子流图。A为标准品检测的总离子流图；B为胆道闭锁患儿血清胆汁酸检测的总离子流图。附图2是牛磺鹅去氧胆酸/鹅去氧胆酸(T⑶C/⑶C)在胆道闭锁、其它婴儿胆汁淤积疾病、高胆红素血症和正常婴儿血清中含量。附图3是鹅去氧胆酸(⑶C)在胆道闭锁、其它婴儿胆汁淤积疾病，高胆红素血症和正常婴儿血清中含量。
具体实施例方式下面结合附图对本发明提供的具体实施方式
作详细说明。实施例I
本发明涉及用于诊断新生儿胆道闭锁，以及区分胆道闭锁和其它婴儿胆汁淤积疾病(包括婴儿肝炎综合征、巨细胞病毒性肝炎和胆总管囊肿)的诊断标记物。人体血液中的主要胆汁酸包括胆酸、甘氨胆酸、牛磺胆酸、鹅去氧胆酸、甘氨鹅去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、脱氧胆酸、甘氨脱氧胆酸、牛磺脱氧胆酸、熊去氧胆酸、甘氨熊去氧胆酸、牛磺熊去氧胆酸、石胆酸、甘氨石胆酸、牛磺石胆酸。通过胆道闭锁、婴儿肝炎综合征、巨细胞病毒性肝炎和胆总管囊肿中14种主要胆汁酸(胆酸、甘氨胆酸、牛磺胆酸、鹅去氧胆酸、甘氨鹅去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、脱氧胆酸、甘氨脱氧胆酸、牛磺脱氧胆酸、熊去氧胆酸、甘氨熊去氧胆酸、牛磺熊去氧胆酸、石胆酸和牛磺石胆酸)丰度和相互关系的比较分析，与婴儿肝炎综合征、巨细胞病毒性肝炎和胆总管囊肿比较的特征性丰度和特征性关系，即是胆道闭锁的重要指标，可用作胆道闭锁的诊断标记物。为了鉴定这些胆汁酸的差异，血清样品来自胆道闭锁婴儿术前血21例，其它婴儿胆汁淤积(包括婴儿肝炎综合征11例、巨细胞病毒性肝炎8例、和胆总管囊肿2例)，高胆红素血症16例和正常对照21例。甲醇沉淀后的血清样品通过高效液相色谱-串联质谱定量检测，定量了每种胆汁酸的丰度。有些胆汁酸在胆道闭锁中含量更高，而有些以明显较低的丰度存在。一、材料和方法
I.血清样品采集和处理收集Iml新鲜血样于无抗凝剂的采血管中，室温静置2小时后，3000rpm离心10分钟后，取上层血清。取50 μ I血清样品，加入含O. 25 μ M的甲醇150 μ 1，剧烈震荡5分钟，然后16000g离心15分钟，取上清。2.标准品
活性碳脱盐的血清样品作为溶剂，加入不同浓度的胆汁酸标准品制作标准曲线，各胆汁酸(胆酸、甘氨胆酸、牛磺胆酸、鹅去氧胆酸、甘氨鹅去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、脱氧胆酸、甘氨脱氧胆酸、牛磺脱氧胆酸、熊去氧胆酸、甘氨熊去氧胆酸、牛磺熊去氧胆酸、石胆酸和牛磺石胆酸)的浓度分别为5ηΜ、10ηΜ、20ηΜ、40ηΜ、100ηΜ、400ηΜ、2μΜ、10μΜ 和 50 μ Μ。3.高效液相色谱-串联质谱分析
如表I所示，设定串联质谱的检测模式，高效液相色谱的程序如表2所示，进行质谱分 析。上样量为10μ1。色谱柱采用Luna C18 column (50X2.0mm,粒径3μηι);流动相A为O. 012%蚁酸，5mM乙酸铵溶于水；流动相B为O. 012%蚁酸，5mM乙酸铵溶于97:3的乙腈/水溶液。表I :胆汁酸质谱检测参数
权利要求
1.血清牛磺鹅去氧胆酸和鹅去氧胆酸作为诊断标记物在制备诊断新生儿胆道闭锁的医疗器械中的应用，所述的医疗器械的诊断标记物为血清中牛磺鹅去氧胆酸和鹅去氧胆酸的含量比值。
2.根据权利要求I所述的应用，其特征在于，所述的医疗器械的诊断闕值是血清中牛磺鹅去氧胆酸和鹅去氧胆酸的含量比值1610，当牛磺鹅去氧胆酸和鹅去氧胆酸的含量比值大于1610时，诊断为新生儿胆道闭锁。
3.根据权利要求I所述的应用，其特征在于，所述的医疗器械是诊断试纸或试剂盒，所述的医疗器械的诊断样品是血清。
4.血清鹅去氧胆酸作为诊断标记物在制备诊断新生儿胆道闭锁的医疗器械中的应用，所述的医疗器械的诊断标记物为血清中鹅去氧胆酸的含量。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的医疗器械的诊断闕值是血清中鹅去氧胆酸的含量O. 024 μ mol/L,当血清中鹅去氧胆酸的含量小于O. 024 μ mol/L时，诊断为新生儿胆道闭锁。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的医疗器械是诊断试纸或试剂盒，所述的医疗器械的诊断样品是血清。
全文摘要
本发明涉及血清牛磺鹅去氧胆酸和鹅去氧胆酸作为诊断标记物在制备诊断新生儿胆道闭锁的医疗器械中的应用，所述的医疗器械的诊断标记物为血清中牛磺鹅去氧胆酸和鹅去氧胆酸的含量比值。本发明还提供鹅去氧胆酸的应用。本发明优点在于首次提出牛磺鹅去氧胆酸和鹅去氧胆酸作为胆道闭锁诊断标记物的应用，可用于区分胆道闭锁和其它婴儿胆汁淤积疾病，为患儿争取最佳手术时间，提高手术疗效。
文档编号G01N30/02GK102818866SQ201210273918
公开日2012年12月12日 申请日期2012年8月3日 优先权日2012年8月3日
发明者周科军, 蔡威, 琳娜, 顾学范, 陈颖伟 申请人:上海交通大学医学院附属新华医院