磺酸化胆汁酸酶荧光毛细分析法及酶荧光定量试剂盒的制作方法

专利名称：：磺酸化胆汁酸酶荧光毛细分析法及酶荧光定量试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及磺酸化胆汁酸酶荧光毛细分析法及实现该方法的SBA酶荧光定量试剂盒，属于临床生化分析领域。本发明适用于健康人群肝胆系统的普査、临床患者肝胆疾病的快速筛查和诊断，尤其适用于新生儿期黄疸、先天性胆道闭锁症和肝炎的早期发现。
背景技术：
：胆汁酸在肝脏合成，正常情况下99。/。存在于肠肝循环内，进入体循环的量极少。但是肝胆有疾病受损伤时，胆汁酸逆流入血，导致血中胆汁酸显著增加。作为体内的解毒机制，血中的胆汁酸发生磺酸化，使其水溶性增加，容易通过尿排出体外，使尿中的磺酸化胆汁酸(SBA)与血中SBA变得容易测定。因此，可以根据尿中SBA含量的大小诊断肝胆系统机能是否正常。在临床检査中，发现SBA的测定与谷草转氨酶(GOT)、谷丙转氨酶(GPT)、谷氨酰转肽酶CrGTP)、总胆汁酸(TBA)等血液化学检査方法有同等诊断效率(肝胆薛，1995，31,315;Jpn.J.Clin.Chem.1997，26，95;J.Pediatr.Surgery,2002,37,1707;Pediatr.Int,2003,45.281)，并且更具有特异性和灵敏性，是肝胆机能的重要指标。目前，在日本，尿中SBA测定己成为判断肝胆系统机能和诊断肝硬化、肝癌等疾病的一项新指标，成为"日本国民健康保险"体检的检査项目(检査编码0715儿童，6208成人，SBA试剂盒法承认番号20800AMZ10064000)。尿中SBA含量的指标基准值新生儿出生后24周内，其尿中SBA的正常值为S5|amol/L、或SBAS55nmol/g'CRE(CRE:肌酐校正)；成人尿中SBA的JH常值为^10nmol/L或SBA^8nmol/g'CRE。在国外，SBA的测定也有气相色谱(Lipids.1973,8，47)和高效液相色谱法(Lipids,1978,13,908;J.Chromatogr.1987,415,45)。用这些方法测定SBA时，试样要进行抽提、溶剂分解、衍生物化等繁杂的预处理过程，非常费时、复杂，很难真正应用到日常的临床诊断和检验中。近年来，也报道了一些其它方法，如利用甲基吩嗪硫酸二甲脂异鲁米诺-过氧化物酶化学反应体系用于血清中总胆汁酸的测定，利用SBA磺酸酯酶(BSS)水解SBA建立的酶比色测定法(Jpn.J.Clin.Chem.,1992，21,249)。后一种方法是一个先进的SBA测定法。其原理是SBA在BSS作用下水解成p-羟胆汁酸，在3(3-羟基类固醇脱氢酶(3p-HSD)存在下与氧化型辅酶耶-NAD+)作用，生成NADH和3-酮胆汁酸，NADH与硝基四唑蓝(NTB)显色试剂反应，生成有色的甲臢，通过比色来定量SBA。但是，由于在反应体系中使用了NTB作显色试剂，其反应产物易沉淀，比色皿易发生吸附、着色，测定结果难以达到准确、快速、简便的临床检查要求。在此基础上，将显色试剂NTB换成水溶性的WST-1(円本特许平7-33336)，使比色皿吸附着色，空白信号不稳定的情况有所改善。现有的SBA酶比色测定法存在的主要问题是使用的酶和试剂种类太多(BSS、P-HSD、3-酮胆汁酸-厶4-脱氢酶、心肌黄酶、P-NAD、WST-1，ASOD，Tween20，山梨醇，4-羟乙基哌嗪乙磺酸HEPES)、酶耗量大，成本高，灵敏度较低，所用的贵重试剂只能一次性使用；而且反应产物甲臢类，也不完全溶于7jC，定量比feniH顿后也M不同禾體的淑!J^染，如果再利用，必须反复多次冼净'劍于自动分MB的卿来说條是一个鹏。
发明内容本发明的目的是为了解决现有技术存在的问题，减少酶和试剂的种类和耗量，降低成本，提高灵敏度，消除试剂和;^^WI!淀系统的吸附、着色，实现贵重酶和试剂的重复多次使用，减少临床生化分析废液量，利于环境保护，实现微量样品的微量分析；在此基础上，开发一种新的SBA酶荧光毛细分析法及实现该方法的SBA酶荧光定量试剂盒(SBA-FCA-Kit)，实现快速、简便的SBA测定，用于肝胆系统疾病的快速筛查与诊断。本发明的技术方案是由测定原理和测定方法及SBA-FCA-Kit组成。本发明的测定原理SBA在BSS催化作用下水解脱磺酸基，生成3卩-羟胆汁酸；后者在卩-HSD催化作用下与卩-NAD+反应转化为3-酮胆汁酸，同时卩-NAD+被还原成NADH;通过检测NADH的特征荧光强度来定量SBA;或者为了达到循环增敏目的，再使NADH与氧化型电子传递体反应，生成NAD+和还原型电子传递体，后者与刃天青(7-羟基吩噁嗪酮)反应生成具有强烈荧光的试卤灵(3,7-二羟基吩噁嗪)，通过试卤灵的荧光强度来定量SBA。本发明的测定方法先将一个代替常规荧光试液槽的专用毛细管定位座(见专利200510021542.8)置于荧光光度计光路中；适量生物样品与荧光反应液混匀后，在适当温度下反应一定时间，用一个固定有BSS和p-HSD的SBA-CBR，利用毛细现象吸入上述反应混合液，然后插入荧光光度计的毛细管定位座插孔中，在给定的激发波长和发射波长条件下，立即测定SBA-CBR内所含反应混合液的荧光强度，此值作为试剂和样品的空白值(F》；然后使其继续反应数分钟后，再测其荧光强度(F2);此值减掉空白值(AF-F2-FD，得到的吸光度增加值(AF)用于定量样品中的SBA值。毛细管做为荧光反应、测定或酶固定化的载体。本发明的各种特征如下本发明用于实现SBA酶荧光毛细分析法的SBA-FCA-Kit试剂盒的示意图如图1所示。它包括一根SBA-CBR和一种荧光反应液、或两根SBA-CBR。使用时，用SBA-CBR和一个毛细管定位座替代常规荧光分析中的试液槽，将其置于荧光分析仪光路中。本发明包含的荧光反应液可以只含有P-NAD+的试剂，也可以含有卩-NAD+、电子传递体、刃天青等。本发明可以将所用的酶固定化，成为SBA固定化酶荧光定量试剂盒(正-SBA-FCA-Kit);也可以使酶不固定化，成为SBA液态酶荧光定量试剂盒(LE-SBA-FCA-Kit);IE-SBA-FCA-Kit可以根据用途变成高灵敏固定化酶荧光定量试剂盒(HIE-SBA-FCA-Kit)和低灵敏固定化酶荧光定量试剂盒(L正-SBA-FCA-Kit)。同样，LE-SBA-FCA-Kit也可以根据用途变成高灵敏液态酶荧光定量试剂盒(HLE-SBA-FCA-Kit)和低灵敏液态酶荧光定量试剂盒(LLE-SBA-FCA-Kit)。本发明包含的IE-SBA-FCA-Kit主要由一根SBA-CBR和一种荧光反应液、或两根SBA-CBR组成。本发明包含的HIE-SBA-FCA-Kit，其特征是BSS和3(3-HSD同时固定化在一根SBA-CBR内表面，荧光反应液含有P-NAD+、电子传递体和刃天青等混合试剂；如果在一根SBA-CBR内表面单独固定BSS，将p-HSD加入荧光反应液内而形成的定量试剂盒也属于此范畴。本发明包含的LIE-SBA-FCA-Kit的特征是BSS和(3-HSD同时固定化在一根SBA-CBR内表面，但荧光反应液中只含有卩-NAD'试剂，通过测定NADH的荧光强度来定量SBA。本发明也可以将荧光反应液固定化在毛细管内，由两根SBA-CBR组成SBA固定化酶荧光定量双毛细管试剂盒(正-SBA-FCA-2C-Kit)。其特征是由SBA-CBR-1和SBA-CBR-2组成。SBA-CBR-1内表面同时固定有(3-HSD、卩-NAD+、电子传递体和刃天青，SBA-CBR-2内表面固定有BSS、P-HSD、卩-NAD+、电子传递体和刃天青，用于高灵敏SBA测定。进一步，SBA-CBR-1内表面也可以同时固定p-HSD和p-NAD+，SBA-CBR-2内表面同时固定有BSS、P-HSD、卩-NAD+，用于低灵敏SBA测定。本发明包含的LE-SBA-FCA-Kit主要由1号液、2号液、定量毛细管构成。本发明包含的HLE-SBA-FCA-Kit的特征是1号液含有p-HSD和荧光反应液，2号液含有BSS、卩-HSD和荧光反应液。本发明包含的LLE-SBA-FCA-Kit的特征是1号液含有P-HSD、卩-NAD+，2号液含有BSS、p-HSD、p-NAD+。本发明包含的LE-SBA-FCA-Kit测定SBA的过程是，在一个空白管和一个测定管内先加入等量的被测样品，再分别将1号液加入空白管内，将2号液加入测定管内；反应一定时间后，依次将上述两管中的反应混合液吸入定量毛细管内，插入荧光光度计的毛细管定位座中，在给定的激发波长和发射波长条件下，测定毛细管内所含反应混合液的荧光强度；根据空白管(FD和测定管(F2)的荧光强度差值(M^F2-F。定量样品中的SBA值。毛细管在此做为样品定量、酶荧光反应混合液测定的载体。本发明所述的电子传递体可以从l-甲氧基-5-甲基吩嗪-二甲酯硫酸盐(l-MPMS)、或心肌黄酶、或麦尔多拉蓝等电子传递体类中选1种。本发明的试剂盒可用于已商品化的荧光光度计或自动临床荧光生化分析装置，实施SBA的测定及研究。本发明包含的SBA-CBR的制备方法有三个步骤毛细管的氨基化修饰、毛细管中酶的固定化和毛细管化学修饰基团的封闭。毛细管的氨基化修饰先用0.050.5mol/LNaOH溶液将毛细管浸泡12h，用超纯水清洗，再用5075%的乙醇溶液浸泡12h，最后用超纯水清洗、吹干。然后，将前处理后的毛细管放入0.12。/。(v/v)作为偶联剂的3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)溶液(以正己垸为溶剂)，在4065。C反应46h，使ATPES共价结合在毛细管内壁上；最后用无水乙醇将毛细管洗净，吹干；最后，将2.5。/。(v/v)戊二醛试剂吸入毛细管内，在真空状态下6(TC放置12h，使戊二醛共价结合在ATPES上。毛细管中酶及试剂的固定化用磷酸缓冲液(pH7.5)洗掉毛细管中未结合的戊二醛之后，用毛细管吸入由磷酸缓冲液配制的11OkU/LBSS和p-HSD溶液，在4°C下旋转固定612h，使BSS和P-HSD的氨基与戊二醛的醛基共价结合，最后用磷酸盐缓冲溶液清洗干净。毛细管化学修饰基团的封闭再将固定有BSS、卩-HSD的毛细管浸泡在l5。/。(w/v)牛血清白蛋白中l2h，封闭未结合的醛基，制成SBA-CBR;最后，将SBA-CBR保存在4°C的磷酸盐缓冲液中(pH7.5)。本发明的基本技术参数为SBA的测定范围在0.1-50|amol/L，检出限为0.06|amol/L，相对标准偏差<3.0%，Tris-HCl缓冲液浓度0.050.5mol/L，pH6.59.0，p-NAD+浓度50-80(Vmol/L,BSS和3p-HSD固定化酶的浓度均为210kU/L;酶催化反应时间520min，反应温度204(TC。l-MPMS浓度105(Vmol/L，刃天青浓度105Opmol/L;总反应液用量520nL;样品用量l20|aL;SBA-CBR的长度为35cm，容量为220pL，内径为0.140.90mm，外径为0.551.20mm，壁厚为0.100.25mm;其材质可以是石英玻璃、光学玻璃或透明光学塑料。本发明使用的酶类BSS和P-HSD是己知物质，由生物提取而来。BSS可以按文献(Biosci.Biotech.Biochem.，1994，58，889)所述的方法精制而得；|3-HSD、P-NAD+、心肌黄酶、l-MPMS、麦尔多拉蓝可以使用市面销售的产品，如SigmaChemicalCo.的制品。本发明的优点和积极效果是显著降低了贵重酶制剂、化学试剂和被测液用量，减少废液，提高灵敏度，实现不连续的批量临床样品快速测定。a)用SBA-CBR代替常规的荧光试液槽，实现酶荧光毛细分析法；实现微量样品的微量分析；b)酶在SBA-CBR中固定化后可以重复使用多次，克服了液态酶容易变性和不稳定的弱点，能节约大量的酶、辅酶及其它贵重酶试剂，显著降低了实验成本和化学分析废液向环境中的排放量，有利于推广利用；c)基于酶荧光毛细分析法制成的SBA酶荧光定量试剂盒，便于携带、保存；具有较好的长期稳定性、不易变性失活等良好的理化特性；d)本发明无需对样品进行前处理，可以直接测定，操作简便；e)本发明使用试剂种类少，操作耗时短，适合于不连续的批量临床样品中SBA快速测定；f)本发明可成为国家标准中有关临床检验的一个新方法；g)SBA酶荧光定量试剂盒可用于已商品化的荧光光度计或自动临床荧光生化分析装置，实施SBA的测定及研究。本发明可用于尿中SBA的测定，无需采血就能实现肝机能检查；也可用于血中SBA的测定。本发明适用于临床检査中对肝胆系统疾病的快速筛查和诊断，尤其适用于对新生儿期及幼儿期黄疸、先天性胆道闭锁症和肝炎的早期发现，这对保护人类健康具有很重要的实用意义和社会意义。图lSBA实现酶荧光毛细分析法的SBA酶荧光定量试剂盒的示意中S样品、1荧光反应液(电子传递体、刃天青、卩-NAD+等)、2SBA-CBR、3毛细管、43-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)、5戊二醛、6磺酸化胆汁酸磺酸酯酶(BSS)、7|3-羟基类固醇脱氢酶((3-HSD)、8反应混合液图2实施例1考察SBA-CBR中BSS固定化浓度对荧光强度影响的曲线3实施例1考察SBA-CBR中p-HSD用量对荧光强度影响的曲线4实施例1考察p-NAD+浓度对荧光强度影响的曲线5实施例1考察l-MPMS浓度对荧光强度影响的曲线6实施例1考察SBA-CBR中刃天青浓度对荧光强度影响的曲线7实施例1考察反应体系pH对荧光强度影响的曲线8实施例1考察Tris-HCl缓冲液浓度对炎光强度影响的曲线9实施例1考察反应温度影响SBA-CBR荧光强度的曲线10实施例1考察反应时间对荧光强度影响的曲线11实施例1考察本发明SBA-CBR日内稳定性的曲线12实施例1考察本发明SBA-CBR日间稳定性的曲线13实施例1考察尿样空白反应时间对SBA-CBR影响的曲线14实施例1用本发明正-SBA-FCA-Kit测定SBA标准得到的曲线15实施例1考察本发明HIE-SBA-FCA-Kit和HLE-SBA-FCA-Kit的灵敏度曲线16实施例1用本发明L正-SBA-FCA法测定SBA标准得到的标准曲线的曲线图实施例结合附图对本发明的实施例作进一步描述实施例1本实施例是考察SBA-CBR(2)中固定化BSS(6)浓度对荧光强度的影响。实验条件激发波长540nm，发射波长580nm，反应液用量18pL，500nmol/L(3-NAD+，5Ojxmol/Ll-MPMS，50[imol/L刃天青，5kU/L卩-HSD(7)，pH8.0，反应温度37°C，反应时间10min;在l-10kU/L范围内改变BSS(6)浓度，分别用1.Opmol/L、2.0nmol/L的GLCA-S标准液作为测定样品，优选了SBA-CBR中固定化BSS(6)浓度，结果见图2。BSS(6)用量为5kU/L时产物的荧光强度达到最大。实施例2本实施例是考察SBA-CBR(2)中P-HSD(7)用量对荧光强度的影响。基于以上条件，BSS(6)用量为5kU/L,在l-10kU/L范围内改变p-HSD(7)浓度，考察其对灵敏度的影响。结果见图3。(3-HSD(7)在l-5kU/L范围内，荧光强度逐渐增强；当(3-HSD(7)用量为5kU/L时，荧光强度达到最人。实施例3本实施例是考察p-NAD+浓度对荧光强度的影响。p-HSD(7)用量为5.0kU/L，其他实验条件同实施例2。在50-800fimol/L范围内改变卩-NAD+浓度，考察p-NAD+浓度对本方法灵敏度的影响。得到的结果如图4所示。(3-NAD+在50-400pmol/L范围内，反应体系的荧光强度随之逐渐增加，在400|amol/L时荧光强度达到最大值；当p-NAD+浓度高于400|imol/L时，荧光强度反而减小。实施例4本实施例是考察l-MPMS浓度对荧光强度的影响。p-NAD+浓度用量为400pmol/L、其它实验条件同实施例3。改变l-MPMS浓度(5、10、25、50、100pmol/L)，考察l-MPMS浓度对SBA-IE-FCA反应体系灵敏度的影响。结果如图5所示。荧光强度随l-MPMS浓度增加而增强，当浓度超过25pmol/L,其荧光强度降低；故最佳l-MPMS浓度为25tunol/L。实施例5本实施例是考察刃天青浓度对荧光强度的影响。固定l-MPMS浓度为25pmol/L，其他条件同实施例4，在5-50pmol/L范围内改变刃天青浓度，测定反应混合液(8)的荧光强度。实验所得结果如图6所示。反应体系的荧光强度随刃天青浓度的增加而增强，当浓度超过1(Vmol/L后，其荧光强度降低。这可能是由于浓度太高导致荧光猝灭所致，本方法所用刃天青的最佳浓度选择为10nmol/L。实施例6本实施例是考察反应体系pH对荧光强度的影响。pH是影响酶促反应速率和荧光量子产率的一个重要因素。固定刃天青浓度为10nmol/L，其他实验条件同实施例5。分别用pH7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的Tris-HCl缓冲液，改变反应体系的酸度，考察反应体系pH对荧光强度的影响。实验结果如图7所示。由图可知，pH为8.0时，荧光强度出现最大值。实施例7本实施例是考察Tris-HCl缓冲液浓度对荧光强度的影响。固定反应体系pH为8.0，其它实验条件同实施例6。改变反应体系Tris-HCl缓冲液的浓度，用SBA-正-FCA法测定其荧光强度，考察缓冲液浓度的影响。其结果如图8所示。荧光强度随Tris-HCl缓冲液浓度的增加而增加，当其浓度为100mmoI/L时荧光强度值最大。实施例8本实施例是考察反应温度对SBA-CBR(2)的影响。固定反应体系Tris-HCl缓冲液浓度为100mmol/L，其它实验条件同实施例7。用SBA-CBR(2)吸取反应混合液(8)后，分别在25、30、35、37、40、45°C，恒温反应15min后，测定反应体系的荧光强度，结果如图9所示。可以看出，当温度低于37"C时，随反应温度增加，反应混合液(8)的荧光强度也随着增加；当温度超过37'C，荧光强度逐渐下降。其原因主要是由于反应温度对酶促反应具有双重影响。一方面，温度能加速反应；另一方面，升高温度会导致酶的变性失活。所以本实验选用37'C为最佳反应温度。实施例9本实施例是考察反应时间对荧光强度的影响。固定反应体系温度为37'C，其它实验条件同实施例8。考察反应混合液(8)的荧光强度随时间的变化。其结果如图IO。可以看出，当反应时间为15min时，其荧光强度达到恒定值，不再随着时间发生明显变化。所以，本实验选定的反应时间为15min。实施例10本实施例是考察SBA-CBR(2)的日内和日间稳定性。用2[tmol/L和2.5nmol/LGLCA-S标准溶液，分别进行日内重复性实验和进行日间重复性实验，日内和日间稳定性实验结果分别如图ll、图12所示。从图12中可以看出，SBA-CBR(2)连续重复测定10次，其荧光强度基本不变，呈现出良好的日内稳定性。重复测定ll次以后，随测定次数增加，荧光强度呈逐渐衰减趋势。前10次测定结果的相对标准偏差为1.4%。在图12中，横座标表示SBA-CBR(2)的保存时间(天数)，纵座标表示相对荧光强度(％)，第一天用SBA-CBR(2)测得的相对荧光强度为标准(100y。)。可以看出，在29天内，用同一SBA-CBR(2)测定相同浓度的GLCA-S标准液，其荧光强度基本不变；即，SBA-CBR(2)中固定化的酶可保持很好的酶活性；也说明，SBA-CBR(2)具有较好的长期稳定性。实施例11本实施例是考察尿样(S)空白反应时间对SBA-CBR(2)的影响。在25pL尿样(S)中加入10^L|3-NAD+(400pmol/L)、2.5^L1-MPMS(25nmol/L)、2.5pL刃天青(25pmol/L)，充分混匀后，在37'C下，考察尿样(S)中本身的干扰物质所产生荧光强度随时间的变化趋势。结果表明，荧光强度在0-10min内随时间逐渐增加；10-30mhi之间其荧光强度基本不变(见图13)。这说明尿样(S)中干扰物质在lOmin内完全反应。故尿样(S)与(3-NAD+、1-MPMS、刃天青的空白反应时间定为lOmin。实施例12本实施例是考察本发明HIE-SBA-FCA-Kit法的抗干扰能力。为了考察尿中共存物对本发明测定尿样中(S)SBA浓度是否存在干扰，进行了此实验。向2.5nmol/L的GLCA-S标准液中分别加入一定浓度的抗坏血酸、尿酸、尿素、葡萄糖、NaCl等，考察加入前后反应体系荧光强度的变化，计算回收率。结果如表1所示。由结果发现，所用的考察物质对本方法基本无影响。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>实施例13本实施例是用本发明包含的H正-SBA-FCA-Kit测定SBA标准和实际尿样的结果。先将25pL标准液与15pL荧光反应液(l)混匀后，在37'C条件下预孵10min，用一个固定有BSS和邓-HSD的SBA-CBR(2)，利用毛细现象吸入上述反应混合液(8)，然后插入荧光光度计的毛细管(3)定位座插孔中，在Xex540nrn和、m580nm条件下，立即测定SBA-CBR(2)内所含反应混合液(8)的荧光强度，此值作为空白值(Fi);然后在37TM吏其继续反应15min后，再测其荧光强度(F2);此值减掉空白值(AF:F2-Fi)，得到的荧光强度增加值(AF诉于定量样品中的SBA值。用一系列不同浓度的GLCA-S标准液考察了其浓度与荧光强度之间的相关性，结果如图14中的b曲线所示。可以看出，GLCA-S浓度在0.5-2.5nmol/L范围与荧光强度呈良好的直线相关性(y=71.286x+1.8095，r=0.9991)。尿样(S)测定过程和上述相同，测定结果见表2。本发明的检出限为0.06|amol/L。上述的荧光反应液(l)组成是400nmol/L(3-NAD+、25nmol/L1-MPMS及25nmol/L刃天青。用于SBA-CBR(2)固定化的BSS(6)和(3-HSD(7)的浓度为5kU/L。表2实际样品测定(n=3)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>实施例14本实施例是用本发明包含的HIE-SBA-FCA-Kit进行回收率测定。取三份尿样(S)，按样品:标准=9:1的体积比，在三份尿样(S)中分别加入25和100nmol/L的GLCA-S标准液，用其进行回收率测定，以考察方法的准确性。结果如表3所示，所得尿样回收率为95.5-105.0%，因此本发明测定尿样(S)SBA的浓度是准确可靠的。表3尿中SBA添加回收试验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>实施例15本实施例是考察本发明包含的HIE-SBA-FCA-Kit的精密度。用H正-SBA-FCA-Kit，分别对浓度为0.5、1.0、2.0nmol/L的GLCA-S标准液进行了11次荧光强度测定，得到的结果见表4。fflE-SBA-FCA-Kit的相对标准偏差(RSD)在3.4-2.5%之间，其精密度满足分析定量要求。根据回归方程可计算出本发明的检出限为0.06nmol/L(3S/K)。表4HIE-SBA-FCA-Kit的精密度测定结果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>实施例16本实施例是考察本发明包含的H正-SBA-FCA-Kit和HLE-SBA-FCA-Kit的灵敏度。先将25pL标准液与15^iL荧光反应液(l)混匀后，在37'C条件下预孵10min，用一个固定有BSS(6)和(3-HSD(7)的SBA-CBR(2)，利用毛细现象吸入上述反应混合液(8)，然后插入荧光光度计的毛细管(3)定位座插孔中，在、540nm和Xem580nrn条件下，立即测定SBA-CBR(2)内所含反应混合液(8)的荧光强度，此值作为空白值(FD;然后在37'C使其继续反应15min后，再测其荧光强度(F2);此值减掉空白值(AF-F2-F,)，得到的荧光强度增加值(AF)用于定量样品(S)中的SBA值。测定一系列不同浓度的GLCA-S标准液，得到的GLCA-S标准曲线如图14中的b曲线所示。用HLE-SBA-FCA-Kit，测定得到的结果如图15中的a曲线所示。可以看出，在各自的最佳实验条件下，HIE-SBA-FCA-Kit比HLE-SBA-FCA-Kit的灵敏度要高1倍左右。实施例17本实施例是用本发明包含的HLE-SBA-FCA-Kit测定GLCA-S和实际尿样(S)中的SBA。在一个空白管和一个测定管内先各加入25pL标准样，再分别将25pL荧光反应1号液加入空白管内，将25^L荧光反应2号液加入测定管内；在37'C反应15min后，依次将上述两管中的反应混合液(8)吸入定量毛细管(3)内，插入荧光光度计的毛细管(3)固定座中，在激发波长540nm和发射波长580nm条件下，测定毛细管(3)内所含反应混合液(8)的荧光强度；根据空白管(FJ和测定管(F2)的荧光强度差值(AF=F2-F…定量标样中的SBA值。结果如图14中的a曲线所示。可以看出，GLCA-S浓度与荧光强度在0.5-10nmol/L范围内呈良好的线性关系(尸38.055x+5.6223，r=0.9989)。尿样(S)测定过程和上述相同，测定结果见表5。RSD为1.4-2.7%。另外，按样品:标准=9:1的体积比，在所述尿样(S)中分别加入浓度为25和100pmol/L的GLCA-S标准溶液，进行了回收率测定(见表5)，尿样的回收率为95.5-105.7%，因此本发明测定尿中SBA浓度是准确可靠的。经计算本发明的检出限为0.4(Hmiol/L。上述的荧光反应1号液和荧光反应2号液中各种酶及试剂浓度如下荧光反应l号液200U/L卩-HSD(7)、500nmol/Lp-NAD+、25j_imol/Ll-MPMS及25|amol/L刃天青；荧光反应2号液200U/LBSS(6)、200U/L(3-HSD(7)、50(Himol/LP-NAD十、25pmol/L1-MPMS及25|amol/L刃天青。表5尿中SBA的测定结果和回收实验<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>实施例18本实施例是用本发明包含的LLE-SBA-FCA-Kit检测NADH的荧光强度定量尿样(S)中SBA。在一个空白管和一个测定管内先各加入20nL标准样，再分别将5pL荧光反应1号液加入空白管内，将5nL荧光反应2号液加入测定管内；在37。C反应10min后，依次将上述两管中的反应混合液(8)吸入定量毛细管(3)内，插入荧光光度计的毛细管(3)定位座中，在激发波长348nrn和发射波长460nrn条件下，测定毛细管(3)内所含反应混合液(8)的荧光强度；根据空白管(F。和测定管(F2)的荧光强度差值(AF=F2-F!)定量样品中的SBA值。得到的GLCA-S标准曲线如图15所示。可以看出，GLCA-S浓度与荧光强度在3.0-50pmol/L范围内呈良好的线性关系(y咱.3901x+0.6756，r=0.9994)。尿样(S)测定过程和上述相同，测定结果见表6，RSD《。/。。另外，按样品:标准=9:1的体积比，在三份尿样(S)中分别加入50、100、200nmol/L的GLCA-S标准液，用其进行回收率测定(见表6)，尿样的回收率为96-106%。因此本发明检测NADH的荧光强度定量尿样(S)中SBA的方法是准确可靠的。经计算本发明的检出限为2.2(imol/L。上述的荧光反应1号液和荧光反应2号液中各种酶及试剂浓度如下荧光反应液(l)l号:200U/Lp-HSD(7)、200nmol/Lp-NAD+;荧光反应液(1)2号200U/LBSS(6)、200U/L卩-HSD(7)、500(amol/Lp-NAD+。表6尿中SBA及回收率的测定<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>实施例19本实施例是用本发明包含的LIE-SBA-FCA-Kit测定SBA标准和实际尿样的结果。先将25pL标准液(或尿样)与15pL荧光反应液(l)混匀后，在37'C条件下预孵10min，用一个SBA-CBR(2)(固定有BSS和p-HSD)，利用毛细现象吸入上述反应混合液(8)，然后插入荧光光度计的毛细管定位座插孔中，在Xex348nrn和460nm条件下，立即测定SBA-CBR(2)内所含反应混合液(8)的荧光强度，此值作为空白值(F,);然后在38'C使其继续反应10min后，再测其荧光强度(F2);此值减掉空白值(AF-F2-F,)，得到的AF用于定量样品中的SBA值。用一系列不同浓度的GLCA-S标准液考察了其浓度与荧光强度之间的相关性，结果如图16中所示。可以看出，GLCA-S浓度在2.5-50nmol/L范围与荧光强度呈良好的直线相关性(y=0.3075x+1.6914，r=0.9998)。上述的荧光反应液(l)组成是500pmol/Lp-NAD+;用于SBA-CBR(2)固定化的BSS和卩-HSD(7)的浓度为4kU/L。权利要求1.一种测定磺酸化胆汁酸(SBA)的酶荧光毛细分析法，其特征在于先将一个代替常规荧光试液槽的毛细管定位座置于荧光光度计或自动临床荧光生化分析装置光路中；由β-NAD+、电子传递体、刃天青等构成的荧光反应液(1)与适量生物样品(S)混匀后，在适当温度下反应一定时间，用一个固定有磺酸化胆汁酸磺酸酯酶(BSS)(6)和β-羟基类固醇脱氢酶(β-HSD)(7)、称为磺酸化胆汁酸毛细生物反应器(SBA-CBR)(2)的毛细管(3)，利用毛细现象吸入上述反应混合液(8)，然后插入荧光光度计的毛细管(3)定位座插孔中，在给定的激发波长和发射波长条件下，立即测定SBA-CBR(2)内所含反应混合液的荧光强度，此值作为样品和试剂空白值(F1)；然后使其继续反应数分钟后，再测其荧光强度(F2)；此值减掉样品和试剂空白值(ΔF＝F2-F1)，得到的吸光度增加值(ΔF)用于定量样品(S)中的SBA值。毛细管(3)做为荧光反应、测定或酶固定化的载体。2.如权利要求l所述的方法，其特征在于被测样品(S)在BSS(6)催化作用下水解形成3卩-羟胆汁酸，然后在卩-HSD(7)的催化作用下与卩-NAD+反应，生成NADH;NADH与氧化型电子传递体(从心肌黄酶、l-MPMS、麦尔多拉蓝等电子传递体类中选1种)反应形成还原型电子传递体，后者与刃天青反应生成试卤灵，测定其荧光强度来定量SBA。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于可制成含有一个SBA-CBR(2)和一种荧光反应液(l)的SBA固定化酶荧光定量试剂盒(IE-SBA-FCA-Kit)。如果SBA-CBR(2)内表面固定有BSS(6)和p-HSD(7)，荧光反应液(l)含有p-NAD+、电子传递体和刃天青时将成为一种高灵敏SBA固定化酶荧光定量试剂盒(H正-SBA-FCA-Kit)。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于可制成SBA-CBR(2)内表面同时固定有BSS(6)和卩-HSD(7)、荧光反应液(l)只含有P-NAD+的低灵敏SBA固定化酶荧光定量试剂盒(LIE-SBA-FCA-Kit)，通过测定NADH的荧光强度来定量SBA。5.如权利要求3所述的方法，其特征在于SBA-CBR(2)内表面可单独固定BSS(6)，将P-HSD包含在荧光反应液(l)内而形成的定量试剂盒。6.如权利要求3所述的方法，其特征在于也可以由含有一个空白SBA-CBR(2)和一个测定SBA-CBR(2)组成固定化酶荧光定量双毛细管试剂盒(IE-SBA-FCA-2C-Kit)。艮P，空白SBA-CBR(2)内表面固定有p-HSD(7)和荧光反应液(1)，测定SBA-CBR内表面固定有BSS(6)、卩-HSD(7)和荧光反应液(l)的试剂盒。7.如权利要求1所述的方法，其特征在于将各种酶类不固定化，可形成一种测定SBA的液态酶荧光毛细分析法，即，在一个空白管和一个测定管内加入被测样品(S)，再分别将含有卩-HSD(7)和荧光反应液(l)的1号液加入空白管内，将含有BSS(6)、(3-NAD+和荧光反应液(l)的2号液加入测定管内；反应一定时间后，依次将上述两管中的反应混合液(8)吸入毛细管(3)内，插入荧光光度计的毛细管(3)定位座中，在给定的激发波长和发射波长条件下，测定毛细管(3)内所含反应混合液(8)的荧光强度；根据空白管(FO和测定管(F2)的荧光强度差值(AF-F2-FO定量样品(S)中的SBA值。8.如权利要求8所述的方法，其特征在于由1号液、2号液和定量毛细管(3)可构成高灵敏SBA液态酶荧光定量试剂盒(HLE-SBA-FCA-Kit);是1号液含有p-HSD(7)和荧光反应液(l)，2号液含有BSS(6)、p-HSD(7)和荧光反应液(l)的SBA定量试剂盒。9.如权利要求8所述的方法，其特征在于可制成含有1号液、2号液和定量毛细管(3)的低灵敏SBA液态酶荧光定量试剂盒(LLE-SBA-FCA-Kit)，g卩，是一种1号液含|3-HSD(7)和(3-NAD+，2号液含BSS(6)、(3-HSD(7)和p-NAD+的SBA定量试剂盒，通过测定NADH的荧光强度来定量SBA。10.如权利要求1所述的方法，SBA-CBR(2)的制备其特征在于包括以下三个步骤毛细管(3)的氨基化修饰、毛细管(3)中酶及试剂的固定化和毛细管(3)化学修饰基团的封闭。1).毛细管(3)的氨基化修饰先用0.050.5mol/LNaOH溶液将毛细管(3)浸泡12h，用超纯水清洗，再用5075%的乙醇溶液浸泡12h，最后用超纯水清洗、吹干。然后，将前处理后的毛细管(3)放入0.12%(v/v)作为偶联剂的3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)溶液(4)(以正己垸为溶剂)，在4065°<3反应46h，使ATPES(4)共价结合在毛细管(3)内壁上；最后用无水乙醇将毛细管(3)洗净，吹干；最后，将2.5。/。(v/v)戊二醛(5)试剂吸入毛细管(3)内，在真空状态下6(TC放置12h，使戊二醛(5)共价结合在ATPES(4)上。2).毛细管(3)中酶及试剂的固定化用磷酸缓冲液(pH7.5)洗掉毛细管(3)中未结合的戊二醛(5)之后，用毛细管(3)吸入由磷酸缓冲液配制的110kU/LBSS(6)和p-HSD(7)溶液，在4QC下旋转固定612h，使BSS(6)和(3-HSD(7)的氨基与戊二醛(5)的醛基共价结合，最后用磷酸盐缓冲溶液清洗干净。3).毛细管化学修饰基团的封闭再将固定有BSS(6)、(3-HSD(7)的毛细管(3)浸泡在l5。/0(w/v)牛血清白蛋白中12h，封闭未结合的醛基，制成SBA-CBR(2);最后，将SBA-CBR(2)保存在4°C的磷酸盐缓冲液中(pH7.5)。全文摘要本发明公开了磺酸化胆汁酸(SBA)酶荧光毛细分析法及SBA荧光定量试剂盒(SBA-FCA-Kit)，属于临床生化检验领域，适用于肝胆疾病的快速筛查和诊断，尤其适用于新生儿期黄疸、先天性胆道闭锁症的早期发现。生物样品与荧光反应液混合后，用一个含有磺酸化胆汁酸磺酸酯酶、β-羟基类固醇脱氢酶的SBA毛细生物反应器(SBA-CBR)吸入，在给定的激发波长和发射波长下，测定SBA-CBR的空白荧光强度；然后使其继续反应一定时间，再测其荧光强度；用荧光强度差值定量样品中的SBA。SBA-FCA-Kit由一个SBA-CBR和含有β-NAD⁺、电子传递体及刃天青等的荧光反应液构成。文档编号G01N21/64GK101221129SQ200810045260公开日2008年7月16日申请日期2008年1月25日优先权日2008年1月25日发明者李永生,高秀峰申请人:四川大学