用于癌症的分子诊断试验的制作方法
【专利摘要】本发明提供了用以鉴别用于癌症的分子诊断试验的方法和组合物。所述试验鉴别了对于抗血管生成治疗剂有反应的癌症亚型并且能够对这一亚型内的患者进行分类。本发明可以用于在施用任何抗血管生成剂之前确定患有癌症的患者对治疗方案在临床上是有反应的还是无反应的。这一试验可以用于不同癌症类型中并且与直接地或间接地影响血管生成或血管生成信号传导的不同药物一起使用。此外，本发明可以用作某些癌症类型的预后指标。具体地说，本发明是针对预测性标志物的某些组合的使用，其中所述预测性标志物的表达与对治疗方案的反应性或无反应性相关。
【专利说明】用于癌症的分子诊断试验
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本发明要求于2011年6月2日提交的美国临时专利申请61/492，488的优先权益，所述申请以引用的方式并入本文。
发明领域
[0003]本发明涉及一种适用于诊断不同解剖部位的癌症的分子诊断试验，所述分子诊断试验包括与血管生成有关的常见亚型的使用。本发明包括从基因表达水平获得基因分类模型。一个应用是对癌症治疗药物种类的反应的分层和针对癌症治疗药物种类选择患者，并且因此指导患者治疗选择。另一个应用是将癌症患者分层为对于抗血管生成治疗剂有反应的那些和对于抗血管生成治疗剂没有反应的那些。本发明提供一种试验，所述试验可以指导疗法选择以及在新型治疗剂的临床试验评估过程中选择用于富集策略的患者群。本发明可以用作包括卵巢癌、乳癌以及成胶质细胞瘤在内的某些癌症的预后指标。所述血管生成亚型可以由新鲜/冷冻(FF)的患者样品或经过福尔马林固定石蜡包埋的FFPE的患者样品来鉴别。
[0004]背景
[0005]制药行业一直在寻求比当前施用的药物更有效的、更具特异性或具有更少不良副作用的新型药物治疗选择。由于人类群体内的遗传变异性使许多已认可的药物的有效性产生了显著差异，故正在不断地开发药物疗法替代品。因此，虽然当前有多种多样的药物疗法选择可供使用，但是在患者无法起反应的情况下仍总是需要更多疗法。
[0006]传统上，医师所使用的治疗模式一直是开出在治疗疾病方面可能得到最高成功率的一线药物疗法。如果一线疗法无效，则开出替代性药物疗法。对于某些疾病来说，这种模式明显不是最佳的治疗方法。例如，在如癌症等疾病中，第一次治疗经常是最重要的并且为成功治疗提供了最佳机会，因此对于选择将针对特定患者的疾病最有效的初始药物的需求变高。
[0007]在西方国家中，卵巢癌是所有妇科癌症之中引起死亡的主导原因。这种高死亡率是由大多数患者在晚期进行诊断所致。上皮性卵巢癌(EOC)占卵巢恶性肿瘤的90%并且被分为不同的组织学类别，包括浆液性、粘液性、子宫内膜样、透明细胞、过渡型、混合型、以及未分化的亚型。越来越多的证据表明这些不同的组织学起因于不同的病因学。近期在用于分类上皮性卵巢癌的方法学方面已经取得进展(McCluggage, W.G.“Morphologicalsubtypes of ovarian carcinoma:a review with emphasis on new developments andpathogenesis，’’PATHOLOGY，2011 年 8 月;43 (5):420-32)。其后果之一是以前被分类为子宫内膜样的许多肿瘤现在被分类为浆液性的。
[0008]卵巢癌的当前标准治疗是减瘤手术(debulking surgery)和基于钼紫杉烧的标准细胞毒性化学疗法。然而，不是所有患者都对其有反应，并且在对其有反应的那些中，大约70%将会经历复发。基于组织学或分子分类的卵巢癌特异性靶向疗法尚未进入市场。类似地，对于其它类型的癌症，仍然没有选择适当细胞毒性化学治疗剂的准确方式。[0009]微阵列和分子基因组学的出现有可能对疾病的诊断能力和预后分类产生显著影响，它们可以帮助预测单个患者对确定的治疗方案的反应。微阵列提供了对大量遗传信息的分析，从而提供个体的遗传指纹。更值得关注的是，这一技术最终将为定制药物治疗方案提供必要工具。
[0010]当前，健康护理专业人员具有很少的途径来帮助他们鉴别将受益于化学治疗剂的癌症患者。最佳一线药物的鉴别一直很难，因为没有可用的方法来准确地预测哪种药物治疗对于特定癌症的生理学将是最有效的。这一不足导致相对较差的单一药剂反应率以及增加的癌症发病率和死亡。此外，患者经常不必要地经受无效、有毒的药物疗法。
[0011]血管生成是肿瘤新血管形成的关键组成部分并且对于肿瘤发生和转移是必不可少的。因此，它是治疗干预的关键领域并且一直与不良预后和存活率降低相关。这促进了靶向血管生成相关性过程和途径的多种药剂的开发，包括作为市场主导品并且首个被FDA批准的抗血管生成剂贝伐单抗(bevacizumab)(阿瓦斯汀(Avastin)),由Genentech/Roche生产。
[0012]包括贝伐单抗的治疗方案已经展示出广泛的临床活性1-10。然而，在大多数癌症中，在贝伐单抗添加至细胞毒性化学疗法之后没有显示出总存活率(OS)益处8，12—13。这表明，相当大比例的肿瘤或是最初对VEGF阻断(贝伐单抗的作用机制)具有抗性，抑或快速发展对VEGF阻断的抗性。事实上，当接受贝伐单抗单药疗法时，21%的卵巢癌患者、10%的肾癌患者以及33%的直肠癌患者显示部分消退，从而表明贝伐单抗在小亚组的患者中可能是有活性的，但是这种增量的益处在未选择的患者中未达到显著性。因此，使用对贝伐单抗有反应的生物标志物将会改进治疗结果的评定并且因此能够鉴别将从贝伐单抗治疗接受最大临床益处的患者亚组。这在转移性乳癌的情况下将是特别相关的，其中临床上有益的生物标志物的缺乏削弱了贝伐单抗的使用。迄今，还没有这种生物标志物在临床上被验证可用来预测贝伐单抗功效。高血压和VEGF多态性是迄今为止显示出潜力的仅有的生物标志物，但是关于其在临床环境中的使用仍然存在重要问题。
[0013]抗血管生成疗法的另一种方法是同时靶向多种血管生成途径而不是选择性地靶向VEGF途径。理论上，多靶向抗血管生成剂应比如贝伐单抗等药剂更完全地抑制血管生成，并且因此可以产生更大的治疗益处。已经假定在一些肿瘤中，血管生成可能仅在疾病的早期需要VEGF，但随着疾病进展，其由另外的血管生成途径驱动。因此，通过靶向多种途径，有可能抵消可以导致对VEGF抑制的抗性的补偿逃避机制。
[0014]对于其它类型的癌症，仍然没有选择哪些患者将会或将不会对使用抗血管生成治疗剂或单药剂抗血管生成疗法的标准护理有反应的准确方式。
[0015]因此，所需要的是一种分子诊断试验，其与标准护理组合抑或作为单药剂治疗将有助于基于患者对于抗血管生成治疗剂的预测反应来对患者分层。这将允许应接受替代疗法的那些患者的快速鉴别。这种分子诊断试验应以足够的准确度预测在不同癌症类型内的治疗反应性。
[0016]发明概述
[0017]公开了使用在癌症中表达的一组生物标志物的方法，这样使得当一些或全部转录物过表达或表达不足时，它们鉴别出在与血管生成有关的分子信号传导中出现上调的癌症的亚型。本发明还提供了用于指示对于抗血管生成剂的反应性或无反应性的方法。在不同方面，这组生物标志物可以形成单参数或多参数预测性试验的基础，所述试验可以使用如微阵列、Q-PCR、免疫组织化学、ELISA或可以量化mRNA或蛋白质表达的其它技术等本领域已知方法来实现。
[0018]此外，本文所描述的癌症亚型是许多类型的癌症共有的并且不限于单一癌症疾病类型。因此，本文所公开的表达签名(expression signature)可以用于预测癌症治疗剂在不同组织中不同癌症类型的反应性或无反应性。在本发明的一个实施方案中，这些生物标志物适用于评估癌症肿瘤对于抗血管生成治疗剂的反应性。在一个示例性实施方案中，所述癌症是卵巢癌。在另一个示例性实施方案中，所述癌症是成胶质细胞瘤。在另一个示例性实施方案中，所述癌症是乳癌。
[0019]本文所描述的本发明不限于任何一种药物；它可以用于鉴别对直接地或间接地影响或靶向血管生成过程的一系列当前使用的、正在研发的和新型药物中的任何一种有反应者和无反应者。在一个实施方案中，本发明可以用于评估作为单一药剂抑或与标准护理疗法组合的辅药或新辅药贝伐单抗或达沙替尼。在另一个实施方案中，本发明可以用于在卵巢癌中评估阿瓦斯汀、VEGF-TRAP治疗。
[0020]本发明涉及使用至少或至多10种不同的反应分类来预测对药物的反应，所述反应如总存活率、无进展存活率、放射反应、(如由RECIST定义)完全反应、部分反应、稳定疾病，以及血清学标志物如但不限于，PSA、CEA、CA125、CA15-3以及CA19-9。在某些实施方案中，本发明可以用于评估卵巢、乳房以及成胶质细胞瘤的存活率。
[0021]另一方面，本发明涉及鉴别癌症中的血管生成亚型。所述亚型可以通过测定某些生物标志物的表达水平进行检测。表达签名限定了一组生物标志物，其表达将预测对于抗血管生成剂有反应或无反应的癌症类型。在某些示例性实施方案中，所述表达签名包括了选自表IA和IB中所列出的生物标志物的两种或更多种生物标志物。在另一个示例性实施方案中，所述表达签名包括了选自SEQ ID N0:632至801(组I)或SEQ ID N0:802至974(组II)的序列的两种或更多种生物标志物。在另一个示例性实施方案中，所述表达签名包括了选自表2A和2B中所列出的生物标志物的两种或更多种生物标志物。在另一个示例性实施方案中，所述表达签名包括表2A和2B中所列出的生物标志物并且其对应权重是使用PLS分类器确定。
[0022]另一方面，本发明涉及用于以上所列出的如qPCR、微阵列以及免疫测定(如免疫组织化学、ELISA、蛋白质印迹等)的常规诊断应用的试剂盒。这类试剂盒包括了测定基因或基因产物的表达和量化mRNA或蛋白质表达的适当试剂和说明书。
[0023]还公开了用于在有或无血管生成表型的情况下鉴别人类肿瘤的方法。在某些示例性实施方案中，这类方法可以用于鉴别对直接地抑或间接地抑制与血管生成有关的过程的药物敏感和有反应的患者。在某些其它示例性实施方案中，这类方法可以用于鉴别对直接地抑或间接地抑制与血管生成有关的过程的药物具有抗性或没有反应的患者。
[0024]另一方面，本发明可以在某些癌症类型中用作预后指标。在一个示例性实施方案中，所述癌症是卵巢癌。在另一个示例性实施方案中，所述癌症是乳癌。在又另一个示例性实施方案中，所述癌症是成胶质细胞瘤。
[0025]本发明还涉及指导患者的有效治疗。此外，提供了涉及选择患者治疗方案和选择患者用于直接地或间接地影响血管生成的当前或开发阶段药物的临床试验的方法。[0026]此外，本文描述了使存档的经过福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的活组织检查材料以及新鲜/冷冻(FF)组织适用于所有转录物的测定，并且因此与最广泛可获得的活组织检查材料的类型相容的方法。生物标志物表达水平可以使用从FFPE组织、新鲜冷冻组织或已经储存在溶液(如RNAIater?:)中的新鲜组织获得的RNA来确定。
[0027]附图简述
[0028]图1提供了表示在Almac Diagnostics的上皮性卵巢癌样品集的199个浆液样品中最可变的基因的分层合并聚类分析的热图。探针集簇的功能分析汇总于图像的右侧。横过图像顶部的图例指示每个样品被分配的分类器组以用于分类器产生(即，种类标记)。
[0029]图2A和2B表示使用功能富集分析在上皮性卵巢癌训练集的199个仅浆液样品中得到的血管生成探针集簇的功能分析结果。图2A示出了表示前10个富集的基因本体(GeneOntology)生物过程的显著性的直方图。红色条形指示在错误发现率校正之后P值为0.05的过程的显著性。图2B表示了基因本体生物过程树的子集，其中过程包括由簇3中的探针集编码的一种或多种基因。红色的过程指示在错误发现率校正之后P值为0.05的过程的显著性。黑色的过程包括由簇3中的探针集编码的一种或多种基因，但不具显著性。
[0030]图3表示在鉴别与血管生成有关的分子亚型的示例性25-基因表达签名内基因的功能富集结果。红色条形指示在错误发现率校正之后P值为0.05的过程的显著性。
[0031]图4提供了先前未治疗的患有高分级成胶质细胞瘤的患者在初始手术切除之后无复发存活率(事件发生时间，以周为单位)的卡普兰-迈耶曲线(PhillipsHS, Kharbanda S，Chen R, Forrest WF等，“Molecular subclasses of high-grade gliomapredict prognosis, delineate a pattern of disease progression, and resemblestages in neurogenesis, ^CANCER CELL, 2006 年 3 月；9 (3): 157-73.PMID: 16530701 ;Costa BM, Smith JS, Chen Y, Chen J 等,“Reversing H0XA9oncogene activation byPI3K inhibition:epigenetic mechanism and prognostic significance in humanglioblastoma,，，CANCER RES, 2010 年 I 月 15 日；70 (2):453-62.PMID: 20068170)。
[0032]图5提供了在用达沙替尼治疗之后，示例性25-基因分类器模型在16个前列腺细胞系内的分类性能的ROC曲线图。在应用所述分类器模型之后，AUC是大约0.84。95%的置信限是使用 1000 次引导迭代确定的(Wang XD, Reeves K, Luo FR, Xu LA 等，“ Identificationof candidate predictive and surrogate molecular markers for dasatinib inprostate cancer:rationale for patient selection and efficacy monitoring, ”GENOMEB10L2007;8(II):R255.PMID:18047674)。
[0033]图6提供了表示在根据更新的病理学分类标准重新分类的上皮性卵巢癌样品集的265个浆液样品中最可变的基因的分层合并聚类分析的热图。探针集簇的功能分析汇总于图像的右侧。横过图像顶部的图例指示每个样品被分配的分类器组以用于分类器产生(即，种类标记)。
[0034]图7A和7B表示使用功能富集工具(FET)算法在上皮性卵巢癌训练集的265个仅浆液样品中得到的血管生成探针集的功能分析结果。图7A示出了表示前10个富集的基因本体生物过程的显著性的直方图。红色条形指示在错误发现率校正之后P值为0.05的过程的显著性。图7B表示基因本体生物过程树的子集，其中过程包括由簇2 (血管生成)中的探针集编码的一种或多种基因。红色的过程指示在错误发现率校正之后P值为0.05的过程的显著性。黑色的过程包括由所述血管生成簇中的探针集编码的一种或多种基因，但不具显著性。
[0035]图8表示在鉴别与血管生成有关的分子亚型的示例性45-基因分类器模型内基因的功能富集结果。红色条形指示在错误发现率校正之后P值为0.05的过程的显著性。
[0036]图9提供了在用达沙替尼治疗之后，45-基因分类器模型在16个前列腺细胞系内的分类性能的ROC曲线图。在应用所述分类器模型之后，AUC是大约0.95。95%的置信限是使用1000次引导迭代确定的。
[0037]图10提供了表示在根据更新的病理学分类标准重新分类的上皮性卵巢癌样品集的265个浆液样品中最可变的基因的分层合并聚类分析的热图。探针集簇的功能分析汇总于图像的右侧。横过图像的顶部的图例指示每个样品应该被分配的分类器组以用于非血管生成或无反应组分类器的产生。
[0038]图11提供了在重新分类的卵巢样品集中非血管生成样品组(图3a，样品簇I)与血管生成样品组(图10，样品簇2和3)的无进展存活率(以周为单位)的卡普兰-迈耶曲线的比较。
[0039]图12A和12B提供了表不在乳癌样品集的51个ER阴性样品中最可变的基因(图12A)和在乳癌样品集的56个ER阳性样品中最可变的基因(图12B)的分层合并聚类分析的热图。对于显示出血管系统发育/血管生成或免疫反应/IFN信号传导的那些簇，探针集簇的功能分析汇总于图像的右侧
[0040]序列表
[0041]所附序列表中列出的核酸和氨基酸序列是使用核苷酸碱基的标准字母缩写示出，如37C.F.R.§ 1.822中所定义。仅示出每一核酸序列的一条链，但是互补链应理解为涵盖于提到的任何所展示的链内。
[0042]序列表是作为ASCII文本文件以命名为ADL_0801WP_ST25.txt的文件的形式提交，它是在2012年6月4日创建并且为352，839个字节，以引用的方式并入本文。
[0043]发明详述
[0044]除非另外定义，否则本文所使用的技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解相同的意义。分子生物学中常见术语的定义可以在以下文献中找至丨J:Benjamin Lewin, Genes IX,由 Jones and Bartlet 出版，2008(ISBN0763752223)；Kendrew 等(编著)，The Encyclopedia of Molecular Biology,由 Blackwell ScienceLtd.出版，1994(ISBN0632021829) ；Robert A.Meyers (编著)，Molecular Biologyand Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference,由 VCH Publishers, Inc.出版，1995 (ISBN9780471185710) ；Singleton 等，Dictionary of Microbiology andMolecular Biology,第 2 版，J.ffiley&Sons (New York, N.Y.1994),以及 March, AdvancedOrganic Chemistry Reactions,Mechanisms and Structure,第 4 版,Johnffiley&Sons (New York, N.Y.1992)。
[0045]除非上下文另外清楚地指示，否则单数形式“一个/种(a) ”、“一个/种(an) ”以及“所述(the)”包括复数形式的`指代物。类似地，除非上下文另外清楚地指示，否则词语“或”意图包括“和”。术语“包含(comprises)”意指“包括(includes)”。在相矛盾的情况下，将以本说明书(包括术语解释)为准。[0046]如本文所用，术语“标志物组”、“表达分类器”、“分类器”、“表达签名”或“签名”可以可互换地使用。
[0047]本申请中所引用的所有出版物、公布的专利文献、以及专利申请指示了本申请所涉及的一个或多个领域中的技术水平。本文所引用的所有出版物、公布的专利文献、以及专利申请特此以引用的方式并入，其引用程度就如同具体地并且个别地指示每一单个出版物、公布的专利文献、或专利申请是以引用的方式并入。
[0048]综述
[0049]当前癌症研究工作的主要目标是通过将分子参数结合到临床治疗决策中来增加患者围术期系统疗法的功效。遗传药理学/基因组学是个体对外来化合物或药物的反应中所涉及的遗传/基因组因素的研究。对本发明的生物标志物的表达具有刺激或抑制作用的药剂或调节剂可以被施用至个体以治疗(预防性地或治疗性地)患者的癌症。理想的情况是，同时将个体的药物基因组学与这种治疗结合考虑。治疗剂代谢的差异有可能通过改变药理学活性药物的剂量与血液浓度之间的关系而导致严重毒性或治疗失效。因此，了解个体的药物基因组学允许选择对预防性或治疗性治疗有效的药剂(例如，药物)。这种药物基因组学可以进一步用于确定适当的剂量和治疗方案。因此，可以确定在个体中本发明的生物标志物的表达水平，以便由此选择适合于个体的治疗性或预防性治疗的一种或多种药剂。
[0050]本发明涉及一种适用于诊断不同解剖部位的癌症的分子诊断试验，所述分子诊断试验包括与血管生成有关的常见亚型的使用。本发明包括将受试者鉴别为对于抗血管生成治疗剂有反应或无反应的表达签名。所述表达签名是通过获得来自已知病理学和/或临床结果的样品集的样品的表达谱来得到。所述样品可以源自相同的样品组织类型或不同的组织类型。如本文所用，“表达谱”包含了表示给定样品中所分析的每种生物标志物的表达水平的一组值。
[0051]然后使用数学模型分析来自所述样品集的表达谱。可以应用不同的数学模型，并且所述数学模型包括但不限于，来自以下领域的模型:模式识别(Duda等，PatternClassification,第 2 版，John Wiley, New York2001)、机器学习(Schdlkopf
等,Learning with Kernels,MIT Press, Cambridge2002 ；Bishop,Neural Networksfor Pattern Recognition, Clarendon Press, 0xfordl995)、统计学(Hastie 等,TheElements of Statistical Learning, Springer, New York2001)、生物信息学(Dudoit等,2002, J.Am.Statist.Assoc.97: 77-87 ；Tibshirani 等,2002, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA99:6567-6572)或化学计量学(Vandeginste 等，Handbook of Chemometrics andQualimetrics,第B部分，Elsevier, Amsterdaml998)。所述数学模型鉴别所述样品集中所表达的最能预测给定疾病表型的一种或多种生物标志物。这一种或多种生物标志物限定了表达签名。因此，表达签名包括被鉴别为最能预测给定疾病表型的生物标志物。在某些示例性实施方案中，所述数学模型限定了每个所鉴别的生物标志物的变量，如权重。在某些示例性实施方案中，所述数学模型限定了决策函数。所述决策函数可以进一步限定阈值得分，所述阈值得分将样品集分成两种疾病表型，如但不限于，对于抗血管生成治疗剂有反应和无反应的样品。在一个示例性实施方案中，所述决策函数和表达签名是使用线性分类器限定的。[0052]为了使用限定的表达签名来对新样品分类，分离出由所述表达签名限定的生物标志物并且确定这一种或多种生物标志物的表达谱。以用于限定表达签名的同一数学模型对新样品生物标志物表达谱进行分析。在某些示例性实施方案中，所述数学模型限定了所述新样品的表达得分。所述表达得分可以通过使用非线性、代数、三角或相关手段将生物标志物的表达值与对应的标量权重组合以获得单个标量值来确定。将所述表达得分与阈值得分相比较并且将样品分类为对于抗血管生成治疗剂有反应或无反应的。在一个示例性实施方案中，大于参考表达值的样品表达值指示患者将对于抗血管生成治疗剂有反应。在另一个示例性实施方案中，低于阈值得分的样品表达得分指示患者将对于抗血管生成治疗剂没有反应。在另一个示例性实施方案中，低于阈值表达得分的样品表达得分指示患者具有癌症类型或有发展癌症类型的风险，所述癌症类型对于抗血管生成治疗剂没有反应。在另一个示例性实施方案中，高于参考表达得分的样品表达得分指示患者具有癌症类型或有发展癌症类型的风险，所述癌症类型对于抗血管生成治疗剂具有反应。在表达签名是源自于包含一种类型的癌症组织的组织样品集的情况下，所述表达签名不限于仅对具有相同癌症类型的组织中的相同癌症亚型进行鉴别，还可以用于共享相同癌症亚型的其它癌症类型。例如，在表达签名是源自于卵巢癌样品的情况下，所述表达签名可以用于鉴别不同癌症(如成胶质细胞瘤或乳癌)中的类似血管生成亚型。
[0053]本文所公开的表达签名的一种应用是对涵盖抗血管生成疗法的治疗药物种类的反应的分层和针对所述治疗药物种类选择患者。通过检查肿瘤中一组鉴别的生物标志物的表达，有可能确定哪种治疗剂或药剂组合将最可能降低癌症的生长速率。还有可能确定哪种治疗剂或药剂组合将最不太可能降低癌症的生长速率。通过检查一组生物标志物的表达，因此有可能消除无效的或不当的治疗剂。重要的是，在某些实施方案中，这些确定可以在逐个患者的基础上或在逐个药剂的基础上进行。因此，可以确定具体治疗方案是否可能使特定患者或患者类型受益，和/或具体方案是否应该继续。本发明提供了可以指导疗法选择以及在新型治疗剂的临床试验评估过程中选择用于富集策略的患者群的试验。例如，当评估推定的抗血管生成剂或治疗方案时，可以使用本文所公开的表达签名和方法选择用于临床试验的个体，所述个体具有对于抗血管生成剂有反应的癌症类型。血管生成亚型可以由新鲜/冷冻(FF)或经过福尔马林固定石蜡包埋的(FFPE)患者样品进行鉴别。在一个示例性实施方案中，所述癌症类型是卵巢癌。在另一个示例性实施方案中，所述癌症类型是成胶质细胞瘤。在又一个示例性实施方案中，所述癌症类型是乳癌。
[0054]如果与在不接触治疗剂的情况下癌症的生长相比，癌症的生长速率由于与治疗剂相接触而受到抑制，那么所述癌症对所述治疗剂“有反应”。癌症的生长可以按多种方式测量。例如，肿瘤的大小或测量适于所述肿瘤类型的肿瘤标志物的表达。
[0055]如果当与在不接触治疗剂的情况下癌症的生长相比，癌症的生长速率并未由于与治疗剂相接触而受到抑制，或在极低的程度上受抑制，那么所述癌症对所述治疗剂“无反应”。如上所述，癌症的生长可以按多种方式测量，例如，肿瘤的大小或测量适于所述肿瘤类型的肿瘤标志物的表达。对治疗剂无反应的品质是高度可变的，其中不同癌症在不同条件下对于给定治疗剂呈现出不同水平的“无反应性”。再者，可以使用除肿瘤的生长大小以外的另外标准来评定无反应性的测量，如但不限于，患者的生活质量和转移程度。
[0056]鉴别表达签名[0057]本发明的表达签名是通过分析患者样品集中某些生物标志物的表达谱来进行鉴另O。适合用于本发明中的生物标志物包括DNA、RNA以及蛋白质。从患者样品中分离所述生物标志物并且测定其表达水平以获得有关所述患者样品集中所分析的每个样品的一组表达谱。
[0058]a.表达谱
[0059]在某些实施方案中，所获得的表达谱是基因组或核酸表达谱，其中所述样品中一种或多种核酸的量或水平得到确定。在这些实施方案中，所测定的用以产生在诊断或预后方法中采用的表达谱的样品是核酸样品。核酸样品包括了含有所分析的细胞或组织的表型决定性生物标志物的表达信息的核酸群体。在一些实施方案中，核酸可以包括RNA或DNA核酸，例如，mRNA、CRNA、CDNA等，只要样品保留从中获得所述样品的宿主细胞或组织的表达信息即可。所述样品可以按如本领域已知的多种不同的方式进行制备，例如，通过从细胞中分离mRNA，其中所分离的mRNA是以分离的、扩增的形式使用，或被用于制备cDNA、cRNA等，如差异基因表达领域中已知的。因此，测定样品中mRNA的水平包括由所述mRNA制备cDNA或cRNA，并且随后测量所述cDNA或cRNA。所述样品通常是使用标准方案，由从需要治疗的受试者采集的细胞或组织，例如经由组织的活组织检查来制备，其中可以产生这类核酸的细胞类型或组织包括了存在待测定的表型的表达模式的任何组织，包括但不限于，疾病细胞或组织、体液等等。
[0060]可以使用任何常规方案由初始核酸样品产生表达谱。虽然已知多种不同的产生表达谱的方式，如在差异基因表达/生物标志物分析领域中所采用的那些，但是用于产生表达谱的一种代表性并且便利的方案类型是基于阵列的基因表达谱产生方案。这类应用是杂交测定，其中采用的核酸展示了在待产生的表达谱中待测定/表达谱分析的每个基因的“探针”核酸。在这些测定中，首先由所测定的初始核酸样品制备靶核酸的样品，其中制备可以包括使用标记物(例如，信号产生系统的成员)对所述靶核酸进行标记。在靶核酸样品制备之后，使所述样品与所述阵列在杂交条件下相接触，从而在与附接至阵列表面的探针序列互补的靶核酸之间形成复合物。然后定性地抑或定量地检测杂交复合物的存在。可以实践用来产生主题方法中所采用的表达谱的具体杂交技术包括以下专利中描述的技术:美国专利号 5，143，854 ;5，288，644 ;5，324，633 ;5，432，049 ;5，470，710 ;5，492，806 ；5，503，980 ;5，510，270 ;5，525，464 ;5，547，839 ;5，580，732 ;5，661，028 ;5，800，992 ;其公开内容以引用的方式并入本文;以及W095/21265 ；W096/31622 ；W097/10365 ；W097/27317 ；EP373203 ;以及EP785280。在这些方法中，使“探针”核酸的阵列与如以上所描述的靶核酸相接触，所述阵列包括了针对表达正进行测定的每种生物标志物的探针。接触是在杂交条件(例如，如以上所描述的严格杂交条件)下进行，并且然后去除未结合的核酸。所得到的杂交核酸的模式提供了有关已经被探查的每种生物标志物的表达的信息，其中所述表达信息是关于基因是否被表达并且通常是在何种水平上被表达，其中所述表达数据(即，表达谱)可以是定性的和定量的。
[0061]b.疾病和样品组织来源
[0062]在某些示例性实施方案中，患者样品集包括癌症组织样品，如存档的样品。所述患者样品集优选是源自于已经通过预后、复发可能性、长期存活率、临床结果、治疗反应、诊断、癌症分类或个体化的基因组谱表征的癌症组织样品。如本文所用，癌症包括但不限于，白血病、脑癌、前列腺癌、肝癌、卵巢癌、胃癌、结肠直肠癌、喉癌、乳癌、皮肤癌、黑色素瘤、肺癌、肉瘤、宫颈癌、睾丸癌、膀胱癌、内分泌癌、子宫内膜癌、食道癌、神经胶质瘤、淋巴瘤、成神经细胞瘤、骨肉瘤、胰腺癌、垂体癌、肾癌等。在一个实施方案中，本文所描述的方法是指用抗血管生成剂、抗血管生成靶向疗法、血管生成信号传导抑制剂治疗癌症，但不限于这些类别。这些癌症还包括这些癌症在发病的不同阶段的子类和亚型。在某些示例性实施方案中，所述患者样品集包括卵巢癌样品。在另一个示例性实施方案中，所述患者样品集包括乳癌样品。在又另一个示例性实施方案中，所述患者样品集包括成胶质细胞瘤样品。
[0063]“生物样品”、“样品”以及“试验样品”在本文可互换地用于指从个体获得或以另外的方式得到的任何材料、生物流体、组织或细胞。这包括血液(包括全血、白细胞、外周血单核细胞、血沉棕黄层、血浆以及血清)、痰、眼泪、粘液、洗鼻液、鼻抽吸物、呼吸、尿、精液、唾液、脑膜液、羊水、腺液、淋巴液、乳头抽吸物、支气管抽吸物、滑液、关节抽吸物、腹水、细胞、细胞提取物、以及脑脊髓液。这还包括所有前述的实验分离的部分。例如，可以将血液样品分级分离为血清或含有如红血细胞或白细胞(white blood cell/leukocyte)等特定类型的血细胞的部分。如果需要，样品可以是来自个体的样品的组合，如组织与流体样品的组合。术语“生物样品”还包括了含有均质化固体材料的材料，如例如来自粪便样品、组织样品或组织活组织检查的材料。术语“生物样品”还包括源自于组织培养或细胞培养的材料。用于获得生物样品的任何适合的方法都可以采用；示例性方法包括例如静脉切开术、拭子(例如，口腔拭子)以及细针抽吸活组织检查程序。还可以例如通过显微解剖(例如，激光捕获显微解剖(LCM)或激光显微解剖(LMD))、膀胱冲洗、涂片(例如，PAP涂片)或导管灌洗来收集样品。从个体获得或得到的“生物样品”包括在从个体获得之后已经以任何适合的方式进行处理的任何此类样品，例如，新鲜冷冻或经过福尔马林固定和/或石蜡包埋的。
[0064]如本文所用，术语“患者”包括人类和非人类动物。用于治疗的优选的患者是人。“患者”与“受试者”在本文可互换地使用。
[0065]c.生物标志物
[0066]如本文所用，术语“生物标志物”可以指基因、mRNA、cDNA、反义转录物、miRNA、多肽、蛋白质、蛋白质片段，或是指示基因表达水平抑或蛋白质产生水平的任何其它核酸序列或多肽序列。当生物标志物指示个体中的异常过程、疾病或其它状况或是所述异常过程、疾病或其它状况的迹象时，如与指示个体中的正常过程、无疾病或其它状况或是所述正常过程、无疾病或其它状况的迹象的生物标志物的表达水平或值相比，所述生物标志物一般被描述为过表达抑或表达不足的。“上调(Up-regulation) ”、“上调的(up-regulated) ”、“过表达(over-expression) ”、“过表达的(over-expressed) ”以及其任何变化形式在本文可互换地用于指生物样品中一种生物标志物的值或水平大于在来自健康或正常个体的类似生物样品中通常检测到的生物标志物的值或水平(或者值或水平的范围)。所述术语还可以指生物样品中一种生物标志物的值或水平大于可以在特定疾病的不同阶段检测到的生物标志物的值或水平(或者值或水平的范围)。
[0067]“下调(Down-regulation) ”、“下调的(Down-regulated) ”、“表达不足(under-expression) ”、“表达不足的(under-expressed) ”以及其任何变化形式在本文可互换地用于指生物样品中一种生物标志物的值或水平小于在来自健康或正常个体的类似生物样品中通常检测到的生物标志物的值或水平(或者值或水平的范围)。所述术语还可以指生物样品中一种生物标志物的值或水平小于可以在特定疾病的不同阶段检测到的生物标志物的值或水平(或者值或水平的范围)。
[0068]此外，如与指示个体中的正常过程或者无疾病或其它状况或是所述正常过程或者无疾病或其它状况的迹象的生物标志物的“正常”表达水平或值相比，过表达抑或表达不足的生物标志物还可以被称为“差异表达的”或称为具有“差异水平”或“差异值”。因此，生物标志物的“差异表达”还可以被称为生物标志物自“正常”表达水平的变化。
[0069]术语“差异生物标志物表达”与“差异表达”在本文可互换地用于指相对于生物标志物在正常受试者中的表达或相对于其在对特定疗法有不同地反应或具有不同预后的患者中的表达，所述生物标志物的表达在患有特定疾病的受试者中被激活至更高或更低的水平。所述术语还包括生物标志物的表达在相同疾病的不同阶段被激活至更高或更低的水平。还应理解，差异表达的生物标志物可以在核酸水平或蛋白质水平下被激活抑或被抑制，或者可以经历选择性剪接以产生不同的多肽产物。这类差异可以通过包括mRNA水平、miRNA水平、反义转录物水平、或者多肽的蛋白质表面表达、分泌或其它分配在内的多种变化来证实。差异生物标志物表达可以包括两个或更多个基因或其基因产物之间的表达的比较；或两个或更多个基因或其基因产物之间的表达比率的比较；或甚至是同一基因的两种不同地加工的产物的比较，其在正常受试者与患有疾病的受试者之间不同；或在同一疾病的不同阶段之间的比较。差异表达包括在例如正常细胞和患病细胞之中、或在经历了不同疾病事件或疾病阶段的细胞之中，生物标志物中的瞬时或细胞表达模式的定量和定性差
巳
[0070]在某些示例性实施方案中，所述生物标志物是RNA转录物。如本文所用，“RNA转录物”是指编码和非编码RNA，包括信使RNA (mRNA)、选择性地剪接的mRNA、核糖体RNA (rRNA)、转运RNA(tRNA)、小核RNA(snRNA)以及反义RNA。测量生物样品中的mRNA可以用作检测所述生物样品中对应蛋白质和基因的水平的替代。因此，本文所描述的任何生物标志物或生物标志物组还可以通过检测适当的RNA来进行检测。生物标志物表达谱分析的方法包括但不限于，定量 PCR、NGS> RNA 印迹(northern blot)、DNA 印迹(southern blot)、微阵列、SAGE、免疫测定(ELISA、EIA、凝集法、浊度测定法、比浊法、蛋白质免疫印迹(Westernblot)、免疫沉淀法、免疫细胞化学、流式细胞术、Luminex测定)、以及质谱法。给定样品的总体表达数据可以使用本领域技术人员已知的方法进行标准化以便针对起始材料的不同量、萃取和扩增反应的不同效率进行校正。
[0071]在某些示例性实施方案中，适用于区分对于抗血管生成治疗剂有反应和无反应的癌症类型的生物标志物可以通过以下方式来确定:鉴别出在如使用所述表达检测方法测定的患者数据集中的样品与以上所讨论的患者样品集之间呈现最高程度的变化性的生物标志物。可以使用本领域中已知用于鉴别表达数据中的高度可变的数据点的标准统计方法来鉴别高度可变的生物标志物。例如，将组合的背景和差异过滤器可以用于所述患者数据集。背景过滤器是基于探针集的选择，其中在指定显著性a的探针集处，高于由背景标准偏差0 Bg(由Expression Console软件得到)限定的阈值的表达E和表达差异varE以及标准正态分布ζα的分位点在以下条件下得到保持:
[0072]E>log2((za σ Bg)) ；log2((varE) >2[log2( σ Bg)-E-1og2 (log ⑵)]。
[0073]其中a限定显著性阈值。在某个示例性实施方案中，所述显著性阈值是6.3.10_5。在另一个示例性实施方案中，所述显著性阈值可以是在1.0.10_7至1.0.10_3之间。
[0074]在某些示例性实施方案中，所述高度可变的生物标志物可以进行进一步分析以基于类似的基因表达谱将患者数据集中的样品分成亚型或簇。例如，生物标志物可以基于其表达的上调或下调彼此高度相关的程度来进行聚类。可以使用本领域中已知的不同聚类分析技术。在一个示例性实施方案中，使用了分层合并聚类来鉴别癌症亚型。为了确定每个亚型的生物相关性，可以将每个簇内的生物标志物进一步映射至其对应的基因并且通过交叉参照含有关于与所述基因相关联的生物活性和生物途径的信息的一个或多个基因本体数据库进行注释。在一个示例性实施方案中，针对血管生成、血管系统发育以及免疫反应一般功能项所富集的簇中的生物标志物被分组到推定的血管生成样品组中并且用于表达签名的产生。在另一个示例性实施方案中，针对血管生成、血管系统发育以及免疫反应一般功能性术语而上调和富集的簇中的生物标志物被分入推定的血管生成样品组并且用于表达签名的产生。在另一个示例性实施方案中，针对血管生成、血管系统发育以及免疫反应一般功能性术语而下调和富集的簇中的生物标志物被分入推定的血管生成样品组并且用于表达签名的产生。有关进行生物标志物簇的功能分析的其它细节提供于以下实施例部分中。
[0075]在一个示例性实施方案中，适用于获得用于区别对于抗血管生成治疗剂有反应或无反应的癌症亚型的表达签名的生物标志物包括表1A、表IB或两个表中所列出的那些生物标志物。在另一个示例性实施方案中，适用于获得用于区别对于抗血管生成治疗剂有反应或无反应的癌症亚型的表达签名的生物标志物包括组I (包含SEQ ID N0:632至801)或组11(包含SEQ ID N0:802至974)或两组中所列出的那些生物标志物。这些生物标志物被鉴别为具有了确定患者对治疗剂的反应的预测价值。其表达与对于试剂、更确切地说对于抗血管生成治疗剂的反应或反应的缺乏相关。通过检查肿瘤中一组鉴别的生物标志物的表达，可以确定哪种治疗剂或药剂组合将最可能降低癌症的生长速率。通过检查肿瘤中一组鉴别的生物标志物，还可以确定哪种治疗剂或药剂组合将最不太可能降低癌症的生长速率。通过检查一组生物标志物的表达，因此有可能消除无效的或不当的治疗剂。重要的是，在某些实施方案中，这些确定可以在逐个患者的基础上或在逐个药剂的基础上进行。因此，可以确定具体治疗方案是否可能使特定患者或患者类型受益，和/或具体方案是否应该继续。
[0076]表IA:图1的血管生成和免疫反应簇基因
【权利要求】
1.一种预测受试者对于抗血管生成治疗剂的反应性的方法，所述方法包括: 对从所述受试者获得的患病组织的试验样品中的一种或多种生物标志物的表达水平进行测量以确定样品表达得分，其中所述生物标志物是由表达签名限定； 将所述样品表达得分与阈值表达得分相比较；以及 基于所述样品表达得分是高于还是低于所述阈值表达得分，将所述受试者分类为有反应的或无反应的。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述患病组织是癌症组织。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述癌症是卵巢癌、成胶质细胞瘤或乳癌。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述样品表达值是通过测量每种生物标志物的表达水平并且将其乘以对应权重来确定,其中每种生物标志物的权重是通过所述表达签名来确定。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述表达签名是通过包括以下各项的方法获得的: 从患病组织的样品集中分离总RNA ； 将所述分离的总RNA与微阵列杂交以获得样品表达数据集； 选择在所述微阵列上具有高于限定的显著性阈值的变化性的那些探针以形成初步生物标志物集； 使用聚类算法在所述初步生物标志物集内产生具有类似表达谱的生物标志物簇； 鉴别每个生物标志物簇的生物过程或生物途径； 选择对应于目标生物过程或生物途径的簇；以及 通过使用监督式或无监督式训练算法分析所述患病组织的样品集中所选择的簇中的生物标志物的表达水平来限定表达签名。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述微阵列是转录组阵列，其包括了结合至被核实为在试验样品集中表达的RNA转录物的探针集，所述核实是通过从所述试验样品集中分离RNA转录物并进行测序，并且将所述分离的RNA转录物序列与已知的RNA转录物序列交叉验证来进行，其中所述试验样品集包含与所述患者试验样品相同的组织。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述探针集包括在每个RNA转录物的3’端的300个核苷酸内结合的探针。
8.如权利要求5至7中任一项所述的方法，其中RNA转录物包含编码和非编码转录物，所述编码和非编码转录物包括信使RNA(mRNA)、选择性地剪接的mRNA、核糖体RNA(rRNA)、转运 RNA(tRNA)、小核 RNA(snRNA)、微小 RNA(miRNA)以及反义 RNA。
9.如权利要求5至8中任一项所述的方法，其中所述表达签名是使用PLS分类器、SVM分类器、SDA分类器、或DSDA分类器来限定。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述表达签名是使用PLS分类器来限定。
11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述表达签名包含来自表1A或表IB的两种或更多种基因。
12.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述表达签名包括来自表2A或2B的两种或更多种基因。
13.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述表达签名包括了包含SEQIDNO:632至801(组I)或SEQ ID NO:802至974(组II)的序列的两种或更多种基因。
14.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述表达签名包括ALPK2、BGN,C0L8A1、FAP、FN1、GJB2、INHBA、ITGA5、L0XL1、LUM、MIR1245、MMP2、NKD2、PLAU、RAB31、SFRP2、THBS2、HMP3、VCAN。
15.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述表达签名包括表2A中所列出的基因。
16.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述表达签名包括表2B中所列出的基因。
17.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述表达签名包括了包含组I或组II的序列的基因。
18.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述表达签名包括GJB2、INHBA、THBS2、SFRP2、以及 PLAU。
19.如权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述抗血管生成治疗剂是VEGF途径靶向性治疗剂、血管生成素-TIE2途径抑制剂、内源性血管生成抑制剂、以及免疫调节剂。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述VEGF途径靶向性治疗剂包括贝伐单抗(阿瓦斯汀)、阿柏西普(VEGF捕获剂)、MC-1121B (礼来单抗)、伊马替尼(格列卫)、索拉非尼(蕾莎瓦)、吉非替尼(易瑞沙)、舒尼替尼(索坦)、埃罗替尼、替沃扎尼、西地尼布(雷森汀)、帕唑帕尼(福退癌)、BIBF1120(瓦盖特)、多韦替尼、司马沙尼(索格)、阿西替尼(AG013736)、凡德他尼(扎迪玛)、尼罗替尼(达希纳)、达沙替尼(扑瑞赛)、瓦他拉尼、莫替沙尼、ABT-869、TK1-258或其组合。
21.如权利要求19所述的方法，其中所述血管生成素-TIE2途径抑制剂包括AMG-386、PF-4856884CVX-060, CEP-11981, CE-245677, MED1-3617, CVX_241、曲妥珠单抗(赫赛汀)或其组合。
22.如权利要求19所述的方法，其中所述内源性血管生成抑制剂包括血小板反应蛋白、内皮生长抑素、肿瘤抑素、血管能抑素、抑制蛋白、血管抑素、血管形成抑制素、干扰素α或其组合。
23.如权利要求19所述的方法，其中所述免疫调节剂包括沙利度胺和来那度胺或其组合。
24.一种将受试者诊断为患有癌症或易于发展对于抗血管生成治疗剂有反应的癌症的方法，所述方法包括: 对从所述受试者获得的患病组织的试验样品中的生物标志物的表达水平进行测量以确定样品表达得分，其中所述生物标志物是由表达签名限定； 将所述样品表达值与阈值得分相比较；以及 基于所述表达得分是高于还是低于所述阈值得分，将所述受试者分类为有反应的或无反应的。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述癌症是卵巢癌或成胶质细胞瘤。
26.如权利要求24至25中任一项所述的方法，其中所述参考表达值是通过计算每种生物标志物的表达值并且将其乘以对应权重来确定，其中每种生物标志物的权重是通过所述表达签名来确定。
27.如权利要求24所述的方法，其中所述表达签名是通过包括以下步骤的方法获得的: 从所述患病组织的样品集中分离总RNA ； 将所述分离的总RNA与微阵列杂交以获得一组表达值； 选择在所述微阵列上具有高于限定的显著性阈值的变化性的那些探针以形成初步生物标志物集； 使用聚类算法在所述初步生物标志物集内产生具有类似基因表达谱的生物标志物簇； 鉴别每个生物标志物簇的生物过程或生物途径； 选择对应于目标生物过程或生物途径的簇；以及 通过使用监督式或无监督式训练算法分析所述癌症组织的样品集中所选择的簇中的生物标志物的表达水平来获得所述表达签名，其中所述表达值限定生物标志物集、每种生物标志物的对应权重以及所述参考表达值。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述微阵列是转录组阵列，其包括了结合至被核实为在癌症组织的样品集中表达的RNA转录物的探针集，所述核实是通过从所述癌症组织分离RNA转录物并进行测序，并且将所述分离的RNA转录物序列与已知的RNA转录物序列交叉验证来进行。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述探针集包括在每个RNA转录物的3’端的300个核苷酸内结合的探针。
30.如权利要求27至29中任一项所述的方法，其中RNA转录物包含编码和非编码转录物，所述编码和非编码转录物包括信使RNA (mRNA)、选择性地剪接的mRNA、核糖体RNA(rRNA)、转运 RNA(tRNA)、小核 RNA(snRNA)、微小 RNA(miRNA)以及反义 RNA。
31.如权利要求25至30中任一项所述的方法，其中所述表达签名是使用PLS分类器、SVM分类器、SDA分类器、或DSDA分类器来限定。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述表达签名是使用PLS分类器来限定。
33.如权利要求24至32中任一项所述的方法，其中所述表达签名包括来自表1A或表IB的两种或更多种基因。
34.如权利要求24至32中任一项所述的方法，其中所述表达签名包括来自表2A或表2B的两种或更多种基因。
35.如权利要求24至32所述的方法，其中所述表达签名包括了包含组I或组II的序列的两种或更多种基因。
36.如权利要求24至32中任一项所述的方法，其中所述表达签名包括ALPK2、BGN、C0L8A1、FAP、FN1、GJB2、INHBA、ITGA5、L0XL1、LUM、MIR1245、MMP2、NKD2、PLAU、RAB31、SFRP2、THBS2、HMP3、VCAN。
37.如权利要求24至32中任一项所述的方法，其中所述表达签名包括表2A中所列出的基因。
38.如权利要求24至32中任一项所述的方法，其中所述表达签名包括表2B中所列出的基因。
39.如权利要求24至32中任一项所述的方法，其中所述表达签名包括了包含组I或组II的序列的基因。
40.如权利要求24至32中任一项所述的方法，其中所述表达签名包括GJB2、INHBA、THBS2、SFRP2、以及 PLAU。
41.如权利要求24至40中任一项所述的方法，其中所述抗血管生成剂是VEGF途径靶向性治疗剂、血管生成素-TIE2途径抑制剂、内源性血管生成抑制剂、以及免疫调节剂。
42.如权利要求41所述的方法，其中所述VEGF途径靶向性治疗剂包括贝伐单抗(阿瓦斯汀)、阿柏西普(VEGF捕获剂)、MC-1121B(礼来单抗)、伊马替尼(格列卫)、索拉非尼(蕾莎瓦)、吉非替尼(易瑞沙)、舒尼替尼(索坦)、埃罗替尼、替沃扎尼、西地尼布(雷森汀)、帕唑帕尼(福退癌)、BIBF1120 (瓦盖特)、多韦替尼、司马沙尼(索格)、阿西替尼(AG013736)、凡德他尼(扎迪玛)、尼罗替尼(达希纳)、达沙替尼(扑瑞赛)、瓦他拉尼、莫替沙尼、ABT-869、以及 TK1-258。
43.如权利要求41所述的方法，其中所述血管生成素-TIE2途径抑制剂包括AMG-386、PF-4856884CVX-060, CEP-11981, CE-245677, MED1-3617, CVX_241、曲妥珠单抗(赫赛汀)。
44.如权利要求41所述的方法，其中所述内源性血管生成抑制剂包括血小板反应蛋白、内皮生长抑素、肿瘤抑素、血管能抑素、抑制蛋白、血管抑素、血管形成抑制素、干扰素α ο
45.如权利要求41所述的方法，其中所述免疫调节剂包括沙利度胺和来那度胺。
46.一种确定患有 癌症的受试者的预后的方法，所述方法包括: 对从所述受试者获得的患病组织的试验样品中的一种或多种生物标志物的表达水平进行测量以确定样品表达得分，其中所述生物标志物是由表达签名限定； 将所述样品表达得分与阈值表达得分相比较；以及 基于所述样品表达得分是高于还是低于所述阈值表达得分，将所述受试者分类为有反应的或无反应的。
47.如权利要求46所述的方法，其中所述患病组织是癌症组织。
48.如权利要求47所述的方法，其中所述癌症是卵巢癌、成I父质细胞瘤、或乳癌。
49.如权利要求46至48中任一项所述的方法，其中所述样品表达值是通过测量每种生物标志物的表达水平并且将其乘以对应权重来确定，其中每种生物标志物的每个权重是通过所述表达签名来确定。
50.如权利要求49所述的方法，其中所述表达签名是通过包括以下步骤的方法获得的: 从患病组织的样品集中分离总RNA ； 将所述分离的总RNA与微阵列杂交以获得样品表达数据集； 选择在所述微阵列上具有高于限定的显著性阈值的变化性的那些探针以形成初步生物标志物集； 使用聚类算法在所述初步生物标志物集内产生具有类似表达谱的生物标志物簇； 鉴别每个生物标志物簇的生物过程或生物途径； 选择对应于目标生物过程或生物途径的簇；以及 通过使用监督式或无监督式训练算法分析所述患病组织的样品集中所选择的簇中的生物标志物的表达水平来限定表达签名。
51.如权利要求50所述的方法，其中所述微阵列是转录组阵列，其包括了结合至被核实为在试验样品集中表达的RNA转录物的探针集，所述核实是通过从所述试验样品集分离RNA转录物并进行测序，并且将所述分离的RNA转录物序列与已知的RNA转录物序列交叉验证来进行，其中所述试验样品集包含与所述患者试验样品相同的组织。
52.如权利要求51所述的方法，其中所述探针集包括在每个RNA转录物的3’端的300个核苷酸内结合的探针。
53.如权利要求50至57中任一项所述的方法，其中RNA转录物包含编码和非编码转录物，所述编码和非编码转录物包括信使RNA(mRNA)、选择性地剪接的mRNA、核糖体RNA (rRNA)、转运 RNA (tRNA)、小核 RNA (snRNA)、微小 RNA (miRNA)以及反义 RNA。
54.如权利要求50至53中任一项所述的方法，其中所述表达签名是使用PLS分类器、SVM分类器、SDA分类器、或DSDA分类器来限定。
55.如权利要求46至54所述的方法，其中所述表达签名是使用PLS分类器来限定。
56.如权利要求4 6至55中任一项所述的方法，其中所述表达签名包括来自表1A或表IB的两种或更多种基因。
57.如权利要求46至55中任一项所述的方法，其中所述表达签名包括来自表2A或2B的两种或更多种基因。
58.如权利要求46至55中任一项所述的方法，其中所述表达签名包括了包含SEQIDNO:632至801(组I)或SEQ ID NO:802至974(组II)的序列的两种或更多种基因。
59.如权利要求46至55中任一项所述的方法，其中所述表达签名包括ALPK2、BGN、C0L8A1、FAP、FN1、GJB2、INHBA、ITGA5、L0XL1、LUM、MIR1245、MMP2、NKD2、PLAU、RAB31、SFRP2、THBS2、HMP3、VCAN。
60.如权利要求46至55中任一项所述的方法,其中所述表达签名包括表2A中所列出的基因。
61.如权利要求46至55中任一项所述的方法，其中所述表达签名包括表2B中所列出的基因。
62.如权利要求46至55中任一项所述的方法，其中所述表达签名包括了包含组I或组II的序列的基因。
63.如权利要求46至55中任一项所述的方法，其中所述表达签名包括GJB2、INHBA、THBS2、SFRP2、以及 PLAU。
64.如权利要求46至63中任一项所述的方法，其中所述抗血管生成治疗剂是VEGF途径靶向性治疗剂、血管生成素-TIE2途径抑制剂、内源性血管生成抑制剂、以及免疫调节剂。
65.如权利要求64所述的方法，其中所述VEGF途径靶向性治疗剂包括贝伐单抗(阿瓦斯汀)、阿柏西普(VEGF捕获剂)、MC-1121B (礼来单抗)、伊马替尼(格列卫)、索拉非尼(蕾莎瓦)、吉非替尼(易瑞沙)、舒尼替尼(索坦)、埃罗替尼、替沃扎尼、西地尼布(雷森汀)、帕唑帕尼(福退癌)、BIBF1120 (瓦盖特)、多韦替尼、司马沙尼(索格)、阿西替尼(AG013736)、凡德他尼(扎迪玛)、尼罗替尼(达希纳)、达沙替尼(扑瑞赛)、瓦他拉尼、莫替沙尼、ABT-869、TK1-258或其组合。
66.如权利要求64所述的方法，其中所述血管生成素-TIE2途径抑制剂包括AMG-386、PF-4856884CVX-060, CEP-11981, CE-245677, MED1-3617, CVX_241、曲妥珠单抗(赫赛汀)或其组合。
67.如权利要求64所述的方法，其中所述内源性血管生成抑制剂包括血小板反应蛋白、内皮生长抑素、肿瘤抑素、血管能抑素、抑制蛋白、血管抑素、血管形成抑制素、干扰素α或其组合。
68.如权利 要求64所述的方法，其中所述免疫调节剂包括沙利度胺和来那度胺或其组口 ο
【文档编号】G01N33/50GK103733065SQ201280037298
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2012年6月4日 优先权日:2011年6月2日
【发明者】D·P·哈金, F·帕特森, C·特林德, E·J·奥布赖恩, C·米基, C·古尔利, L·A·希尔, K·E·基廷, J.奥唐纳, M·拜尔斯乔, S·德哈罗, V·普劳特斯基, R·肯尼迪, T·戴维森, A·温特, A·麦克卡维甘 申请人:阿尔玛克诊断有限公司