Nik抑制剂基于细胞的筛选测定的制作方法
【专利摘要】本发明涉及用于筛选和鉴定NIK蛋白质抑制剂的基于细胞的测定。根据本发明的方法允许鉴定抑制与IKK1磷酸化有关的NIK活性的化合物。该测定组合使用经转染的人胚肾（HEK）细胞与使用“受体”珠和“供体”珠的非放射性、均相接近测定。
【专利说明】NIK抑制剂基于细胞的筛选测定
发明领域
[0001] 本发明涉及用于筛选和鉴定NIK蛋白质抑制剂的基于细胞的测定。
_2] 发明背景
转录因子的核因子κΒ (NF-KB)家族包含结构上相关蛋白质的集合，所述蛋白质参与多种生物学过程，包括免疫应答、炎症、细胞死亡和存活(Thu Y.M.和Richmond A.Cytokine & Growth Factor Rev 2010, 21:213-226)。
[0003]哺乳动物NF-K B家族包含五个成员，包括p65 (也已知为RelA)、p50 (也已知为NF-κ BI), P52 (也已知为NF-kB2)、RelB和c-Rel，其通过与κ B增强子结合形成能够调节多种下游基因靶的转录和表达的几种二聚复合物。典型形式的NF-κ B由ρ50/ρ65异二聚体组成。只要此类复合物与K B蛋白质的抑制剂(I K BS)的成员特别是I K Ba结合，它通常就以失活形式在细胞质中隔离(Sun S.C., Cell Res 2011，21:71-85)。
[0004]目前已知控制NF-K B活化的两个主要途径即经典和非经典途径。众所周知的经典NF-κ B途径通过广泛范围的细胞外刺激触发，所述细胞外刺激包括促炎细胞因子例如TNFa、IL-1 β、IL-6和⑶40L。这个途径一般通过κ B激酶三聚复合物激酶(IKK a、-β和-Y)的抑制剂介导,所述K B激酶三聚复合物激酶使I K B成员磷酸化，依次又导致I K BS通过蛋白酶体的遍在蛋白化和完全降解，并且允许释放的RelA/p50异二聚体易位到细胞核内，以起始基因转录(Hayden M.S.等人，Cfe77 2008, 132:344-362 ；Vallabhapurapu
S.等尺,Annu Rev Immunol 2009, 27:693-733)。
[0005]除了众所周知的经典途径外，还存在非经典途径。这个可选NF-κ B活化途径通过一组肿瘤坏死因子配体(TNFL)家族成员诱导，所述家族成员例如⑶40配体(⑶40L)、B细胞活化因子(BAFF)或淋巴毒素β受体(LTiiR)的配体。实验证据暗示这个途径在调节许多生物学过程中是重要的，所述生物学过程例如次级淋巴器官发育、B细胞存活和成熟以及涉及适应性免疫的特异性趋化因子的诱导(Dejardin E., Biochem Pharmacol 2006,72:1161-1179)。
[0006]这个途径涉及通过诱导plOO前体蛋白质经由IKKa和NF-κ B诱导激酶(NIK)蛋白质加工为成熟P52的RelB/p52复合物活化。两种激酶都使plOO磷酸化，所述plOO含有I K B样C末端部分且因此充当NF-K B抑制剂，导致plOO蛋白质的部分蛋白酶解，以获得活性形式p52。plOO的加工因此作用于生成p52且诱导RelB/p52异二聚体的核易位(CoopeH.J.等人，万遍0 / 2002，15:5375-5385)。
[0007]使用显性失活突变体的过表达，将NIK首先鉴定为介导TNFa和IL-1受体下游的近端信号传递的激酶，并且NIK的激酶活性是这个过程所必需的(Malinin N.L.等人，Nature 1997，385:540-544)。NIK 还通过其他受体例如 CD27、CD30、CD40、LT β R 和 BAFFR介导刺激。当过表达时，NIK导致NF- K B的活化，因此保护细胞不经历TNF α诱导的细胞凋亡。
[0008]NIK已证实与IKKa和ΙΚΚβ相互作用且活化IKK a和ΙΚΚβ。然而,NIK使IKK a磷酸化至比ΙΚΚβ更大的程度。因此，NIK充当负责多种细胞因子受体的近端信号传递的上游IKK复合物激酶。
[0009]IKKa (也已知为IKK1)是NIK的优先底物。NIK直接使IKK a在Ser-176上磷酸化，并且这个残基突变为丙氨酸阻止IKK a的NIK活化，因此破坏来自IL-1和TNF a刺激的信号(Ling L.等k，Proc Natl Acad Sci 1998，95:3792-3797)。
[0010]从与IKKa的优先相互作用可以推断NIK是对于IKKa比对于ΙΚΚβ更重要的激酶，并且NIK仅是非经典途径所必需的。然而，取决于诱导物和细胞类型，NIK的确在经典和非经典NF- K B途径中都起作用。来自使用具有NIK敲除或具有天然存在的NIK缺损突变体、淋巴发育不全(aly/aly)的小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)的研究的数据支持这个观点(Shinkura R.等人，Tfeiare Genetics 1999, 22:74-77)。
[0011]NIK是PlOO至p52的加工所必需的，因此证实其在非经典途径中的作用(XiaoG.等)κ，Mol Cell 2001, 7:401-409)。NIK或IKK α的激酶活性不是plOO对两种激酶募集所必需的，然而，它是发生配体诱导的蛋白酶解所必需的(Xiao G.等)\，J Biol Chem2004，279:30099-30105)。令人惊讶的是，NIK不是plOO至p52的组成性加工所必需的。NIK控制plOO至p52加工的机制是通过其稳定性。在用配体例如⑶40L或BAFF刺激后，使基础翻译的NIK稳定，以诱导plOO至p52加工(Qing G.等人，J Biol Chem 2005，280
(49): 40578-82)。
[0012]总之，NIK是在经典途径中起作用的激酶，但仅是响应特定配体的NF- K B活化所必需的。这个选择性需求的生理学意义仍然是难以捉摸的。可能，NIK位于NF-K B的经典和非经典途径的十字路口，维持这两个途径之间的正和负调节平衡。例如，NIK活化经典途径，并且因此可能诱导PlOO (NF-kB家族的第四个I K B)的产生(负反馈机制)。同时，NIK是负责加工这种I K B的激酶，从而使得它将释放NF- K B异二聚体例如RelA/p50，以活化基因转录(正反馈机制)。因此已变得非常明确的是NIK在NF- K B活化中起动态作用，协调NF-κ B的经典和非经典调节之间的复杂平衡。
[0013]由于NIK在调节与许多疾病相关的并特别是在炎性/自身免疫疾病中的生物学过程中可以具有的重要作用，已报道了一系列对于NIK的生物化学和基于细胞的测定。
[0014]Ling L.等人GdToc Natl AcacI Sci 1998，95:3792-3797)公开了 用编码FLAG-NIK-wt和FLAG-1KK- α (激酶失效)的表达质粒瞬时转染的HEK细胞的使用。在36小时转染后，使免疫纯化的蛋白质与Y - [32P] -ATP温育，通过SDS-PAGE分辨，并且通过放射自显影术分析。这些研究显示发生FLAG-1KK- α (激酶失效)的FLAG_NIK_wt特异性磷酸化。使用 FLAG-1KK- a (kd) -S176A、FLAG-1KK- a (kd) -T179A 和 FLAG-1KK- a (kd) -S180A作为底物执行进一步实验，并且这些显示主要NIK介导的磷酸化位点是ΙΚΚ-α (kd)的Ser-176。这个测定具有检测FLAG-1KK-a (kd)的所有磷酸化事件的潜力，并且因此不明确的是当蛋白质表达和另外的信号传递事件已发生时，FLAG-1KK-a (kd)的Ser-176的特异性磷酸化在36小时转染过程中已发生至何种程度，也不明确的是这种方法是否顺应高通量抑制剂发现。
[0015]US 6,841,556公开了一系列卩比唑并异喹啉衍生物在多种体外测定系统中抑制NIK的能力。然而，未提供体外NIK测定的细节。
[0016]W0/2009/158011公开了基于化学发光(CL)和均相时间分辨荧光(HTRF)形式的一系列体外NIK自磷酸化测定。两种形式都利用仅含有催化结构域的截短形式的NIK，与全长蛋白质相比较，所述截短形式的NIK具有大量增加的自磷酸化活性。将NIK蛋白质在杆状病毒表达系统中表达,纯化且生物素化。对于CL测定，使50 nM生物素化的NIK与化合物和50 μΜ ATP —起在缓冲液中在室温下温育I小时，所述缓冲液含有20 mM Tris-HCl pH
7.5,40 mM MgCljP 1.5 mM DTT。随后将反应混合物固定到链霉抗生物素蛋白包被的板上，并且用抗磷酸丝氨酸/苏氨酸抗体和辣根过氧化物酶缀合的二级抗体检测NIK的自磷酸化活性。
[0017]对于HTRF测定，在20、100、200、或500 μΜ ATP的存在下，使10 nM NIK与化合物一起在缓冲液中在室温下温育2小时，所述缓冲液含有20 mM HEPES pH 7.5,20 mM MgCl2,
0.2%吐温20和I mM DTT0通过添加5 mM EDTAU2.5 ng/ml Eu标记的抗磷酸丝氨酸/苏氨酸抗体和I nM链霉抗生物素蛋白-Alexa647停止反应。在2小时温育后，在615 nm和665 nm处测量荧光，同时通过665 nm和615 nm之间的信号比计算特异性酶促活性。因为这些测定利用截短的NIK蛋白质，所以抑制剂筛选将仅检测阻止这个事件的分子。
[0018]Mortier, J.等XXBioorg & Med Chem Lett 2010, 20:4515-4520)公开了使用ProQinase 33PanQinase技术的体外NIK测定的使用。NIK在Sf9昆虫细胞中作为人重组GST融合蛋白表达，并且通过使用GSH琼脂糖的亲和层析纯化。NIK的纯度通过SDS-PAGE/银染色检查，并且身份通过质谱法验证。NIK活性通过将33P掺入人工底物RBER-CHKtide内进行测量，所述RBER-CHKtide是由下述组成的在大肠杆菌中表达的人工融合蛋白:通过凝血酶切割位点与由氨基酸S773-K928组成的人成视网膜细胞瘤蛋白质RBl片段分隔的N末端 GST 标签，随后为 11 个 Arg 残基(ER)和肽序列 KKKVRSGLYRSPSMPENLNRPR (CHKtide)0因为这种测定利用人工底物，所以不明确的是它在抑制剂筛选中的使用是否将允许检测将是生理学相关的分子。
[0019]Hassan, N.J.等)\SBiochem J 2009, 419:65-73)公开了使用杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞以监控FLAG-NIK-wt介导的其下游底物FLAG-1KK a -(kd)的Ser-176/Ser-180的磷酸化。这种测定以在384孔微量滴定板中的时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET)形式，其利用针对IKKa的Ser-176/Ser_180的特异性抗体。这个测定用于针对聚焦激酶的小分子文库(kinase focussed small molecule library)的筛选目的。从筛选活动鉴定许多表观NIK抑制剂，并且进一步分析其选择，其中之一显示是非细胞毒性的，在荧光偏振测定中与NIK直接相互作用，并且抑制淋巴毒素诱导的p52易位至细胞核。尽管这提供了昆虫细胞系统能够鉴定真正的NIK抑制剂的有力支持，但细胞背景并非人。
[0020]存在鉴定NIK抑制剂的强大和生理学相关测定的需要。希望此类测定能够使用目前可用的分析仪器容易且快速地实施。迄今为止的方法尚不能产生具有使用IKKa作为底物的体外活性的全长NIK酶。尽管截短形式的NIK能够在经历自磷酸化的昆虫细胞中生成，但这些变体不使IKKa磷酸化。因此，不确定的是这种测定中的抑制剂是否具有体内关联性。
[0021]缺乏强大的、NIK特异性测定是针对这个潜在重要的疾病靶的已知抑制剂稀少的主因；迄今为止仅报道少数系列的此类化合物(Mortier J.等k，Bioorg & Med Chem Lett2010, 20:4515-4520 ;W0/2009/158011)。例如，首个要求保护的NIK抑制剂目前已知影响NF- K B信号传递级联中其他地方的靶，暗示使用基于细胞的报道分子测定发现这些化合物。[0022]发明概沭
本发明的目的是提供用于筛选和鉴定NIK抑制剂，即抑制NIK活性的候选分子的基于细胞的测定。
[0023]根据本发明的方法允许鉴定抑制与IKKl磷酸化有关的NIK活性的化合物。该测定组合使用经转染的人胚肾(HEK)细胞与使用“受体”珠和“供体”珠的非放射性、均相接近测定。HEK细胞用至少一种表达载体进行转染，所述表达载体含有编码全长人NIK蛋白质的DNA和编码突变形式的IKKl的DNA。突变的IKKl蛋白质底物含有K44A突变，也命名为KD(激酶失效)突变。K44A突变致使IKKl (全长NIK天然底物蛋白质)不能在Ser-176残基处自磷酸化(Nakano H.等k，Proc Natl Acad Sci 1998，95:3537-3542)。经转染的 HEK 细胞在允许NIK和突变的IKKl蛋白质产生的条件下培养。因为NIK使IKKl在Ser-176残基处特异性磷酸化，所以IKKl-KD突变蛋白质作为底物的使用导致仅NIK介导的底物磷酸化。IKKl-KD磷酸化的抑制因此允许鉴定对NIK具有抑制作用的化合物。
[0024]在根据本发明的测定中，将含有NIK和IKKl-KD的经转染的HEK细胞在孔板中培养。细胞培养优选在接近于37°C的温度在5% CO2的存在下实施合适时间段。选择温度以促进待测试化合物(候选分子)穿透入经转染的HEK细胞内，以及维持有活力的HEK细胞。随后通过使用基于珠的发光接近系统检测候选分子抑制NIK介导的IKKl-KD磷酸化的能力。
[0025]在基于珠的发光接近系统中，通过固定至这些珠的结合配偶体的生物分子相互作用，使试剂包被的(微)珠的供体和受体对达到接近。
[0026]受体与供体珠的接近依赖与它们结合的分子的生物学相互作用。最常见的测定通过将一个结合配偶体捕获到供体珠上并且另一个配偶体捕获到受体珠上进行构建。当配偶体通过与相同底物相互作用达到接近时，电磁能在激光激发后从供体转移到受体珠，并且产生信号。随后通过任何合适设备例如Envision 2103 Multilabel Reader检测信号。此类技术的优点是极高灵敏度、极低信号背景、高信号/背景比、小型化和成本效益。
[0027]本发明的测定允许实现候选分子筛选的简单、灵敏且快速的方法，以鉴定针对作为底物的IKKl的NIK抑制剂。在本发明的上下文中，术语“测定”和“方法”可互换使用。
[0028]缠H
—HEK:人胚肾
—Sf9 细胞:草地贪夜蛾)细胞 -fl:全长 -KD/kd:激酶失效 -K44A: Lys-44-Ala突变体(激酶失效)
-NIK: NF-K B诱导激酶 -NIK-fl:全长NF-K B诱导激酶 -1KK- α: NF- K B激酶亚基α的抑制剂 -1KK- β: NF- K B激酶亚基β的抑制剂 -1KKl-KD:激酶失效的全长IKK-α
-FLAG-1KK a (kd):激酶失效的FLAG标签化的IKK-α
-FLAG-1KK a (kd) -S176A:激酶失效的 FLAG 标签化的 IKK α Ser_176_Ala 突变体 -FLAG-1KK a (kd)_T179A:激酶失效的 FLAG 标签化的 IKK a Thr_179_Ala 突变体 -FLAG-1KK a (kd) -S180A:激酶失效的 FLAG 标签化的 IKK α Ser-180-Ala 突变体 -hNIKl-fl-wt-pFlagN:野生型FLAG标签化的全长人NIK质粒 -hNIKl-f 1-wt-FlagN:野生型全长FLAG标签化的人NF-κ B诱导激酶 -1KKl-KD-pFlagN:激酶失效的FLAG标签化的IKK-1质粒 -1KKl-KD-FlagN:激酶失效的FLAG标签化的IKK-α
—AlphaScreen:放大发光接近均相测定(Amplified Luminescent ProximityHomogeneous Assay)
—AlphaScreen SureFire IKK α (憐酸-Ser-176/180) Assay Kit:定量细胞中Ser-176/180磷酸化的IKK α蛋白质的AlphaScreen试剂盒—化合物A涉及图19 (A)中所示的分子—化合物B涉及图19 (B)中所示的分子-化合物C涉及图19 (C)中所示的分子。
[0029]附图描沭
图1.(A)在24小时后关于单一、双重和未经转染的HEK细胞(hNIKl-fl-wt-pFlagN和 IKKl-KD-pFlagN 质粒)的 AlphaScreen SureFire IKK α (憐酸-Serl76/180)读出；(B)与(A)—样，但为48小时转染。AlphaScreen信号仅当HEK细胞用hNIKl-f 1-wt-pFlagN和IKKl-KD-pFlagN质粒双重转染时才观察到。
[0030]图2.用 hNIKl-f Ι-wt-pFlagN 和 IKKl-KD-pFlagN 质粒双重转染的 HEK 细胞的免疫细胞化学。
[0031]图3.(A)对于用 hNIKl-fl-wt-pFlagN 和 IKKl-KD-pFlagN 质粒 JetPEI 双重转染24小时的HEK细胞，关于磷酸化的IKKl-KD-FlagN相对于总DNA的AlphaScreen信号，(B)对于用hNIKl-fl-wt-pFlagN和IKKl-KD-pFlagN质粒JetPEI双重转染24小时的HEK细胞，关于以0.0625 - 10 μδ/πι1总DNA的化合物A的剂量应答。
[0032]图4.使用双重 jetPEI hNIKl-fl-wt-pFlagN 和 IKKl-KD-pFlagN转染的 HEK 细胞的关于化合物的剂量应答曲线。(A)实验1:在24小时时关于磷酸化的IKKl-KD-FlagN的AlphaScreen信号；(B)实验1:在48小时时关于憐酸化的IKKl-KD-FlagN的AlphaScreen信号；(C)实验2:在24小时时关于磷酸化的IKKl-KD-FlagN的AlphaScreen信号；(D)使用CellTiter-Glo测定的细胞生存研究。
[0033]图5.经转染的HEK细胞的DMSO耐受。
[0034]图6.在AlphaScreen检测试剂添加后3和16小时，AlphaScreen信号稳定性评估。
[0035]图7.(A)在384孔微量滴定板中基于HEK细胞的测定中，中、低和高对照的一般表现；(B)关于384孔微量滴定板的352个DMSO孔的统计学。
[0036]图8.(A)来自n=l和n=2基于HEK细胞的测定研究的关于14块微量滴定板的Z’。对于9块板Z’ >0.5，并且对于10块微量滴定板Z’ >0.4; (B)关于微量滴定板4的原始数据；(C)关于微量滴定板5的原始数据。第I和2列以及第23和24列是对照列；第3 - 22列是用于测试化合物的列。
[0037]图9.关于基于HEK细胞的测定的双份筛选数据集(n=l和n=2)的关联。高、低和中对照群体位于预期位置中。正方形A:仅在n=2数据集中显示>50%抑制的7种化合物；正方形B:在n=l和n=2数据集中显示>50%抑制的13种化合物；正方形C:仅在n=l数据集中显示>50%抑制的I种化合物。
[0038]图10.来自基于HEK细胞的测定的2，240种测试化合物筛选输出的可视化。板名称(X轴)、抑制(n=l) (Y轴)和抑制(n=2) (Z轴)。
[0039]图11.在不同％抑制截断值时，基于HEK细胞的测定的命中率的计算。
[0040]图12.来自由基于HEK细胞的测定鉴定的21个命中的CellTiter-Glo测定的输出。
[0041]图13.(A)来自基于HEK细胞的测定的21个命中和来自CellTiter-Glo测定的输出的关联。在21种化合物中，5种给出在基于HEK细胞的测定和CellTiter-Glo测定之间的>50%抑制窗；(B)来自图8-12的结果概述。
[0042]图14.在基于HEK细胞的测定中显示出NIK抑制>50%和细胞毒性〈50%的概况的9种化合物的结构。
[0043]图15.以(A)表格形式和(B)图形形式的关于来自n=3基于HEK细胞的测定的7块微量滴定板的Z’。
[0044]图16.(A)关于基于HEK细胞的测定的n=2和n=3筛选输出的关联；(B)与HEK细胞测定和CellTiter-Glo细胞生存测定中的21个命中有关的结果(n=l、n=2和n=3)概述。
[0045]图17.(A)- (G)经由Z’、测定板上的命中定位(在至少一个测试场合下产生>50%抑制的化合物)和命中重复性，分析来自基于HEK细胞的测定的所有21块测定微量滴定板(n=l、n=2 和 n=3)。
[0046]图18.在筛选测定中使用的测试化合物，高、低和中对照的布局。
[0047]图19.(A)和(B)报告为NIK抑制剂的化合物的实例(W0 2009/158011) ; (C)报告为NIK抑制剂的化合物(US 6，841，556)。
[0048]发明详沭
本发明涉及使用经转染的HEK细胞的基于细胞的测定，以鉴定抑制NIK介导的IKKl-KD磷酸化的化合物。测试化合物在抑制NIK介导的IKKl-KD磷酸化中的效力可以在标准微量滴定板形式中进行测量。在优选实施方案中，测定可以在高通量筛选(HTS)配置中实施。
[0049]术语“NIK介导的磷酸化”指NIK蛋白质使底物磷酸化的能力。NIK使IKKl蛋白质底物特异性在Ser-176残基处磷酸化。在本发明的上下文中，NIK底物是具有K44A突变的IKKl蛋白质，也称为IKK1-KD。此类突变底物的使用致使IKKl不能在Ser-176残基处自磷酸化。
[0050]当在本发明中使用时，“基于HEK细胞的测定”指在根据本发明的方法中使用的测定系统，其使用含有NIK及其底物IKKl-KD的人胚肾(HEK)细胞，用于分析加入所述HEK细胞中的物质的效应。
[0051]根据本发明，“经转染的HEK细胞”指含有编码全长人NIK蛋白质的DNA和编码全长NIK底物IKKl-KD蛋白质的DNA的人胚肾细胞。本发明的测定组合使用经转染的HEK细胞与使用“受体”珠和“供体”珠的非放射性、均相接近测定。
[0052]在优选实施方案中，通过用含有编码全长人NIK蛋白质的DNA的第一种表达载体和含有编码全长NIK底物IKKl-KD蛋白质的DNA的第二种表达载体转染所述HEK细胞，将编码全长人NIK蛋白质的DNA和编码IKKl-KD蛋白质的DNA插入HEK细胞内。
[0053]在可选实施方案中，可以用含有编码全长人NIK蛋白质的DNA和编码全长NIK底物IKKl-KD蛋白质的DNA的单一表达载体转染HEK细胞。
[0054]为了转染HEK细胞，可以使用本领域已知的任何合适的方法。在优选实施方案中，使用jetPEI转染试剂。
[0055]HEK细胞的转染可以是瞬时或稳定的。在一个实施方案中，转染是瞬时的。
[0056]AlphaScreen是使用“受体”珠和“供体”珠的非放射性、均相接近测定的合适实例。首字母缩略词ALPHA代表放大发光接近均相测定。AlphaScreen是以微板形式用于研究生物分子相互作用的基于珠的检测系统。在珠上捕获的分子的结合导致从一粒珠到另一粒的能量转移，最终产生发光/荧光信号。每个AlphaScreen测定含有两种珠类型，供体珠和受体珠。两种珠类型都用使非特异性结合和自聚集降到最低的水凝胶包被，并且提供用于将生物分子缀合至珠表面的活性醛基。
[0057]与用于鉴定抑制NIK介导的磷酸化活性的候选化合物的目前测定相比较，在本发明的方法中使用经转染的HEK细胞是更生理学相关的，这是因为它使用人细胞背景。
[0058]到FLAG序列的添加不干扰NIK蛋白质或充当NIK底物的IKKl-KD蛋白质的活性的程度，编码NIK和/或IKKl-KD的DNA可以含有另外的N末端FLAG标签。
[0059]将根据本发明的经转染的HEK细胞在任何合适培养基中培养合适时间段。示例性培养基是具有10% FBS的DMEM。将经转染的HEK细胞在5% CO2和37°C +/- 2°C下培养，其是允许用于待测试的化合物穿透细胞，并且如果有活性，则抑制NIK活性以及维持活细胞的最佳条件的温度。
[0060]该测定优选以微量滴定板形式执行，从而使得可以同时评价多种测试化合物或以不同浓度的相同测试化合物。在优选实施方案中，使用384孔微量滴定板。在可选实施方案中，可以使用1536孔微量滴定板。
[0061]将待测试的化合物溶解于合适溶剂例如二甲基亚砜(DMSO)中，并且加入经转染的HEK细胞在其中培养的培养基。随后使细胞与测试化合物在37°C +/- 2°C和5% CO2下优选温育24小时。本领域技术人员可以理解，在本发明的测定中设定的测试化合物与经转染的HEK细胞温育的条件促进待测试化合物通过细胞膜的被动扩散。此类扩散在20-37°C的范围上显著改变，并且最大扩散是在37°C下(Garrick R.A.等人，Am J Physiol 1982，243:C285-C292)。当涉及主动转运时，扩散对温度的依赖性甚至更显著。此类培养条件代表相对于用于鉴定NIK抑制剂的先前筛选方法,特别是相对于一般在22-25°C下实施的基于昆虫Sf9细胞的测定的显著改善。
[0062]在一个实施方案中，除了与测试化合物一起培养的经转染的HEK细胞外，在微量滴定测定板中还包括仅含有经转染的HEK细胞而不含测试化合物的孔。此类孔提供阴性对照，其可以用于测定在细胞暴露于测试化合物后NIK活性的抑制。
[0063]在进一步的实施方案中，在微量滴定测定板中包括仅含有在已知抑制NIK介导的底物磷酸化的化合物的存在下培养的经转染的HEK细胞的另外的孔。含有经转染的HEK细胞连同已知为NIK抑制剂的化合物的孔提供用于NIK活性抑制的阳性对照。
[0064]与阴性对照相比较，在经转染的HEK细胞暴露于测试化合物后NIK活性的抑制或减少指示测试化合物是NIK抑制剂。使NIK活性减少至阳性对照水平的测试化合物预期为有效的NIK抑制剂。
[0065]在测试化合物与经转染的HEK细胞培养物温育合适时间段后，从孔中去除细胞培养基，并且裂解经转染的HEK细胞。为了裂解经转染的HEK细胞，将裂解缓冲液加入含有经转染的HEK细胞的孔，从而获得来自经转染的HEK细胞的细胞裂解产物。
[0066]为了鉴定能够抑制NIK介导的IKKl-KD蛋白质磷酸化的候选化合物，依照本发明使用基于珠的发光接近检测系统(luminescent proximity detection system),例如AlphaScreen 系统。
[0067]AlphaScreen是以微量滴定板形式用于研究生物分子相互作用的基于珠的、非放射性放大发光接近均相测定。为了理解信号如何产生，技术人员必须从珠的理解开始。每个AlphaScreen测定含有两个珠类型，供体珠和受体珠。每一珠类型含有化学品的不同组合，这是AlphaScreen技术的关键要素。供体珠含有光敏剂,酞菁,其在以680 nm的激光照射后将环境氧转换为激发形式的O2，单态氧(1O2)15如同其他激发分子，单态氧在回落到基态前具有有限寿命。在其4微秒半衰期内，单态氧可以在溶液中扩散约200 nm。如果受体珠在那附近，则能量从单态氧转移到受体珠内的二甲基噻吩衍生物，随后以在520 - 620 nm处的光产生而终结。在不存在受体珠的情况下，单态氧下降到基态且不生成信号。
[0068]第一类珠被称为“受体珠”。受体珠是直径约250 nm的基于胶乳的珠。受体珠含有二甲基噻吩衍生物和荧光团，并且缀合至可以与结合配偶体相互作用的分子。“结合配偶体”是使受体珠和第二种类接触的分子，例如如与蛋白质特异性结合的抗体。将分子缀合的受体珠和结合配偶体用于形成混合物，将其加入样品中以分析。
[0069]根据本发明，受体珠的结合配偶体是抗磷酸-Ser-176/180抗体。此类抗体识别IKK1-KD。具体而言，该抗体与IKKl-KD蛋白质的Ser-176残基的磷酸化形式结合。还根据本发明，缀合至受体珠的分子是蛋白A。蛋白A能够与抗磷酸-Ser-176/180抗体的Fe部分特异性结合。当混合在一起时，蛋白A缀合的受体珠和抗磷酸-Ser-176/180抗体因此将产生受体复合物(下文也指定为“第一混合物”)。
[0070]还根据本发明，“第一混合物”是由蛋白A包被的珠和抗磷酸-Ser-176/180抗体构成的混合物。在本方法中，将第一混合物加入且在24°C下与得自经转染的HEK细胞的细胞裂解产物温育2小时，所述经转染的HEK细胞在待测试NIK抑制剂活性的候选化合物的存在下培养。
[0071]第二类珠被称为“供体珠”。供体珠也是直径约250 nm的基于胶乳的珠。供体珠含有光敏剂，酞菁，其在以680 nm的激光照射后将环境氧转换为激发形式的O2，单态氧。供体珠缀合至几类分子，以形成分子包被的供体珠。此类缀合允许供体珠与结合配偶体的相互作用。此类结合配偶体是使供体珠和第二种类接触的分子。结合配偶体可以是例如特异性识别第二种类且通过特异性相互作用与分子包被的供体珠相互作用的抗体。将分子缀合的供体珠和结合配偶体用于形成混合物，将其加入样品中以分析。
[0072]根据本发明，供体珠的结合配偶体是生物素化的抗体。此类生物素化的抗体特异性识别IKK1-KD。具体而言，生物素化的抗体在不包含Ser-176残基的蛋白质部分中与IKKl-KD蛋白质特异性结合。还根据本发明，缀合至供体珠的分子是链霉抗生物素蛋白。链霉抗生物素蛋白能够识别抗IKKl-KD生物素化的抗体，并以高亲和力与抗IKKl-KD生物素化的抗体特异性相互作用。当混合在一起时，链霉抗生物素蛋白包被的供体珠和抗IKKl-KD生物素化的抗体因此将产生供体复合物(下文也指定为“第二混合物”)。
[0073]还根据本发明，“第二混合物”是由链霉抗生物素蛋白包被的供体珠和结合IKKl-KD蛋白质的生物素化的抗体构成的混合物。在本方法中，将第二混合物加入且在24°C下与得自经转染的HEK细胞的裂解产物温育I小时，所述经转染的HEK细胞在待测试NIK抑制剂活性的候选化合物的存在下培养，其中第一混合物先前已加入。
[0074]根据本发明的方法，在与第一混合物和第二混合物一起温育后，用以680 nm的高强度激光器激发得自经转染的HEK细胞的细胞裂解产物，所述激光器在通过供体珠上存在的酞菁光敏剂将环境氧转换为更激发的单态后，诱导单态氧在链霉抗生物素蛋白包被的供体珠表面上的形成。供体珠生成约60，000个单态氧分子，导致极大放大的信号。
[0075]如果受体珠在供体珠的附近，则能量从单态氧转移到受体珠内的二甲基噻吩衍生物，并且在520 - 620 nm范围内产生光。如果受体珠未与供体珠紧密接近，则不转移能量，并且因此不生成信号。
[0076]在不能抑制NIK介导的IKKl-KD蛋白质磷酸化的测试化合物的存在下，经转染的HEK细胞裂解产物将含有IKKl-KD蛋白质的Ser-176磷酸化形式。因此，第一混合物中存在的抗磷酸-Ser-176/180抗体将与IKKl-KD相互作用，并且受体复合物将与供体复合物紧密接近，从而细胞裂解产物被激光激发后，在AlphaScreen检测系统中产生可检测信号。
[0077]在能够抑制或减少NIK介导的IKKl-KD蛋白质磷酸化的测试化合物的存在下，经转染的HEK细胞裂解产物将含有更少的IKKl-KD蛋白质的Ser-176磷酸化形式。因此，更少的第一混合物中存在的抗磷酸-Ser-176/180抗体将与IKKl-KD相互作用，并且减少量的受体复合物将与供体复合物紧密接近，伴随细胞裂解产物被激光激发后，在AlphaScreen检测系统中的可检测信号随之减少或不存在。
[0078]为了分析AlphaScreen分析的强大性，计算Z’值是有用的。Z’值是允许比较和评估使用不同试剂、形式和仪器的不同测定技术的性能的无量纲参数。Z’值考虑两个计数群体的标准差，并且因此给出比单独的信号/背景比更有用的测定信号窗的估计。一般地，大于0.5的Z’值视为测定的强大性的良好指数。
[0079]—旦已检测到具有表观NIK抑制活性的候选分子，使其经历细胞毒性“反筛选(counterscreen)”测定就可以是合适的，其可以帮助区分这样的分子与真正的抑制剂，所述分子由于细胞毒性效应，或因为它们通过其他方法干扰重组NIK和底物蛋白质的表达，而显示抑制活性(表观抑制剂(apparent inhibitors))。合适的测定可以是CellTiter-Glo细胞生存测定。
[0080]因此本文提供的是用于鉴定抑制NIK活性的化合物的方法，其包括:
(a)提供在培养基中含有编码NIK的DNA和编码IKKl-KD的DNA的HEK细胞(下文“经转染的HEK细胞”)；
(b)在37°C+/- 2°C的温度下在5% CO2的存在下，使所述经转染的HEK细胞连同和不连同待测试的候选分子温育24小时；
(C)去除培养基；
(d)裂解细胞；
(e)将受体复合物随后将供体复合物加入细胞裂解产物中；
Cf)用激光照射激发细胞裂解产物，和(g)使用基于珠的发光接近检测系统，测量细胞裂解产物被激光激发后产生的信号，
其中得自细胞裂解产物的信号的减少或不存在指示NIK介导的IKKl-KD磷酸化的抑制，所述细胞裂解产物来源于在测试化合物的存在下培养的经转染的HEK细胞，并且其中受体复合物包含分子包被的珠和与IKKl-KD蛋白质结合的结合配偶体，并且供体复合物包含分子包被的珠和与IKKl-KD蛋白质结合的结合配偶体。
[0081]在可选实施方案中，与得自来源于在不存在测试化合物的情况下培养的经转染的HEK细胞的细胞裂解产物的信号相比较，得自来源于在测试化合物的存在下培养的经转染的HEK细胞的细胞裂解产物的信号的减少指示NIK介导的IKKl-KD磷酸化的减少。
[0082]在优选实施方案中，通过用含有编码NIK的DNA的第一种表达载体和含有编码IKKl-KD的DNA的第二种表达载体转染HEK细胞，将编码NIK的DNA和编码IKKl-KD的DNA插入所述HEK细胞内。
[0083]在一个实施方案中，受体复合物的分子包被的珠是蛋白A包被的珠，并且受体复合物的结合配偶体是与IKKl-KD的Ser-176残基的磷酸化形式特异性结合的抗体。
[0084]在一个实施方案中，供体复合物的分子包被的珠是链霉抗生物素蛋白包被的珠，并且供体复合物的结合配偶体是与IKKl-KD蛋白质结合的生物素化的抗体。
[0085]在一个实施方案中,基于珠的发光接近检测系统是AlphaScreen检测系统。
[0086]在一个实施方案中，该方法进一步包括在细胞毒性测定中测试显示NIK抑制活性的那些候选分子的步骤，从而允许区分具有与细胞毒性效应相关的NIK抑制剂活性的候选分子与具有不与细胞毒性效应相关的NIK抑制剂活性的候选分子。
实施例
[0087]实施例1:试剂证实初步研究 材料与方法
使用 jetPEI 转染试剂(PEQLAB Biotechnologie GmbH)，用 hNIKl-f 1-WT-pFlagN 和 /或 IKKl-KD-pFlagN质粒(由 David Wallach 教授,Weizmann Institute, Israel 友情提供)双重或单一转染HEK细胞(HEK293A，Invitrogen R705-07)。转染对照包括缓冲液和未经转染的对照。使用来自jetPEI供应商的方案，对于每一条件(单一转染、双重转染或未经转染的对照)，在含有10 ml培养基的T75烧瓶中以20 μg总DNA转染约IxlO6 HEK细胞。细胞随后在37°C和5% CO2下温育24小时和48小时。将细胞洗涤，用胰蛋白酶消化且分配到384 孔微量滴定板(25 μ?, 5，000 细胞 / 孔)内。使用 AlphaScreen SureFire IKKa (磷酸-Ser-176/180) Assay Kit (PerkinElmer,目录号 TGRKAS10K)连同 AlphaScreen IgGDetection Kit (蛋白 A) (PerkinElmer,目录号 6760617M)，进行 NIK 介导的 IKK1-KD 蛋白质磷酸化的检测。在培养基去除和HEK经转染的细胞裂解后，加入5 μ?/孔受体混合物(含有抗磷酸-Ser-176/180抗体和蛋白A缀合的受体珠)，并且使板在室温下温育2小时。在读数前(PerkinElmer, Envision 2103 Multilabel Reader),加入 2 Μ.1/孔供体混合物(含有链霉抗生物素蛋白包被的供体珠和生物素化的抗体)，并且使微量滴定板在室温下温育I小时。在另外的对照中，混合来自两个单一转染的制剂(hNIKl-fl-WT-pFlagN或IKKl-KD-pFlagN质粒)的HEK细胞裂解产物，并且随后如上所述分析。
[0088]结果来自上文实验的结果显示于图1中。
[0089]结果明确证实对于24小时和48小时转染，IKKl-KD-FlagN经历hNIKl-f 1-wt-FlagN 介导的憐酸化。在不存在 hNIKl-fΙ-wt-FlagN 或 IKKl-KD-FlagN 蛋白质的情况下，未观察到AlphaScreen信号。
[0090]实施例2:通过免疫细胞化学证实IKKl-KD-pFlagN的存在
已证实IKKl-KD-FlagN经历hNIKl-f Iit-FlagN介导的磷酸化，执行荧光成像以证实NIK和IKK-1的存在。
[0091]材料与方法
如上所述将HEK细胞双重转染。在30小时后，将细胞用丙酮固定。免疫细胞化学研究使用抗NIK-T559抗体(Santa Cruz,目录号sc-12957)和抗IKK a -C末端抗体(SantaCruz,目录号sc-7121)和Alexa-488 二级抗体(Invitrogen)。将细胞核用DAPI染色。
[0092]结果
图2中所示的结果证实IKKl-KD-FlagN的存在。尽管这些结果来自非最优化实验，但它们提供基于HEK细胞的测定是可行的早期指示。
[0093]实施例3:证实用jetPEI的转染效力 材料与方法
在0-10 μδ/πι1总DNA的范围上将HEK细胞双重转染(用hNIKl-f 1-WT-pFlagN和IKKl-KD-pFlagN质粒，l:l比)。使用的jetPEI转染试剂的量是恒定的(2 μ?/ml细胞悬浮液)。在转染后，立即将细胞分配到384孔微量滴定板(50 μ?/孔，含有10，000细胞/孔)内，并在37°C和5% CO2下温育24小时。如上所述使用AlphaScreen SureFire IKK α (磷酸-Ser-176/180)读出检测磷酸化的IKK1-KD-FIagN。对于化合物A (已知抑制NIK的分子)执行具有AlphaScreen SureFire读出的剂量应答实验。
[0094]结果
来自上文实验的结果显示于图3中。
[0095]如通过AlphaScreen测定检测的，双重jetPEI转染的HEK细胞导致IKKl-KD-FlagN的磷酸化。随着DNA载量增加，观察到AlphaScreen信号中的降低，这最可能是由于在高DNA浓度时因为jetPEI的量变得限制性的所导致的无效转染。当转染用0.125Kg/ml的总DNA载量执行时，化合物A提供可接受概况。
[0096]实施例4:用jetPEI转染的HEK细胞的化合物概况分析 材料与方法
在第一个实验中，将连续稀释的四种化合物转移到测定板[舒尼替尼、化合物A、化合物B和化合物C]。将JetPEI双重转染的HEK细胞(50 μ?，含有10，000细胞/孔)分配到微量滴定板内，并且在37°C和5% CO2下温育24小时和48小时。随后将板处理，并且如实施例I中所述，使用AlphaScreen SureFire IKK α (憐酸-Ser-176/180)读出检测憐酸化的IKKl-KD-FlagN。关于化合物C、化合物A和化合物B的第二个实验仅在24小时时间点执行。对于相同化合物，使用 CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability AssayCPromega,目录号G7570)执行细胞生存测定。简言之，在待测试NIK抑制剂活性的候选化合物的存在下培养经转染的HEK细胞。在去除培养基后，裂解经转染的HEK细胞。将测定试剂盒中提供的10 μ? CellTiter-Glo试剂加入含有细胞裂解产物的每一孔中，并且在室温下温育30分钟。随后使用 Envision 2103 Multilabel Reader 读板。CellTiter-Glo 测定允许基于存在的ATP (其指示代谢活性细胞的存在)的定量测定培养物中的活细胞数目。
[0097]结果
第一个实验的结果显示于图4 (A)和(B)中。值得注意的是化合物C在测定中是无活性的，而化合物A和化合物B显示为hNIKl-fl-wt-FlagN抑制剂。舒尼替尼看起来不抑制AlphaScreen信号。这些结果在实验2中得到证实，参见图4 (C)。关于这些化合物的剂量应答曲线就斜率、最小和最大AlphaScreen信号而言充分限定。
[0098]化合物还在图4 (D)中所示的细胞生存测定中进行评价。在低于10 μΜ的测试化合物浓度下未观察到信号变化，暗示图4 (A)、(B)和(C)中所示的效应不是由于化合物细胞毒性。
[0099]实施例5: jetPEI转染的HEK细胞的DMSO耐受
当伴随在37°C和5% CO2下的24小时温育暴露于DMSO时，研究HEK细胞的生存。
[0100]材料与方法
使经转染的HEK细胞(50 μι，含有10，000细胞/孔)在37°C和5% CO2下在384孔微量滴定板中暴露于0-10% v/v DMSO 24小时的时期。如实施例4中所述执行CellTiter-GloLuminescent Cell Viability Assay。
[0101]结果
来自上文实验的结果显示于图5中。
[0102]图5中所示的结果证实经转染的HEK细胞可以耐受对最高达0.5% v/v的DMSO的24小时暴露，并具有细胞生存的最小丧失。
[0103]实施例6:Z’和AlphaScreen信号稳定性测定 测定Z’和AlphaScreen信号稳定性。
[0104]材料与方法
在384孔微量滴定板中执行基于HEK细胞的测定。每块板含有4个对照列(64个孔)和含有以10 μΜ的总共2，240种筛选测试化合物(ChemBridge文库)的20列(320个孔)。
[0105]作为阴性对照(高对照)，将0.1% v/v DMSO加入32个孔。将10 μΜ化合物A加入16个孔作为阳性低对照(100%抑制)，并且将I μΜ化合物A加入16个孔作为阳性中对照(50%抑制)，使用图18中所示的板布局。
[0106]在3和16小时后,使用如先前描述的AlphaScreen SureFire读出获得信号检测。
[0107]结果
来自上文实验的结果显示于图6中。
[0108]在AlphaScreen检测试剂添加后3小时和16小时，Ζ’为>0.5。
[0109]实施例7:在微量滴定板中的DMSO和对照化合物研究
在使基于HEK细胞的测定暴露于2，240种测试化合物前，在含有DMSO孔连同中、低和高对照的微量滴定板中测试测定性能。
[0110]材料与方法
执行实施例6中所述的测定方案。板布局显示于图18中。中和低对照孔分别含有IμΜ和10 μΜ化合物Α。高对照孔和352个测试孔含有0.1% v/v DMS0。
[0111]结果 图7 (A)中所示的结果证实基于HEK细胞的测定性能是可接受的，具有Ζ’ >0.5。微量滴定的DMSO孔的分析显示从液体处理中的变化产生的假阳性的相对低数目，参见图7(B)。
[0112]实施例8:2，240种测试化合物小型筛选(η=1和η=2)
材料与方法
遵循如实施例4中所述的测定方案，使用图18的筛选布局。筛选十四块384孔微量滴定板，以提供双份的数据集。每块微量滴定板含有352种测试化合物。双份测定在同一天执行，但在其他方面它们是独立的数据集，这允许评估测定的重复性。
[0113]结果
来自上文实验的结果显示于图8-11中。
[0114]图9中所示的结果显示在η=1和n=2数据集之间的良好关联。在高对照中观察到比中和低对照中更高的差异。来自所有板的数据也在板(X轴)、抑制(n=l) (Y轴)和抑制(n=2) (Z轴)的3-D图中可视化，参见图10。
[0115]图11中所示的结果指示增加百分比抑制阈值增加在两个测试场合时有活性的命中概率。使用50%抑制阈值，65%的命中在两个测试场合时是有活性的。使用70%抑制阈值，81%的命中在两个测试场合时是有活性的。使用90%抑制阈值，所有命中在n=l和n=2测试场合时是有活性的。
[0116]实施例9:命中化合物在CellTiter-Glo测定中的评价
执行筛选以鉴定从细胞毒性和测定干扰效应中产生的命中。总共21个命中(产生>50%抑制的化合物)在CellTiter-Glo测定中进行概况分析。
[0117]材料与方法
CellTiter-Glo发光细胞生存测定如实施例4中所述执行。
[0118]结果
在CellTiter-Glo测定中，21种命中化合物显示出一定范围的细胞毒性概况(参见图12)。在细胞毒性和基于HEK细胞的测定结果中的NIK抑制的平均值之间的关联显示于图13 (A)中。
[0119]图13 (B)中所示的结果证实21种化合物(其为基于HEK细胞的测定中的命中)中的大多数产生显著细胞毒性效应。因此，这些化合物不太可能是真正的NIK抑制剂。
[0120]显示出NIK抑制>50%和细胞毒性〈50%的概况的9种化合物的结构显示于图14中。
[0121]总之，在评价的21种化合物中，9种化合物显示出hNIKl-fΙ-wt-FlagN抑制>50%和细胞毒性〈50%的概况。目前基于HEK细胞的测定能够检测看起来不显示出细胞毒性的NIK活性的假定抑制剂(针对IKKl-KD-FlagN底物)。
[0122]实施例10:在2，240种化合物筛选(n=3)中的基于HEK细胞的测定 材料与方法
如上所述重复筛选。
[0123]结果
来自上文实验的结果显示于图15-17中。
[0124]在筛选的7块微量滴定板中，一块具有Z’ 0.35，这低于预期的，并且是由于在板的左/右手侧上的对照群体中大于预期的变化。剩余6块板具有Z’ >0.59。所有21种命中化合物(其先前显示为有活性的，参见图13 (B))在n=3数据集中都显示相似趋势,参见图 16 (B)。
[0125]对于三份的数据集执行逐块板的分析，以便测定命中的重复性，参见图17。
[0126]图17中的数据暗示尽管低于对于5块板的预期Z’，但一般而言大部分有活性的化合物是可重复的。
[0127]参考文献列表1- Cmpe HJ,B Allcinson P.G,f Hyhse B., BeIicb M,t Janzen J., Holman MJ,t Klaus G.G.,
Johnston LH., Ley S.C.C040 regulates the processing of NF4cappaB2 p100 to p52,
EMBO J 2002, 15:5375-5385,
2,Dejardin E., The alternative NF-1cappaB pathway from biochemfsfry 1 biology: pitfalls and
pmmises for Mure drug development.Bioch^m Pharmam! 2006s 72:11614 179.3.Garrick RA and Chinard F, Pe Membrane permneabilily of isolated lung cells to
nonelectotyles at different temperatures, Am JPfiysM 1 籠2, 243:C285-C2B2
4,Hassan, HA Gyl S., Rett F.3 Hollingsworth E., Dunne AA, Emmons AJih Hutehinson
J.F, A Developftient of an in*ct?cell-based assay for detection of kinase inlhibilion
yslng NF-JcappaB-1rtducing kinase as a paradigm,, Siochem J 200? 419:65*73.5.Hayden M,Sf and Gliosh S- Shared principles in NF-kappaB signaliiig.Ceit 2CM)8,
132:344^362.1; Ung Lp Cao Z., GoeddeI D-V, NF?kappaB-1nducing Wnase activates IKK-alphs by
phospliorylatiofi of S#r-176, Pmc WatfAeacf Sci 1998, 95:3792~379T,
7,Malinin N.Lr Boldm M.Ptl Kwatonto A.V., Walacti D.MAP3K?related Wnase inmlmd m
NF-kappaB indyction by TNFi C095 and 1L?1 ?Wsftim 1991 385:.540-544,
8.Mortier Masereel B.? Remoudiamps C , Baneff C , Pielte 丄，Fmderldc R.NF-kappaB
inducing kinase (NIK) inhibitors; idenliicstion of new scaffolds using virtual screening,
Bmorg & Med Omm Lett 期 0, 20:4515-4520.1.Nalcano H., Shindo Μ,Λ Saton Nishinaka S., Mihara M- Yagila Hm Okumura K-
Differ_tia謹 regulation of IkappaB kinase alpha and beta by two upstream kinases, NP-
kappaB?Wucing Wnase and milogen-aclivaled protein Wnas?/ERK kinase Wnase-1 - Prm
NattAcad Sc? 1998p 95:3537^-3542.10.Qing G” Qu Za Xiao G, Stabilization of basatly Irar^sIated NF-kappaB-1ndycing kinase
(NIK) pmtein funeltons as a molecular switch of piwessing of Nf~kappaB2 p100, J Biol
Ctiem 2005, 280(49):40578^2.11.SWnkwra I Kitada IC.Matsuda F? Tashtro K.h lkuta K^1 Suzuki .KogisW K.f Serikawa
T-.HwjG I Naium Gemim 1 纖 22:74-77，
12.Sun S.C, NQn?canooicaI NF-1cE signaNng pathway CBti Res 201 1121 ;71*85,
13.Thu Υ.ΙΛ..and RichiBond A, NF-κΒ indudng kinase: a key regulator m the lmmyna system
and m can., Cytokme & Gmwth Factor Re￥ 2010? 21:213-226.14.Vallabhapurapu S.and Karin y.Regubltan and function of NF?kappaB transcripUon
fa-clors in tie imrn^m system.Armu fmmmol 2009? 27:893-733.15.Xia? G,9 Harhay E.W? S_ S-G.NF-kappaB4ndudfi§ kinase re^jlales Ifie processing of
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【权利要求】
1.用于鉴定抑制NIK活性的化合物的方法，其包括: (a)提供在培养基中含有编码NIK的DNA和编码IKKl-KD的DNA的HEK细胞(经转染的HEK细胞)； (b)在37°C+/- 2°C的温度下在5% CO2的存在下，使所述经转染的HEK细胞连同和不连同待测试的候选分子温育24小时； (c)去除所述培养基； (d)裂解所述细胞； (e)将受体复合物随后将供体复合物加入所述细胞裂解产物中； Cf)用激光照射激发所述细胞裂解产物，和 (g)使用基于珠的发光接近检测系统，测量细胞裂解产物被激光激发后产生的信号， 其中得自细胞裂解产物的信号的减少或不存在指示NIK介导的IKKl-KD磷酸化的抑制，所述细胞裂解产物来源于在测试化合物的存在下培养的经转染的HEK细胞，并且其中所述受体复合物包含分子包被的珠和与所述IKKl-KD蛋白质结合的结合配偶体，并且所述供体复合物包含分子包被的珠和与所述IKKl-KD蛋白质结合的结合配偶体。
2.根据权利要求1的方法，其中与得自来源于在不存在测试化合物的情况下培养的经转染的HEK细胞的细胞裂解产物的信号相比较，得自来源于在测试化合物的存在下培养的经转染的HEK细胞的细胞裂解产物的信号的减少指示NIK介导的IKKl-KD磷酸化的减少。
3.根据权利要求1或2的方法，其中通过用含有编码NIK的DNA的第一种表达载体和含有编码IKKl-KD的DNA的第二种表达载体转染HEK细胞，将编码NIK的DNA和编码IKKl-KD的DNA插入所述HEK细胞内。
4.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述受体复合物的分子包被的珠是蛋白A包被的珠，并且所述受体复合物的结合配偶体是与IKKl-KD的Ser-176残基的磷酸化形式特异性结合的抗体。
5.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述供体复合物的分子包被的珠是链霉抗生物素蛋白包被的珠，并且所述供体复合物的结合配偶体是与IKKl-KD结合的生物素化的抗体。
6.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述基于珠的发光接近检测系统是AlphaScreen检测系统。
7.根据前述权利要求中任一项的方法，其进一步包括在细胞毒性测定中测试显示NIK抑制活性的那些候选分子的步骤，从而允许区分具有与细胞毒性效应相关的NIK抑制剂活性的候选分子与具有不与细胞毒性效应相关的NIK抑制剂活性的候选分子。
【文档编号】G01N33/542GK103703369SQ201280037311
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2012年7月26日 优先权日:2011年7月27日
【发明者】R.霍夫特范休斯杜伊南, S.格尔 申请人:默克专利股份公司