专利名称：一种百草妇炎清栓指纹图谱的建立方法
技术领域：
本发明涉及一种百草妇炎清栓指纹图谱的建立方法，以及由此方法所得到的百草妇炎清栓标准指纹图谱。
背景技术：
百草妇炎清栓为已经上市的中成药，具有清热解毒、祛瘀收敛、杀虫止痒。适用于治疗及预防妇女霉菌性、滴虫性、细菌性、淋菌性阴道炎、宫颈炎、宫颈糜烂、白带过多及老年性阴道炎等妇科常见疾病。百草妇炎清栓是在总结贵州苗族验方的基础上，结合现代化的医药科技研制开发的新一代理想妇科阴道外用药。它由苦参、百部、蛇床子、仙鹤草、紫珠叶、白矾、冰片和樟脑等8味药材组成，对滴虫、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、真菌等多种阴道致病菌有较强的杀灭和抑制作用，同时可促进受损上皮组织的修复，对创伤面有较强的收敛作用，并且能够提高机体的粘膜免疫功能。中药指纹图谱是一种综合的，可量化的鉴定手段，它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药材以及中药制剂半成品质量的真实性、优良性和稳定性。中药及其制剂均为多组分复杂体系，因此评价其质量应采用与之相适应的，能提供丰富鉴别信息的检测方法，建立中药指纹图谱将能较为全面地反映中药及其制剂中所含化学成分的种类与数量，进而对药品质量进行整体描述和评价。在此基础上，如果进一步开展谱效学研究，可使中药质量与其药效真正结合起来，有助于阐明中药作用机理。目前，尚无百草妇炎清栓指纹图谱研究工作的报道。本发明建立百草妇炎清栓指纹图谱，旨在建立一种新的质量控制方法，是一种具有创新性的研究工作，可以为本产品的技术提升与深度开发提供依据。
发明内容
本发明的目的是通过百草妇炎清栓的指纹图谱，提供一种新的质量控制方法，明确该指纹图谱的建立步骤，并建立其标准指纹图谱。百草妇炎清栓指纹图谱的建立方法如下:(I)对照品溶液的制备:称取苦参碱2 10mg、槐果碱2 10mg，置于5_20ml量瓶中，加入甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得苦参碱、槐果碱的混合对照品溶液；(2)供试品溶液的制备:称取百草妇炎清栓样品2 10g，置水浴上使熔化，力口0.15-0.6ml氨水,加娃藻土 5_20g,研勻,加氯仿25_100ml,超声15_60min,补重,过滤,取滤液10-40ml,蒸干,残洛用甲醇溶解并定容至5-20ml,过0.2-0.8 μ m微孔滤膜,作为供试品溶液；(3)百草妇炎清栓指纹图谱的测定:吸取供试品溶液、对照品溶液各10 30 μ L，分别注入液相色谱仪，按照高效液相色谱法测定，得到色谱图；其中色谱条件为:色谱柱:250mm X 4.6mm, 5 μ m的Comatex C18-AA柱；流动相:乙腈(A)-用磷酸调节pH为6-7的0.02-0.08%的三乙胺缓冲液(B);梯度洗脱:0 — IOOmin,A的体积百分比10%—60%，流速0.5-2ml/min，检测波长:210 230nm，柱温:20 40°C，进样量:10 ~ 30 μ L0优选的，方法如下:(I)对照品溶液的制备:称取苦参碱2 10mg、槐果碱2 10mg，置于IOml量瓶中，加入甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得苦参碱、槐果碱的混合对照品溶液；(2)供试品溶液的制备:称取百草妇炎清栓样品2 10g，置水浴上使熔化，力口0.3ml氨水,加娃藻土 IOg,研勻,加氯仿50ml,超声30min,补重,过滤,取滤液20ml,蒸干,残渣用甲醇溶解并定容至10ml，过0.45 μ m微孔滤膜，作为供试品；(3)百草妇炎清栓指纹图谱的测定:吸取供试品溶液、对照品溶液各10 30 μ L，分别注入液相色谱仪，按照高效液相色谱法测定，得到色谱图；其中色谱条件为:250_X4.6mm, 5 μ m的Comatex C18-AA柱；流动相:乙腈(A)-用磷酸调节pH为6-7的0.04%的三乙胺缓冲液(B);梯度洗脱:0 — lOOmin，A的体积百分比10% — 60% ;流速lml/min，检测波长210 230nm，柱温20 40°C，进样量10 30 μ L0最优选的方法如下:(I)对照品溶液的制备:称取苦参碱4.08mg、槐果碱5.02mg，置于IOml量瓶中，力口入甲醇溶解并稀释至刻度，摇勻，即得苦参碱0.408mg/ml、槐果碱0.502mg/ml的混合对照品溶液；(2)供试品溶液的制备:精密称取百草妇炎清栓样品5g，置水浴上使熔化，力口0.3ml氨水,加娃藻土 IOg,研勻,精密加氯仿50ml,超声30min,补重,过滤,取滤液20ml,蒸干，残渣用甲醇溶解并定容至10ml，过0.45 μ m微孔滤膜，作为供试品；(3)百草妇炎清栓指纹图谱的测定:精密吸取供试品溶液、对照品溶液各20 μ L，分别注入液相色谱仪，按照高效液相色谱法测定，记录SOmin的色谱图；其中色谱条件为:250_X4.6mm, 5 μ m的Comatex C18-AA柱；流动相:乙腈(A)-用磷酸调节pH为6.5的0.04%的三乙胺缓冲液⑶；梯度洗脱:0 — lOOmin, A的体积百分比10%- 60% ;流速lml/min，检测波长220nm，柱温30°C，进样量20yL。本发明所述色谱仪使用的检测器为二极管阵列检测器。在本发明色谱图中本发明以苦参碱和槐果碱对照品的色谱峰为参照峰，其中2号峰为苦参碱，3号峰为槐果碱。在本发明色谱图中共有13个共有峰。若以2号峰作为参比峰计算，共有峰的相对保留时间分别为I号峰:0.371
0.390,2 号峰:1.000,3 号峰:1.162 1.242,4 号峰:1.445 1.738,5 号峰:1.718
1.992，6 号峰:1.882 2.184，7 号峰:2.248 2.606，8 号峰:2.794 3.236，9 号峰:
2.997 3.472，10 号峰:3.183 3.684，11 号峰:3.561 4.123，12 号峰:3.75 4.390，
13号峰:3.934 4.601。若以2号峰作为参比峰计算，共有峰相对峰面积分别为I号峰:0.097 0.141，
2号峰:1.000,3 号峰:0.946 1.096，4 号峰:0.1 0.534,5 号峰:0.029 0.091,6 号峰:0.051 0.084，7 号峰:0.068 0.1，8 号峰:0.041 0.184，9 号峰:0.103 0.263，10 号峰:0.13 0.271，11 号峰:0.07 0.143，12 号峰:0.079 0.201，13 号峰:0.106
0.283。为确定百草妇炎清栓的指纹图谱的准确性，需要建立标准对照指纹图谱，本发明的标准对照指纹图谱的建立是通过对多批样品的检测，在其色谱同一性良好的情况下确定的,建立过程如下:随机选取10批百草妇炎清栓，按照本发明的方法测定指纹图谱，以10批样品的指纹图谱中13个峰为共有峰，利用计算机模拟相似度计算软件(2004A版)，拟合确定百草妇炎清栓指纹图谱，即百草妇炎清栓标准对照指纹图谱。本发明还包括，一种百草妇炎清栓的检测方法，步骤如下:(A)随机选取10批百草妇炎清栓，按照本发明的方法测定指纹图谱，以10批样品的指纹图谱中13个峰为共有峰，利用计算机模拟相似度计算软件(2004A版)，拟合确定百草妇炎清栓指纹图谱，即百草妇炎清栓标准对照指纹图谱。(B)取待检百草妇炎清栓，按照本发明的方法测定指纹图谱；(C)将步骤⑶得到的指纹图谱和步骤㈧得到的标准指纹图谱进行比对，符合即为合格产品，不符合即为不合格产品。关于指纹图谱的对比，如果待测百草妇炎清栓的指纹图谱和标准指纹图谱的相似度在0.9或以上，可以认为合格，如果在0.9以下，可以认为不合格。通过比较10批百草妇炎清栓的色谱图，确定百草妇炎清栓的指纹图谱，共有13个共有峰，其中2号峰为苦参碱，3号峰为槐果碱，如说明书附图中的图1、图2所示。与现有技术相比，本发明具有分离效能高、选择性高、检测灵敏高、分析速度快、应用范围广等优点。
图1是对照品HPLC图:2.苦参碱；3.槐果碱。图2是本发明的百草妇炎清栓标准指纹图谱。图3是本发明的10批百草妇炎清栓的指纹图谱。图4是本发明的聚类分析树状图
具体实施例方式本发明的优选实施方式如下:实施例1百草妇炎清栓标准指纹图谱的建立1.仪器与试药AgilentllOO型高效液相色谱仪(四元泵、在线脱气机、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器)，SG8200H超声仪(上海冠特超声仪器有限公司)，AB104-N电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)，PHS-25B型酸度计(上海大谱仪器有限公司)。苦参碱对照品(中国食品药品检定研究院，批号:0805-200508)、槐果碱对照品(贵州迪大生物有限公司145572-44-7);乙腈为色谱纯，水为纯净水，其他试剂均为分析纯；百草妇炎清栓由贵州长生药业有限责任公司提供(批号:110501、110515、110602、110613、110702、110717、I10802,I10907,1I1009,1I1203)。
2.色谱条件色谱柱:ComatexC18-AA(250mmX4.6mm, 5 μ m);流动相:乙臆(Α)_0.04 % 三乙胺缓冲液(磷酸调ΡΗ6.5) (B);洗脱程序:梯度洗脱(O — lOOmin，A的体积百分比10%-60% );流速lml/min，检测波长220nm，柱温30°C，进样量20yL。3.百草妇炎清栓指纹图谱的测定3.1百草妇炎清栓指纹图谱的确立对照品溶液的制备:称取苦参碱4.08mg、槐果碱5.02mg，置于IOml量瓶中，加入甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得苦参碱0.408mg/ml、槐果碱0.502mg/ml的混合对照品溶液。供试品溶液的制备:精密称取百草妇炎清栓样品5g，置水浴上使熔化，加0.3ml氨水，加娃藻土 IOg,研勻，精密加氯仿50ml,超声30min,补重,过滤,取滤液20ml,蒸干,残洛用甲醇溶解并定容至10ml，过0.45 μ m微孔滤膜，作为供试品溶液。指纹图谱的测定:精密吸取供试品溶液、对照品溶液各20 μ L，分别注入液相色谱仪，按照高效液相色谱法测定，记录SOmin的色谱图，计算各共有峰的相对保留时间和相对保留峰面积，即得到百草妇炎清栓标准指纹图谱。3.2共有峰的确定通过比较10批百草妇炎清栓的色谱图，确定共有13个共有峰，其中2号峰为苦参碱，3号峰为槐果碱，以2号峰作为指纹图谱的参比峰计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果见图1、图2、表1、表2。表110批百草妇炎清栓指纹图谱共有峰的相对保留时间
权利要求
1.一种百草妇炎清栓指纹图谱的建立方法，其特征在于，方法如下: (1)对照品溶液的制备:称取苦参碱2 10mg、槐果碱2 10mg，置于5_20ml量瓶中，加入甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得苦参碱、槐果碱的混合对照品溶液； (2)供试品溶液的制备:称取百草妇炎清栓样品2 10g，置水浴上使熔化，力口0.15-0.6ml氨水,加娃藻土 5_20g,研勻,加氯仿25_100ml,超声15_60min,补重,过滤,取滤液10-40ml,蒸干,残洛用甲醇溶解并定容至5-20ml,过0.2-0.8 μ m微孔滤膜,作为供试品溶液； (3)百草妇炎清栓指纹图谱的测定:吸取供试品溶液、对照品溶液各10 30μ L，分别注入液相色谱仪，按照高效液相色谱法测定，得到色谱图； 其中色谱条件为:色谱柱:250mmX 4.6mm, 5 μ m的Comatex (318-44柱；流动相:乙腈(A)-用磷酸调节pH为6-7的0.02-0.08%的三乙胺缓冲液(B);梯度洗脱:0 — IOOmin, A的体积百分比10%- 60%，流速0.5-2ml/min，检测波长:210 230nm，柱温:20 40。。，进样量:10 ~ 30 μ L0
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，方法如下: (1)对照品溶液的制备:称取苦参碱2 10mg、槐果碱2 10mg，置于IOml量瓶中，力口入甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得苦参碱、槐果碱的混合对照品溶液； (2)供试品溶液的制备 :称取百草妇炎清栓样品2 10g，置水浴上使熔化，加0.3ml氨水，加娃藻土 IOg,研勻,加氯仿50ml,超声30min,补重,过滤,取滤液20ml,蒸干,残洛用甲醇溶解并定容至IOml,过0.45 μ m微孔 滤膜,作为供试品； (3)百草妇炎清栓指纹图谱的测定:吸取供试品溶液、对照品溶液各10 30μ L，分别注入液相色谱仪，按照高效液相色谱法测定，得到色谱图； 其中色谱条件为:250mmX 4.6mm, 5 μ m的Comatex C18-AA柱；流动相:乙腈(A)-用磷酸调节PH为6-7的0.04%的三乙胺缓冲液(B);梯度洗脱:0 — IOOmin, A的体积百分比10%- 60% ;流速lml/min，检测波长210 230nm，柱温20 40°C，进样量10 30μ L。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，方法如下: (1)对照品溶液的制备:称取苦参碱4.08mg、槐果碱5.02mg，置于IOml量瓶中，加入甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得苦参碱0.408mg/ml、槐果碱0.502mg/ml的混合对照品溶液； (2)供试品溶液的制备:精密称取百草妇炎清栓样品5g，置水浴上使熔化，加0.3ml氨水，加娃藻土 IOg,研勻,精密加氯仿50ml,超声30min,补重,过滤,取滤液20ml,蒸干,残洛用甲醇溶解并定容至10ml，过0.45 μ m微孔滤膜，作为供试品； (3)百草妇炎清栓指纹图谱的测定:精密吸取供试品溶液、对照品溶液各20μ L，分别注入液相色谱仪，按照高效液相色谱法测定，记录SOmin的色谱图； 其中色谱条件为:250mmX 4.6mm, 5 μ m的Comatex C18-AA柱；流动相:乙腈(A)-用磷酸调节pH为6.5的0.04%的三乙胺缓冲液⑶；梯度洗脱:0 — IOOmin, A的体积百分比10%- 60% ;流速lml/min，检测波长220nm，柱温30°C，进样量20yL。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述色谱仪使用的检测器为二极管阵列检测器。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，色谱图中2号峰为苦参碱，3号峰为槐果碱。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，色谱图中共有13个共有峰。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，以2号峰作为参比峰计算，所述共有峰的相对保留时间分别为I号峰；0.371 0.390，2号峰:1.000，3号峰:1.162 1.242，4号峰:1.445 1.738,5 号峰:1.718 1.992,6 号峰:1.882 2.184，7 号峰:2.248 2.606,8号峰:2.794 3.236，9 号峰:2.997 3.472，10 号峰:3.183 3.684，11 号峰:3.561 4.123，12 号峰:3.75 4.390，13 号峰:3.934 4.601。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，以2号峰作为参比峰计算，所述共有峰相对峰面积分别为I号峰:0.097 0.141,2号峰:1.000, 3号峰:0.946 1.096,4号峰:0.1 0.534，5 号峰:0.029 0.091，6 号峰:0.051 0.084，7 号峰:0.068 0.1，8 号峰:0.041 0.184，9 号峰:0.103 0.263，10 号峰:0.13 0.271，11 号峰:0.07 0.143，12号峰:0.079 0.201，13 号峰:0.106 0.283。
9.一种百草妇炎清栓标准对照指纹图谱的建立方法，步骤如下: 随机选取10批百草妇炎清栓，按照权利要求1的方法测定指纹图谱，以10批样品的指纹图谱中13个峰为共有峰，利用计算机模拟相似度计算软件，拟合确定百草妇炎清栓指纹图谱，即百草妇炎清栓标准对照指纹图谱。
10.一种百草妇炎清栓的检测方法，步骤如下: (A)随机选取10批百草 妇炎清栓，按照权利要求1的方法测定指纹图谱，以10批样品的指纹图谱中13个峰为共有峰，利用计算机模拟相似度计算软件，拟合确定百草妇炎清栓指纹图谱，即百草妇炎清栓标准对照指纹图谱。
(B)取待检百草妇炎清栓，按照权利要求1的方法测定指纹图谱； (C)将步骤(B)得到的指纹图谱和步骤(A)得到的标准指纹图谱进行比对，符合即为合格产品，不符合即为不合格产品。
全文摘要
本发明涉及一种百草妇炎清栓指纹图谱的建立方法，以及由此方法所得到的百草妇炎清栓标准指纹图谱。本发明主要采用高效液相色谱法检测，色谱条件为色谱柱Comatex C18-AA(250mm×4.6mm，5μm)；流动相乙腈(A)-0.04％三乙胺缓冲液(磷酸调pH6.5)(B)；洗脱程序梯度洗脱(0→100min，A的体积百分比10％→60％)；流速1ml/min，检测波长220nm，柱温30℃，进样量20μL。通过比较10批百草妇炎清栓的色谱图，确定共有13个共有峰，计算各共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积，从而建立起标准指纹图谱。
文档编号G01N30/02GK103175909SQ201310024010
公开日2013年6月26日 申请日期2013年1月23日 优先权日2013年1月23日
发明者高秀丽, 孟小夏, 王鹏娇, 姜楠 申请人:贵州长生药业有限责任公司