一种基于嗅觉受体传感器检测气味物质丁二酮的方法

专利名称：一种基于嗅觉受体传感器检测气味物质丁二酮的方法
技术领域：
本发明涉及一种检测技术，尤其涉及一种基于嗅觉受体传感器检测气味物质丁二酮的方法。
背景技术：
生物嗅觉系统能够快速、灵敏地感受并分辨出空气中的气味物质，这得益于嗅觉受体能够与空气中气味分子特异性地结合。传统气体传感器设计中，敏感材料多采用导电聚合物、高分子材料等，缺点是特异性差。气味分子种类繁多，多是结构各异的小分子量挥发性有机气体，尤其当检测环境中的空气中含有多种气味时，特异性地检测某种气味变得相对困难。新兴的生物传感器拟从仿生的角度解决这一问题，模仿生物嗅觉系统利用嗅觉受体对气味分子的特异性识别，为特异性检测气体提供了新的技术途径。因此，如何获得高度特异的气体敏感材料，并将其与二级传感器的有效稳定耦合，实现气味分子的特异性检测是目前气体传感器进一步发展亟需解决的难题。

发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种利用嗅觉受体蛋白作为敏感材料结合石英晶体微天平构建嗅觉受体传感器进行气体特异性检测的方法。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的:一种基于嗅觉受体传感器检测气味物质丁二酮的方法，该方法包括以下步骤:
(1)制备嗅觉受体蛋白0DR-10；
(2)固定嗅觉受体蛋白0DR-10在石英晶体微天平表面构建嗅觉受体传感器；
(3)将洁净空气以lmL/s的流速泵入检测腔内，待石英晶体微天平传感器的谐振频率达到一个稳定的状态后，再将浓度确定的含有气味物质丁二酮的待测气体泵入检测腔，待石英晶体微天平传感器的谐振频率再次稳定后，谐振频率的改变量即为嗅觉受体传感器对此浓度下的气体物质丁二酮的响应值；最后再将洁净空气泵入检测腔内，清洗检测腔，即完成一次检测过程；至少间隔IOmin后，待石英晶体微天平传感器的谐振频率稳定后可泵入另一浓度待测气体到检测腔进行下一次检测；重复上述步骤，得到一系列浓度的气体物质丁二酮引起的传感器谐振频率改变量，得到丁二酮浓度-谐振频率改变量曲线；
(4)对于未知浓度的气体物质丁二酮的检测，首先将洁净空气以lmL/s的流速泵入检测腔内，待石英晶体微天平传感器的谐振频率达到一个稳定的状态Ftl后，再将浓度未知的待测气体泵入检测腔，待石英晶体微天平传感器的谐振频率再次稳定到F1后，得到谐振频率改变量F1- Ftl，根据上述步骤得到的丁二酮浓度-谐振频率改变量曲线推算出待测气体物质丁二酮的浓度，实现对丁二酮的浓度测定。进一步地，所述步骤(I)包括以下子步骤:
(1.1)构建表达载体:首先采用基因工程技术对含有嗅觉受体蛋白0DR-10基因和rho-tag信号妝序列全长cDNA饱攝MtPEGFP-Nl/rho-tag/odr-10 (其基因序列如SEQ IDN0.1所示)进行适当改造，构建适用于嗅觉受体传感器使用的嗅觉受体蛋白的表达载体，使其N末端带有融合表达的His6-tag标签；首先，设计相应的引物，获取和扩增嗅觉受体蛋白ODR-1O基因和rho-tag信号肽序列全长cDNA，并在N末端添加融合表达的His6_tag标签，上游引物序列SEQ ID N0.2 ;下游引物序列如SEQ ID N0.3所示；聚合酶链式反应(PCR)在50 μ L 反应体系中进行，包括 I μ L PEGFP-Nl/rho-tag/odr-lOJ^ML, I μ L 上游引物，I μ L 下游引物，4 μ L浓度为IOmM的dNTP混合物，0.5 μ L高保真聚合酶STAR (Takara,日本)，10 μ L PCR缓冲液(含Mg2+)和32.5 μ L去离子水，温度循环首先是95°C预变性3分钟，接着进行30循环的94°C变性30秒、60°C退火30秒、72°C延伸70秒，最后是10°C降温10秒。扩增后获得的产物通过限制性内切酶的双酶切反应亚克隆到表达M(AtpcDNA3.1(+)的多克隆位点命I琳BernH /之间，完成嗅觉受体蛋白的表达载体pcDNA3.1 (+)/his6-tag/rho-tag/odr-W的构建,其基因序列如SEQ ID N0.4通过测序进行鉴定;
(1.2)转染人胚胎肾细胞HEK-293:HEK_293细胞培养液为添加了体积百分比为10%的胎牛血清、青霉素(100 U/mL)和链霉素(100 μ g/mL)的DMEM高糖培养基，培养条件为37°C、体积百分比为5% CO2的培养箱。转染之前一天，HEK-293细胞被接种于六孔培养皿中，每孔接种500 μ L浓度为0.5 2Χ IO5 cells/mL的细胞，在不含抗生素的DMEM高糖培养基里生长至融合度约为80-90%，待转染；转染试剂为Iipofectamin 2000，使用步骤1.1构建好的表达载体制J.1 (+)/his6-tag/rho-tag/odr-10转染HEK-293细胞；用无血清DMEM培养液把4 μ g表达载体稀释至50 μ L，混匀；再用无血清DMEM培养液稀释10 μ L的脂质体转染试剂Iipfectamin 2000至50 μ L，在室温下孵育5分钟；接着把稀释后的表达载体和Iipfectamin 2000混合至总体积为100 μ L,摇匀，室温孵育20分钟；六孔板的每个孔中加入100 μ L表达载体和Iipfectamin 2000的混合液，前后摇板混匀后，在37°C、体积百分比为5% CO2的培养箱孵育24-48小时后，嗅觉受体蛋白即表达在HEK-293细胞膜表面，以备用作嗅觉受体传感器的敏感材料；
(1.3)提取嗅觉受体蛋白0DR-10:为将步骤1.2中制备的嗅觉受体蛋白0DR-10用作嗅觉受体传感器的敏感材料，使用膜蛋白提取试剂盒从转染后的HEK-293细胞中提取嗅觉受体蛋白0DR-10 ;先收集转染48小时的HEK-293细胞，用4°C的去离子水离心洗3次，每次5分钟；然后加入ImL蛋白提取缓冲液、I μ L蛋白酶抑制剂、I μ L DDT，超声破碎4次，然后40C 14000g离心10分钟，弃沉淀，上清液转至一新的离心管中水浴10分钟，室温下13000离心5分钟，样品分为上下两层，下层含有细胞膜蛋白；取下层样品，加入500yL 4°C灭菌水，4°C放置5分钟，然后37°C水浴10分钟，室温下13000离心5分钟，样品分为上下两层，重复此步骤5次；最终得到的下层样品即为膜蛋白混合物，其中包含带有融合His6-tag标签的嗅觉受体蛋白0DR-10 ;-70°C保存待用。所述步骤(2)具体为:本发明的嗅觉受体传感器制备过程如下:将石英晶体微天平置于乙醇中浸泡10分钟,氮气干燥；然后IM NaOH水溶液中浸泡20分钟,去离子水清洗；IM HCl溶液中浸泡5分钟；新配置的浓H2SO4与H2O2 (体积比2:3)混合液浸泡I分钟，氮气干燥，以完成石英晶体微天平的彻底清洁；利用金巯键自组装反应在石英晶体微天平的金电极上共价固定一层可以特异性识别融合表达的His6-tag标签的巯基化单链DNA适配体，该适配体由5’末端共价修饰 了 HS-(CH2)6基团的SEQ ID N0.5所示的基因序列组成，室温下反应21小时；然后封闭分子(Il-MUA)封闭石英晶体微天平传感器的金电极表面未反应的位点，封闭条件为室温下I小时；把步骤1.5制备的含有嗅觉受体蛋白的细胞膜蛋白混合液均匀孵育在石英晶体微天平传感器的金电极表面，并放在室温孵育过夜，使嗅觉受体蛋白通过融合表达的His6-tag标签与适配体发生特异性的结合反应，实现嗅觉受体蛋白在石英晶体微天平传感器的金电极表面特异性固定和纯化；细胞膜的磷脂双分子层有利于保持嗅觉受体蛋白ODR-1O的天然构象；N2吹干后将表面固定有嗅觉受体蛋白的石英晶体微天平安装在检测系统中，完成嗅觉受体传感器的构建，以用于气味物质的检测。本发明的有益效果，本发明采用现代分子克隆技术，制备出能特异性结合气味分子丁二酮的嗅觉受体蛋白0DR-10，用作气体传感器的敏感材料，克服了传统的气体检测中敏感材料特异差、灵敏度低的缺点。采用适配体自组装固定技术实现嗅觉受体在二级传感器表面的有效耦合固定，不仅可以提高传感器的稳定性，而且适配体特异有效结合嗅觉受体蛋白的能力实现嗅觉受体蛋白在传感器芯片上的一步纯化，其它无关膜蛋白由于缺乏与适配体的亲和力不能被固定在传感器表面，进而提高了嗅觉受体蛋白在传感器表面的固定效率和分布密度，克服了传统敏感材料不能有效与二级传感器耦合的问题，最终有助于提高传感器的灵敏度、特异性和稳定性。该检测方法采用有效固定了嗅觉受体蛋白的石英晶体微天平作为嗅觉受体传感器，可以实现对气味分子丁二酮的实时、快速、特异性检测，克服了传统检测技术流程复杂、特异性低、敏感性差、无法实现现场检测的缺点，适用于复杂气体环境中气体的实时特异性监测。该嗅觉受体作为敏感材料特异性检测气体的这些优点和功能可以满足复杂气体环境中气味分子的特异性实时快速检测，可广泛用于生物医学、环境保护和食品行业等相关领域。


图1是本发明制备嗅觉受体蛋白0DR-10的基因结构 图2是本发明将固定嗅觉受体蛋白0DR-10在石英晶体微天平上的示意 图3是本发明嗅觉受体传感器检测系统结构 图4是本发明制备嗅觉受体蛋白0DR-10的RT-PCR结果 图5是本发明制备嗅觉受体蛋白0DR-10的Western blot结果 图6是本发明嗅觉受体传感器检测几种气味物质的结果 图7是本发明嗅觉受体传感器检测不同浓度丁二酮的结果 图中，融合表达的His6-tag基因1、rho-tag信号肽基因2、嗅觉受体蛋白0DR-10基因
3、脂质双分子层4、嗅觉受体蛋白5、融合表达的His6-tag标签6、封闭分子7、适配体8、金电极9、石英晶体10、第一气阀11、注射泵12、废气气袋13、气体管路14、检测腔的盖子15、检测腔体16、橡胶密封圈17，石英晶体微天平18、信号输出电极19、QCM200检测系统20、洁净空气气袋21、待测气体气袋22、第二气阀23。
具体实施例方式下面详细介绍以嗅觉受体蛋白0DR-10作为敏感元件结合石英晶体微天平传感器制备嗅觉受体传感器检测气体的基本原理以及具体步骤。本发明基于嗅觉受体传感器检测气味物质丁二酮的方法，包括以下步骤:1、制备嗅觉受体蛋白ODR-1O
1.1表达载体的构建
首先采用基因工程技术对含有嗅觉受体蛋白0DR-10基因3和rho-tag信号肽2序列全I cmk饱质第LPEGFP-Nl/rho-tag/odr-ΙΟ (其基因序列如SEQ ID N0.1所示)进行适当改造，构建适用于嗅觉受体传感器使用的嗅觉受体蛋白5的表达载体，使其N末端带有融合表达的His6-tag标签6 ;首先，设计相应的引物，获取和扩增嗅觉受体蛋白0DR-10基因3和rho-tag信号肽2序列全长cDNA,并在N末端添加融合表达的His6_tag标签,上游引物序列SEQ ID N0.2:5’ -AGAGGTACCGATGCACCACCACCACCACCACATGAACGGGACCGAGGGCCCAA-3' 其中下划线部分为治7/7 I酶切位点，虚线部分为融合表达的His6-tag基因I序列，以便使后续表达的嗅觉受体蛋白5的N末端含有融合表达的His6-tag标签6，有助于嗅觉受体蛋白5在传感器表面的有效固定；下游引物序列如SEQ ID勵.3所示:5’_ cgc^gatcctcacgtcggaacttgagacaaat-3’，其中下划线部分为及丽Y I酶切位点；聚合酶链式反应(PCR)在50 μ L反应体系中进行，包括I μ L PEGFP-Nl/rho-tag/odr-10质Μ ，I μ L上游引物，I μ L下游引物，4 μ L浓度为IOmM的dNTP混合物，0.5 μ L高保真聚合酶STAR ，IOyL的PCR缓冲液(含Mg2+)和32.5 μ L去离子水，温度循环首先是95°C预变性3分钟，接着进行30循环的94°C变性30秒、60°C退火30秒、720C延伸70秒，最后是10°C降温10秒。扩增后获得的产物his6_tag/通过限制性内切酶的双酶切反应亚克隆到表达载体pciWA .7句的多克隆位点Kpn I和BamH /之间，完成嗅觉受体蛋白5的表达载体pcDNA3.1 (+)/his6-tag/rho-tag/odr-10的构建，其基因序列如SEQ ID N0.4通过测序进行鉴定。1.2转染人胚胎肾细胞HEK-293
HEK-293细胞培养液为添加了体积百分比为10%的胎牛血清、青霉素(100 U/mL)和链霉素(100 μ g/mL)的DMEM高糖培养基，培养条件为37°C、体积百分比为5% CO2的培养箱。转染之前一天，HEK-293细胞被接种于六孔培养皿中，每孔接种500 μ L浓度为0.5 2X IO5 cells/mL的细胞，在不含抗生素的DMEM高糖培养基里生长至融合度约为80_90%，待转染；转染试剂为Iipofectamin 2000，使用步骤1.1构建好的表达载体pciWA .7 PJ/his6-tag/rho-tag/odr-10转染HEK-293细胞；用无血清DMEM培养液把4 μ g表达载体稀释至50 μ L,混勻；再用无血清DMEM培养液稀释10 μ L的脂质体转染试剂Iipfectamin2000至50 μ L，在室温下孵育5分钟；接着把稀释后的表达载体和Iipfectamin 2000混合至总体积为100 μ L，摇匀，室温孵育20分钟；六孔板的每个孔中加入100 μ L表达载体和Iipfectamin 2000的混合液，前后摇板混匀后，在37°C、体积百分比为5% CO2的培养箱孵育24-48小时后，嗅觉受体蛋白5即表达在HEK-293细胞膜表面，以用备作嗅觉受体传感器的敏感材料。1.3逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)
采用RT-PCR的方法检测嗅觉受体蛋白5在细胞内mRNA水平的表达水平以验证其成功表达制备；HEK-293细胞在转染48小时后，按Trizol —步法提取细胞的总RNA ;先取出六孔板细胞至灭好菌的超净工作台，吸弃培养基，用磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)轻轻地洗一遍；然后向每孔加入0.5 mL Trizol试剂，用移液器吹打细胞使之脱落、裂解；再将上述Trizol裂解后细胞液转入1.5 mL EP管中，在室温(15°C 30°C )下放置5分钟；向上述EP管中按照每I mL Trizol加0.2 mL氯仿的比例加入氯仿，盖上盖子，在手中用力震荡15秒，室温下(15°C 30°C)放置2 3分钟后，12000 g (2°C 8°C)离心18分钟；从离心机中取出EP管后样品分为三层，底层的黄色有机相、中间层和上层的水相；将上层水相取出至一新的1.5 mL EP管中，按照每I mL Trizol加0.5 mL异丙醇的比例加入异丙醇,在室温下(15°C 30°C)放置10分钟，12000 g (2°C 8°C )离心10分钟，然后弃去上清液；再按照每I mL Trizol加I mL 75%乙醇的比例进行涡旋混合洗涤，之后7500 g (2°C 8°C)离心5分钟，弃去上清液；沉淀物即为细胞的总RNA，使之室温下自然干燥；用不含RNA酶的去离子水溶解RNA沉淀，置于_70°C冰箱保存待用；然后取5 μ L RNA溶液，通过检测260nm及280 nm波长下紫外吸光度，估算其纯度，并计算核酸含量(RNA在260 nm波长下吸光度为I时，浓度相当于40 yg/mL)。将RNA溶液稀释至浓度为0.2 μ g/μ L，然后从中取5 μ L至PCR小管，再加入Iμ L随机六聚引物、I μ L浓度均为10 mM的dNTP混合物、3 μ L不含RNA酶的去离子水混匀，短暂离心数秒，在PCR仪上70°C反应5分钟进行变性；于冰浴下冷却退火；再依次加入4μ L 5倍浓度PrimerScript 缓冲液、0.5 μ L浓度为40 U/μ L的RNA酶抑制剂、I μ L浓度为200 U/μ L的PrimeScripteRTase和4.5 μ L不含RNA酶的去离子水，混匀为20 μ L的逆转录反应液；于PCR仪上进行逆转录反应，反应条件为:30°C反应10分钟、42° C反应45分钟、95°C反应5分钟；停止反应后，取出逆转录反应产物立即置于冰上；产物放在_20°C保存。之后以上述获得的逆转录产物作为模板进行PCR扩增，上游引物基因序列如SEQID N0.2:5’ -AGAGGTACCGATGCACCACCACCACCACCACATGAACGGGACCGAGGGCCCAA-3’ ；下游引物基因序列如 SEQ ID N0.3 所不:5，-cgcggatcctcacgtcggaacttgagacaaat_3，:冰浴下，IuL逆转录合成的cDNA模板、I μ L上游引物、I μ L下游引物、4 μ L浓度为IOmM的dNTP混合物、
0.5 μ L高保真聚合酶STAR 、IOyL PCR缓冲液(含Mg2+)和32.5 μ L去离子水混合为总量为50 μ L的反应体系，95°C预变性3分钟，接着进行30循环的94°C变性30秒、60°C退火30秒、72°C延伸70秒，最后是10°C降温10秒；PCR产物电泳后通过紫外成像系统观察电泳条带确定嗅觉受体蛋白0DR-10基因3在细胞内mRNA水平的表达。1.4 Western blot 鉴定
采用Western blot技术从蛋白水平鉴定嗅觉受体5在HEK-293细胞内的表达情况；首先在RIPA强裂解液加入PMSF，使PMSF终浓度为ImM待用；取出转染后48小时的HEK-293细胞至超净工作台，吸弃培养基，磷酸盐缓冲液洗一次，弃掉废液，置于冰上；向六孔板的每个孔中加入200 μ L裂解液，反复吹打细胞，使裂解液与细胞充分接触30分钟；细胞充分裂解后，14000g离心5分钟，取上清至离心管中即获得嗅觉受体蛋白样品；取50 μ L样品至
1.5mL的EP管中，加入12.5 μ L 5倍loading缓冲液混匀，100。。煮沸10分钟，12000g室温离心I分钟，上清液加入蛋白SDS-PAGE凝胶，120V电压下进行蛋白电泳；然后转至PVDF膜，浸于质量百分比为2.5%的牛血清白蛋白溶液中，室温摇床孵育I小时，完成封闭；然后用TBST溶液洗3遍，每次10分钟，加入一抗(抗His6-tag鼠IgG)，4°C孵育过夜；取出PVDF膜用TBST溶液洗3遍，每次10分钟，加入1:500的二抗(DyLight680标记山羊抗小鼠IgG)室温避光摇床孵育I小时；置于Odyssey双色红外激光成像系统下扫描分析；预计目标蛋白大小为45kD ;通过Western blot蛋白电泳条带的位置鉴定嗅觉受体蛋白5是否在HEK-293细胞内成功表达。
1.5提取嗅觉受体蛋白0DR-10
为将步骤1.2中制备的嗅觉受体蛋白5用作嗅觉受体传感器的敏感材料，使用膜蛋白提取试剂盒从转染后的HEK-293细胞中提取嗅觉受体蛋白0DR-10 ;先收集转染48小时的HEK-293细胞，用4°C的去离子水离心洗3次，每次5分钟；然后加入ImL蛋白提取缓冲液、IuL蛋白酶抑制剂、I μ L DDT，超声破碎4次，然后4°C 14000g离心10分钟，弃沉淀，上清液转至一新的离心管中水浴10分钟，室温下13000离心5分钟，样品分为上下两层，下层含有细胞膜蛋白；取下层样品，加入500 μ L 4°C灭菌水，4°C放置5分钟，然后37°C水浴10分钟，室温下13000离心5分钟，样品分为上下两层，重复此步骤5次；最终得到的下层样品即为膜蛋白混合物，其中包含带有融合His6-tag标签的嗅觉受体蛋白0DR-10 ;-70°C保存待用。本步骤I中，子步骤1.3和1.4用于验证嗅觉受体蛋白已成功表达在细胞膜表面，并非本步骤I的必要子步骤。2、固定嗅觉受体蛋白0DR-10在石英晶体微天平表面构建嗅觉受体传感器 本发明中嗅觉受体传感器以嗅觉受体蛋白0DR-10为敏感材料，固定在石英晶体微天
平表面，具体构建过程如下；将石英晶体微天平18置于乙醇中浸泡10分钟，氮气干燥；然后IM NaOH水溶液中浸泡20分钟，去离子水清洗；1M HCl溶液中浸泡5分钟；新配置的浓H2SO4与H2O2 (体积比2:3)混合液浸泡I分钟，氮气干燥，以完成石英晶体微天平18的彻底清洁；利用金巯键自组装反应在石英晶体微天平18的金电极9上共价固定一层可以特异性识别融合表达的His6-tag标签6的巯基化单链DNA适配体8，该适配体8由5’末端共价修饰了 HS-(CH2)6 基团的 SEQ ID N0.5 所示的基因序列组成(5’-HS-(CH2)6_GCTATGGGTGGTCTGGTTGGGATTGGCCCCGGGAGCTGGC-3’)，室温下反应21小时；然后封闭分子7 (11-MUA)封闭石英晶体微天平传感器的金电极17表面未反应的位点，封闭条件为室温下I小时；把步骤1.5制备的含有嗅觉受体蛋白5的细胞膜蛋白混合液均匀孵育在石英晶体微天平传感器的金电极9表面,并放在室温孵育过夜,使嗅觉受体蛋白5通过融合表达的His6-tag标签6与适配体8发生特异性的结合反应，实现嗅觉受体蛋白5在石英晶体微天平传感器的金电极9表面特异性固定和纯化；细胞膜的磷脂双分子层4有利于保持嗅觉受体蛋白0DR-10的天然构象；N2吹干后将表面固定有嗅觉受体蛋白5的石英晶体微天平18安装在检测系统中，完成嗅觉受体传感器的构建，以用于气味物质的检测。3、气味物质丁二酮的检测
3.1石英晶体微天平传感器原理
本发明中使用石英晶体微天平作为嗅觉受体传感器的二级传感器，石英晶体微天平是一种质量敏感型传感器，基本原理是石英晶体的谐振频率与其表面的表面微小的压力改变相关，通过记录石英晶体谐振频率的改变监测石英晶体表面微小的压力变化。基于此原理，也可以通过监测石英晶体谐振频率的变化来检测石英晶体表面微小的质量变化。利用这个原理将石英晶体微天平与嗅觉受体蛋白结合构建嗅觉受体传感器，嗅觉受体蛋白作为敏感元件固定在石英晶体微天平敏感电极表面，与待测物质发生特异性吸附作用后，石英晶体微天平可以到检测这一过程。当气味物质被固定于石英晶体表面的嗅觉受体蛋白所吸附时，石英晶体微天平表面的质量也发生变化，引起石英晶体谐振频率的改变，而且频率的改变与石英晶体表面质量的改变成正比，满足公式其中为石英晶体谐振频率的变化(Hz)，^为石英晶体表面的质量变化(g)，f为相关系数，Z7为石英晶体的初始频率(MHz)，A为电极总的表面积(cm2)，r为晶体的密度(g/cm3)， 为晶体的厚度(cm)。因此，通过监测石英晶体谐振频率的变化可以计算出其表面的质量变化，获得气味物质与表面嗅觉受体蛋白相互作用信息，间接计算出气味物质的浓度，最终实现对气味物质的特异性检测。3.2嗅觉受体传感器检测气体的过程
石英晶体微天平传感器18谐振频率的信号通过传感器电极接口 19传送到QCM200检测系统20 (Stanford Research Systems, Inc., USA),以记录气味物质与嗅觉受体蛋白5相互作用引起的石英晶体微天平传感器18谐振频率的改变量；首先打开第一气阀11并关闭第二气阀23，由注射泵12通过气体管路14将洁净空气气袋21中的空气以lmL/s的流速泵入检测腔内，待石英晶体微天平传感器18的谐振频率达到一个稳定的状态后，再打开第二气阀23并关闭第一气阀11将浓度确定的含有气味物质丁二酮的待测气体从待测气体气袋22泵入检测腔，待石英晶体微天平传感器18的谐振频率再次稳定后，谐振频率的改变量即为传感器对此浓度下的气体物质丁二酮的响应值；最后再打开第一气阀11并关闭第二气阀23，将洁净空气泵入检测腔内，清洗气体检测腔，即完成一次检测过程；至少间隔IOmin后，待石英晶体微天平传感器18的谐振频率稳定后可泵入另一待测气体到检测腔进行下一次检测；重复上述步骤，得到一系列浓度的气体物质丁二酮引起的传感器谐振频率改变量，得到丁二酮浓度-谐振频率改变量曲线。对于未知浓度的气体物质丁二酮的检测，首先打开第一气阀11并关闭第二气阀23，由注射泵12通过气体管路14将洁净空气气袋21中的空气以lmL/s的流速泵入检测腔内，待石英晶体微天平传感器18的谐振频 率达到一个稳定的状态Ftl后，再打开第二气阀23并关闭第一气阀11将浓度未知的待测气体从待测气体气袋22泵入检测腔，待石英晶体微天平传感器18的谐振频率再次稳定到F1后，得到谐振频率改变量F1- F0,根据上述步骤得到的丁二酮浓度-谐振频率改变量曲线推算出待测气体物质丁二酮的浓度，实现对丁二酮的浓度测定。下面结合附图和实施例进一步说明本发明，本发明的目的和效果将变得更加明显。如图1所示，本发明制备的嗅觉受体蛋白0DR-10的基因结构图，图中，融合表达的His6-tag基因1、rho-tag信号肽基因2、嗅觉受体蛋白0DR-10基因3，这种基因结构设计表达的嗅觉受体蛋白0DR-10在N末端带有融合表达的His6-tag标签和rho-tag信号肽，融合表达的His6-tag标签有助于将嗅觉受体蛋白0DR-10有效地固定在石英晶体微天平的金电极，rho-tag信号肽有利于嗅觉受体蛋白0DR-10在细胞膜的正确定位；图2所示为本发明中嗅觉受体蛋白0DR-10固定在石英晶体微天平表面上的示意图，N末端融合表达有His6-tag标签6的嗅觉受体蛋白5,通过His6_tag标签6与适配体8之间的特异性相互结合被固定在石英晶体10表面的金电极9上，细胞膜成分的脂质双分子层4有利于保持嗅觉受体蛋白5的天然构象，封闭分子7用于封闭金电极表面的裸露位点；图3所示为嗅觉受体传感器检测系统结构图，其中石英晶体微天平18的表面即图2所示，表面已经成功固定好嗅觉受体蛋白0DR-10，通过控制第一气阀11和第二气阀23将洁净空气气袋21和待测气体气袋22由注射泵12泵入检测腔体16中，检测腔的盖子15通过螺纹旋在检测腔体16上方，废气通过气体管路14进入废气气袋13，橡胶密封圈17用于将石英晶体微天平18固定在检测腔体16中，信号输出电极19将石英晶体微天平18的谐振频率信号连接至QCM200检测系统20内进行信号的实时记录；图4是是本发明制备嗅觉受体蛋白ODR-1O的RT-PCR结果图，目标条带大约在1.lkb，提示嗅觉受体蛋白5在细胞内mRNA水平上显著表达；图5本发明制备嗅觉受体蛋白0DR-10的Western blot结果图，目标条带大约在45KD,表明在蛋白质水平已经将嗅觉受体蛋白5成功表达在HEK-293细胞内；图6是本发明嗅觉受体传感器检测几种气味物质的结果图，该结果说明采用嗅觉受体蛋白0DR-10作为敏感材料的嗅觉受体传感器对气味物质丁二酮最敏感，其他几种气体引起的响应相对较小，因此该嗅觉受体传感器具有良好的特异性；图7是本发明制备的嗅觉受体传感器检测不同浓度丁二酮的结果图，最低检测下限大约为1.5ppm,检测灵敏度大约为0.55 ±0.024 Hz/ppm,综上所述此嗅觉受体传感器能够灵敏、特异地检测气味物质丁二酮。<110>浙江大学
〈120〉一种基于嗅觉受体传感器检测气味物质丁二酮的方法
〈160〉5
<170>PatentIn version 3.3
〈210〉 I〈211〉 5778〈212〉 DNA
<213> Caenorhabditis eIegans〈400〉 I
tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg60
cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt120
gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca180
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catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac360
catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg420
atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg480
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ccggactcag atctcgagat gaacgggacc gagggcccaa acttctacgt gcctttctcc660
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aaaacacgtg gaaaaaactt gggcacttat aaatatctca tggcgttttt ctcagtattc840
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gtccgccatg cccgaaggct acgtccagga gcgcaccatc ttcttcaagg acgacggcaa2040
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cgccgccggg atcactctcg gcatggacga gctgtacaag taaagcggcc gcgactctag2460
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cctgaatgaa ctgcaagacg aggcagcgcg gctatcgtgg ctggccacga cgggcgttcc3900
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tgatctggac gaagagcatc aggggctcgc gccagccgaa ctgttcgcca ggctcaaggc4200
gagcatgccc gacggcgagg atctcgtcgt gacccatggc gatgcctgct tgccgaatat4260catggtggaa aatggccgct tttctggatt catcgactgt ggccggctgg gtgtggcgga4320
ccgctatcag gacatagcgt tggctacccg tgatattgct gaagagcttg gcggcgaatg4380
ggctgaccgc ttcctcgtgc tttacggtat cgccgctccc gattcgcagc gcatcgcctt4440
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gcgacgccca acctgccatc acgagatttc gattccaccg ccgccttcta tgaaaggttg4560
ggcttcggaa tcgttttccg ggacgccggc tggatgatcc tccagcgcgg ggatctcatg4620
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〈210〉2
〈211〉53
〈212〉DNA〈213〉人工设计
〈400〉 2
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〈210〉3
〈211〉32
〈212〉DNA〈213〉人工设计
〈400〉 3
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〈210〉4
〈211〉6322
〈212〉DNA
<213>Caenorhabditis elegans
〈400〉4gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg60
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cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc5400
agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca5460
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atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg5880
权利要求
1.一种基于嗅觉受体传感器检测气味物质丁二酮的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤: (O制备嗅觉受体蛋白ODR-1O ； (2)固定嗅觉受体蛋白0DR-10在石英晶体微天平表面构建嗅觉受体传感器； (3)将洁净空气以lmL/s的流速泵入检测腔内，待石英晶体微天平传感器的谐振频率达到一个稳定的状态后，再将浓度确定的含有气味物质丁二酮的待测气体泵入检测腔，待石英晶体微天平传感器的谐振频率再次稳定后，谐振频率的改变量即为嗅觉受体传感器对此浓度下的气体物质丁二酮的响应值；最后再将洁净空气泵入检测腔内，清洗气体检测腔，即完成一次检测过程；至少间隔IOmin后，待石英晶体微天平传感器的谐振频率稳定后可泵入另一浓度待测气体到检测腔进行下一次检测；重复上述步骤，得到一系列浓度的气体物质丁二酮引起的传感器谐振频率改变量，得到丁二酮浓度-谐振频率改变量曲线； (4)对于未知浓度的气体物质丁二酮的检测，首先将洁净空气以lmL/s的流速泵入检测腔内，待石英晶体微天平传感器的谐振频率达到一个稳定的状态Ftl后，再将浓度未知的待测气体泵入检测腔，待石英晶体微天平传感器的谐振频率再次稳定到F1后，得到谐振频率改变量F1- Ftl，根据上述步骤3得到的丁二酮浓度-谐振频率改变量曲线获得待测气体物质丁二酮的浓度，实现对丁二酮的浓度测定。
2.根据权利要求1所述一种基于嗅觉受体传感器检测气味物质丁二酮的方法，其特征在于，所述步骤I包括以下子步骤: (1.0构建表达载体:首先采用基因工程技术对含有嗅觉受体蛋白0DR-10基因和rho-tag信号妝序列全长cDNA饱质MlPEGFP-Nl/rho-tag/odr-ΙΟ (其基因序列如SEQ IDN0.1所示)进行适当改造，构建适用于嗅觉受体传感器使用的嗅觉受体蛋白的表达载体，使其N末端带有融合表达的His6-tag标签；首先，设计相应的引物，获取和扩增嗅觉受体蛋白0DR-10基因和rho-tag信号肽序列全长cDNA，并在N末端添加融合表达的His6_tag标签，上游引物序列SEQ ID N0.2 ;下游引物序列如SEQ ID N0.3所示；聚合酶链式反应在50 μ L反应体系中进行，温度循环首先是95°C预变性3分钟，接着进行30循环的94°C变性30秒、60°C退火30秒、72°C延伸70秒，最后是10°C降温10秒；扩增后获得的产物rho-tag/odr-10通过限制性内切酶的双酶切反应亚克隆到表达载体pcDNA3.1 (+)的多克隆位点Kpn I和BernH /之间，完成嗅觉受体蛋白的表达载体pciWA .1 (+)/his6~tag/rho-tag/odr-10的构建，其基因序列如SEQ ID N0.4通过测序进行鉴定； (1.2)转染人胚胎肾细胞HEK-293:HEK_293细胞培养液为添加了体积百分比为10%的胎牛血清、青霉素(100 U/mL)和链霉素(100 μ g/mL)的DMEM高糖培养基，培养条件为37°C、体积百分比为5% CO2的培养箱；转染之前一天，HEK-293细胞被接种于六孔培养皿中，每孔接种500 μ L浓度为0.5 2Χ IO5 cells/mL的细胞，在不含抗生素的DMEM高糖培养基里生长至融合度约为80-90%，待转染；转染试剂为Iipofectamin 2000，使用步骤1.1构建好的表达载体制J.1 (+)/his6-tag/rho-tag/odr-10转染HEK-293细胞；用无血清DMEM培养液把4 μ g表达载体稀释至50 μ L，混匀；再用无血清DMEM培养液稀释10 μ L的脂质体转染试剂Iipfectamin 2000至50 μ L，在室温下孵育5分钟；接着把稀释后的表达载体和Iipfectamin 2000混合至总体积为100 μ L,摇匀，室温孵育20分钟；六孔板的每个孔中加入100 μ L表达载体和Iipfectamin 2000的混合液，前后摇板混匀后，在37°C、体积百分比为5% CO2的培养箱孵育24-48小时后，嗅觉受体蛋白即表达在HEK-293细胞膜表面，以备用作嗅觉受体传感器的敏感材料； (1.3)提取嗅觉受体蛋白0DR-10:为将步骤1.2中制备的嗅觉受体蛋白0DR-10用作嗅觉受体传感器的敏感材料，使用膜蛋白提取试剂盒从转染后的HEK-293细胞中提取嗅觉受体蛋白0DR-10 ;先收集转染48小时的HEK-293细胞，用4°C的去离子水离心洗3次，每次5分钟；然后加入ImL蛋白提取缓冲液、I μ L蛋白酶抑制剂、I μ L DDT，超声破碎4次，然后40C 14000g离心10分钟，弃沉淀，上清液转至一新的离心管中水浴10分钟，室温下13000离心5分钟，样品分为上下两层，下层含有细胞膜蛋白；取下层样品，加入500 μ L 4°C灭菌水，4°C放置5分钟，然后37°C水浴10分钟，室温下13000离心5分钟，样品分为上下两层，重复此步骤5次；最终得到的下层样品即为膜蛋白混合物，其中包含带有融合His6-tag标签的嗅觉受体蛋白0DR-10 ;-70°C保存待用。
3.根据权利要求1所述一种基于嗅觉受体传感器检测气味物质丁二酮的方法，其特征在于，所述步骤2具体为:将石英晶体微天平置于乙醇中浸泡10分钟，氮气干燥；然后IMNaOH水溶液中浸泡20分钟，去离子水清洗；1M HCl溶液中浸泡5分钟；浓H2SO4与H2O2按体积比2:3组成的混合液中浸泡I分钟，氮气干燥，以完成石英晶体微天平的彻底清洁；利用金巯键自组装反应在石英晶体微天平的金电极上共价固定一层可以特异性识别融合表达的His6-tag标签的巯基化单链DNA适配体，该适配体由5’末端共价修饰了 HS-(CH2)6基团的SEQ ID N0.5所示的基因序列组成，室温下反应21小时；然后封闭分子Il-MUA封闭石英晶体微天平传感器的金电极表面未反应的位点，封闭条件为室温下I小时；把步骤1.5制备的含有嗅觉受体蛋白的细胞膜蛋白混合液均匀孵育在石英晶体微天平传感器的金电极表面，并放在室温孵育 过夜，使嗅觉受体蛋白通过融合表达的His6-tag标签与适配体发生特异性的结合反应，实现嗅觉受体蛋白在石英晶体微天平传感器的金电极表面特异性固定和纯化。
全文摘要
本发明公开了一种基于嗅觉受体传感器检测气味物质丁二酮的方法，首先在HEK-293细胞表面表达了带有His6-tag标签的嗅觉受体蛋白ODR-10，并提取出来将其利用适配体有效地固定在石英晶体微天平表面构建成嗅觉受体传感器；通过测试一系列确定浓度气味物质丁二酮，得到丁二酮浓度-谐振频率改变量标准曲线；然后测试未知浓度待测气体，根据石英晶体微天平谐振频率的改变量和丁二酮浓度-谐振频率改变量标准曲线得到待测气体中气味物质丁二酮的浓度。本发明方法所需仪器简单、操作方便，解决了敏感元件嗅觉受体蛋白ODR-10与石英晶体微天平的稳定耦合，实现了快速、特异地检测气味物质丁二酮。
文档编号G01N5/02GK103149111SQ20131006040
公开日2013年6月12日 申请日期2013年2月26日 优先权日2013年2月26日
发明者杜立萍, 吴春生, 邹玲, 王平 申请人:浙江大学