专利名称：一种提取三叶鬼针草根系分泌物的方法
技术领域：
本发明涉及的是一种提取三叶鬼针草根系分泌物的方法，属于外来入侵物种防治技术领域。
背景技术：
近几十年来，随着全球变化加剧以及我国对外贸易、旅游和交通的发展，外来植物入侵发生的频度和危害的程度都在迅速增加。这些入侵者严重威胁着生物多样性、经济和环境。我国每年由外来种入侵造成的经济损失超过70亿美元。三叶鬼针草(Bidens pilosa L.)又名一包针、一把针、婆婆针、盲肠草等，为菊科鬼针草属一年生草本植物，原产热带美洲，由于瘦果冠毛芒状具倒刺，可附着于人、物上远距离传播。该草生长速度极快，可以作为家兔饲料加以利用；其味苦而无毒，具有清热解毒，活血散瘀消肿之功效，可以用于治疗痢疾、腹泻、感冒、炎症等。其有害的一面是入侵性非常强，对农田生产、果园、草坪、环境和生物多样性等造成严重的影响，已广泛分布于我国华东、华中、华南、中南、西南等地。
发明内容
本发明提出的是一种提取三叶鬼针草根系分泌物的方法，其目的是提升提取物含量，拓展对外来入侵物种的根系分泌物研究。本发明的技术解决方案:一种提取三叶鬼针草根系分泌物的方法，包括如下步骤:
一、三叶鬼针草根系分泌物的收集装置设计；
二、三叶鬼针草根系分泌物的提纯方法。本发明的优点:设计简单，时间较短，造价低廉，形成闭合循环系统可多次重复利用；提取根系分泌物含量高，充分利用植物根系的生长阶段；无破坏性，无污染；同时对于其他外来入侵物种的根系分泌物研究也有一定的借鉴意义。
图1是三叶鬼针草根系分泌物收集流程示意图。
具体实施例方式实施例，提取三叶鬼针草根系分泌物的方法，包括如下步骤:
一、三叶鬼针草根系分泌物收集装置的设计；
二、三叶鬼针草根系分泌物的提纯方法。所述的步骤一，三叶鬼针草根系分泌物收集装置的设计；具体包括如下步骤，
1、实验材料:
I)底部带Teflon塞的玻璃瓶规格IOcmX 15cm ;螺动泵(BT100-1L)连接管路均采用Teflon材料；树脂层析柱的规格为20mmX 250mm;树脂选用AB-8大孔中性吸附树脂；生长介质:石英砂为白色，无其他杂色，石英砂粒径为0.5-1.0_，玻璃珠粒径为10 _，石英砂和玻璃珠的粒径比例为5:1;
2)实验预培养15天龄的完整三叶鬼针草植株幼苗，茎高15cm，洗净营养土待用；
3)配置Hoagland’s原液5L，用去离子水稀释100倍为实验营养液，实验选用Hoagland’ s配方pH=6.0，取各药品的质量浓度分别为:
硝酸钙浓度为945mg/L，硝酸钾浓度为506mg/L，硝酸铵浓度为80mg/L，磷酸二氢钾浓度为136mg/L，硫酸镁浓度为493mg/L，七水合硫酸亚铁浓度为3.45mg/L,乙二胺四乙酸二钠浓度为4.66mg/L ；
2、装置预处理:
1)将带Teflon塞的玻璃瓶、玻璃树脂层析柱和Teflon材料的连接管路用0.5%质量的盐酸浸泡24h ;取出用去离子水冲洗，然后用洁净超纯水润洗12h ;放入烘箱烘干；分别将带Teflon塞的玻璃瓶和玻璃树脂层析柱用黑色不透明胶纸把瓶身包裹，使瓶壁和柱壁不透光；
2)石英砂和玻璃珠均用去离子水浸泡24h，放入烘箱烘干待用；
3)AB-8大孔中性吸附树脂，首先，用0.5倍于树脂柱体积的分析纯无水乙醇润洗，然后将润洗后的AB-8大孔中性吸附树脂浸泡于无水乙醇中24h ;其次，用2倍体积的无水乙醇冲洗浸泡后的AB-8大孔中性吸附树脂，直至AB-8大孔中性吸附树脂不再流出白色浑浊物为止；再次，用4-6倍体积的重量浓度为5%HC1溶液冲洗AB-8大孔中性吸附树脂，浸泡2h后用去离子水洗至中性；再用2倍体积的重量浓度为2%NaOH溶液冲洗AB-8大孔中性吸附树脂，浸泡2h，最后用去离子水洗至中性；
3、装置组装:
1)将15天龄的三叶鬼针草幼苗取出40株，放入事先放入玻璃珠的带Teflon塞的玻璃瓶内，用处理过的石英砂固定并包埋，加入稀释100倍的Hoagland’ s营养液250mL ；
2)用2倍体积的稀释100倍的Hoagland’s营养液冲洗AB-8大孔中性吸附树脂，然后接在带Teflon塞的玻璃瓶下；
3)用Teflon材料的连接管路将AB-8大孔中性吸附树脂与带Teflon塞的玻璃瓶相互连接，形成回路；
4)接入BT100-1L型蠕动泵，设置流速为5mL/min，保持实际滴速为30滴/min，打开各个阀门，打开蠕动泵，营养液开始循环，闭合回路开始工作。所述的步骤二、三叶鬼针草根系分泌物的提纯方法，具体如下步骤包括，
1)装置运行两天后，关闭阀门和蠕动泵，取下AB-8大孔中性吸附树脂；
2)每根AB-8大孔中性吸附树脂分别用分析纯甲醇溶液作为洗脱液，以2倍AB-8大孔中性吸附树脂体积的甲醇洗脱树脂；
3)平均每柱分析纯甲醇洗脱液为50mL，将洗脱液收集转移入心形瓶中；
4)将心形瓶接入BUCHI旋转蒸发仪(R210/R215)上，BUCHI旋转蒸发仪(R210/R215)设置的旋蒸气体为甲醇，恒定水温45°C，转速为BUCHI旋转蒸发仪(R210/R215)上标注的2档，系统压强200-220mbar ；
5)旋转蒸发洗脱液至其不再减少时停止旋蒸，将旋蒸后的洗脱液转移入50mL离心管中，用去离子水冲洗心形瓶；
6)将50mL离心管密封，放入_70°C的低温冰箱中冷冻，约72h后取出；
7)将50mL离心管放入ChristALPHA 1-2 LD plus冷冻干燥仪中，将固态水分全部抽出，得到粉末状的根系分泌物提取物；
实验得到根系分泌物的数据参考，每管为40个植株2天的根系分泌物收集量:
权利要求
1.一种提取三叶鬼针草根系分泌物的方法，其特征是该方法包括如下步骤: 一、三叶鬼针草根系分泌物收集装置的设计； 二、三叶鬼针草根系分泌物的提纯方法。
2.根据权利要求1所述的一种提取三叶鬼针草根系分泌物的方法，其特征是所述的步骤一，三叶鬼针草根系分泌物收集装置的设计；具体包括如下步骤， 1、实验材料: O底部带Teflon塞的玻璃瓶规格IOcmX 15cm ；BT100-1L型蠕动泵连接管路均采用Teflon材料；树脂层析柱的规格为20mmX 250mm;树脂选用AB-8大孔中性吸附树脂；生长介质:石英砂为白色，无其他杂色，石英砂粒径为0.5-1.0_，玻璃珠粒径为10 _，石英砂和玻璃珠的粒径比例为5:1; 2)实验预培养15天龄的完整三叶鬼针草植株幼苗，茎高15cm，洗净营养土待用； 3)配置Hoagland’s原液5L，用去离子水稀释100倍为实验营养液，实验选用Hoagland’ s配方pH=6.0，取各药品的质量浓度分别为: 硝酸钙浓度为945mg/L，硝酸钾浓度为506mg/L，硝酸铵浓度为80mg/L，磷酸二氢钾浓度为136mg/L，硫酸镁浓度为493mg/L，七水合硫酸亚铁浓度为3.45mg/L,乙二胺四乙酸二钠浓度为4.66mg/L ； 2、装置预处理: 1)将带Teflon塞的玻璃瓶、玻璃树脂层析柱和Teflon材料的连接管路用0.5%质量的盐酸浸泡24h ;取出用去离子水冲洗，然后用洁净超纯水润洗12h ;放入烘箱烘干；分别将带Teflon塞的玻璃瓶和玻璃树脂层析柱用黑色不透明胶纸把瓶身包裹，使瓶壁和柱壁不透光； 2)石英砂和玻璃珠均用去离子水浸泡24h，放入烘箱烘干待用； 3)AB-8大孔中性吸附树脂，首先，用0.5倍于树脂柱体积的分析纯无水乙醇润洗，然后将润洗后的AB-8大孔中性吸附树脂浸泡于无水乙醇中24h ;其次，用2倍体积的无水乙醇冲洗浸泡后的AB-8大孔中性吸附树脂，直至AB-8大孔中性吸附树脂不再流出白色浑浊物为止；再次，用4-6倍体积的重量浓度为5%HC1溶液冲洗AB-8大孔中性吸附树脂，浸泡2h后用去离子水洗至中性；再用2倍体积的重量浓度为2%NaOH溶液冲洗AB-8大孔中性吸附树脂，浸泡2h，最后用去离子水洗至中性； 3、装置组装: 1)将15天龄的三叶鬼针草幼苗取出40株，放入事先放入玻璃珠的带Teflon塞的玻璃瓶内，用处理过的石英砂固定并包埋，加入稀释100倍的Hoagland’ s营养液250mL ； 2)用2倍体积的稀释100倍的Hoagland’s营养液冲洗AB-8大孔中性吸附树脂，然后接在带Teflon塞的玻璃瓶下； 3)用Teflon材料的连接管路将AB-8大孔中性吸附树脂与带Teflon塞的玻璃瓶相互连接，形成回路； 4)接入BT100-1L型蠕动泵，设置流速为5mL/min，保持实际滴速为30滴/min，打开各个阀门，打开蠕动泵，营养液开始循环，闭合回路开始工作。
3.根据权利要求1所述的一种提取三叶鬼针草根系分泌物的方法，其特征是所述的步骤二、三叶鬼针草根系分泌物的提纯方法，具体如下步骤包括，1)装置运行两天后，关闭阀门和蠕动泵，取下AB-8大孔中性吸附树脂； 2)每根AB-8大孔中性吸附树脂分别用分析纯甲醇溶液作为洗脱液，以2倍AB-8大孔中性吸附树脂体积的甲醇洗脱树脂； 3)平均每柱分析纯甲醇洗脱液为50mL，将洗脱液收集转移入心形瓶中； 4)将心形瓶接入BUCHI旋转蒸发仪上，BUCHI旋转蒸发仪设置的旋蒸气体为甲醇，恒定水温45°C，转速为BUCHI旋转蒸发仪上标注的2档，系统压强200_220mbar ； 5)旋转蒸发洗脱液至其不再减少时停止旋蒸，将旋蒸后的洗脱液转移入50mL离心管中，用去离子水冲洗心形瓶； 6)将50mL离心管密封，放入_70°C的低温冰箱中冷冻，约72h后取出； 7)将50mL离心管放入ChristALPHA 1-2 LD plus冷冻干燥仪中，将固态水分全部抽出，得到粉末状的根系分泌物提取物； 实验得到根系分泌物的数据参考，每管为40个植株2天的根系分泌物收集量: I号瓶处理前12.5222g，处理后12.5582g，有效质量0.036g ； 2号瓶处理前12.1084g ，处理后12.1434g，有效质量0.035g。
全文摘要
本发明是一种提取三叶鬼针草根系分泌物的方法，包括如下步骤一、三叶鬼针草根系分泌物的收集装置设计；二、三叶鬼针草根系分泌物的提纯方法。本发明的优点设计简单，时间较短，造价低廉，形成闭合循环系统可多次重复利用；提取根系分泌物含量高，充分利用植物根系的生长阶段；无破坏性，无污染；同时对于其他外来入侵物种的根系分泌物研究也有一定的借鉴意义。
文档编号G01N1/34GK103115794SQ20131007201
公开日2013年5月22日 申请日期2013年3月7日 优先权日2013年3月7日
发明者沈羽, 张开梅, 方炎明, 刘颖 申请人:南京林业大学