一种原位同时测定培养基中四价、五价钒含量的方法
【专利摘要】本发明公开的一种原位同时测定培养基中四价、五价钒含量的方法，用于研究牛肉膏蛋白胨液体培养基中微生物对四价钒的氧化作用和对五价钒的还原作用强度。该方法通过调整培养基配方，建立了显色反应体系（包括反应试剂量、添加顺序、显色时间及其他条件），利用分光光度法，比较微生物作用前后培养基的吸光度曲线的变化，实现了培养基中四价、五价钒的原位同时测定。该方法具有设备要求低，操作简单、测定准确，重现性好等特点，特别适合定性定量研究微生物对钒的氧化还原能力。
【专利说明】一种原位同时测定培养基中四价、五价钒含量的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种测定培养基中四价、五价钒的方法，该方法实现了培养基中四价、五价钒的原位同时测定，用于定性定量测定微生物对钒的氧化还原作用。
【背景技术】
[0002]钒作为一种环境重金属污染物正越来越受到人们的关注，与钒相关的报道不断出现，人们除了希望了解环境中钒含量的情况外，更多地开始对钒不同价态进行研究。自然界中钒存在着广泛的氧化还原反应，其中很重要的一部分是通过微生物完成的。因此判别哪些微生物可以进行钒的氧化还原作用及作用强度，对于钒污染环境修复、钒污染解毒、微生物钒耐受机理、钒矿微生物浸提、钒的地球生物转化等问题都具有重要意义。
[0003]实际操作过程中，常将钒作为外援添加物添加到培养基中，在实验室条件下来研究微生物对钒的氧化还原作用。对于钒的测定方法很多，例如原子吸收和发射光谱、电化学方法、流动注射法、高效液相色谱法、比色法等。对于不同价态钒的测定通常选择分离测定，将四价和五价的钒用色谱柱分离，然后分别测定；或者分步测定，第一步直接测定样品中四价的钒含量，第二部把五价的钒全部还原，再测定四价钒的总量，然后减去第一步测定的四价钒含量，从而间接的表示出五价钒含量。这些方法前处理复杂耗时，不能及时的反映微生物对钒的氧化还原作用。对于不同价态钒的同时测定方法也有一些，但是在样品前处理中需要消煮。消煮过程中，培养基中的有机物大量被氧化，势必造成钒的化学还原反应发生，无法客观的反应出微生物的氧化还原贡献量。
[0004]为了及时、准确的反应微生物对培养基中不同价态钒的氧化还原能力，一种原位同时测定培养基中四价、五价钒的方法就特别有意义，然而目前还没有这种方法。
【发明内容】
[0005]为了解决上述技术难题，本发明的目的是提供一种原位同时测定培养基中四价、五价钒的方法。用于研究培养基中的微生物对钒的氧化还原作用及强度。
[0006]本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是:培养基配方调整、以同浓度培养基为溶剂制作标准曲线、建立显色反应体系、用0.22 ym滤膜过滤、定性结果分析及定量波长选择等方法。
[0007]无特殊说明时，所有试剂均使用优级纯标准，试剂配制过程以超纯水进行稀释。方法的检测范围为4"16 mg.L'
[0008]本发明采用分光光度法测定培养基中的四价、五价钒，具有操作简便、条件易得，简单快速准确，可重复等优点，适合推广使用。
【专利附图】
【附图说明】
[0009]图1不同浓度四价、五价钒单独吸光度曲线参考线
图中40(T600 nm范围内较平缓的线(吸光度随波长的改变，变化不大)为只含四价钒显色后的吸光度曲线，浓度越大吸光度值越大；400 nm处吸光度较大，而在50(T600 nm范围内基本没有吸收的曲线为只含五价钒显色后的吸光度曲线，浓度越大，400^450 nm范围内的吸光度越大；最下面的一条线为去离子水吸光度曲线。
[0010]图2五价钒被还原举例图(定性分析)
在50(T600 nm范围内从上到下四条线代表四种液体的吸光度曲线，这四种液体分别是:内含5 mg/L VOSO4的新鲜培养基溶液、内含5 mg/L Na3VO4培养基接种后培养3天、内含5 mg/L Na3VO4的新鲜培养基、未加钒的新鲜培养基。从图中可以看出，在微生物存在的情况下培养数天，50(T600 nm范围内的吸光度值升高(表示四价钒含量在增加)，同时400-450nm范围的吸光度值降低。
[0011]图3四价钒被氧化举例图(半定量)
图中标有数字的线表示只含有四价钒的新鲜培养基的吸光曲线，数字表示四价钒的浓度，单位为mg/L。图中未标数字的线为钒发生了氧化反应的线(四价、五价钒同时存在)，内含7 mg/L的四价钒的培养基，在微生物存在的情况下培养数天后，四价钒的含量降低到:3-5mg/L。50(T600 nm范围内的吸光度值降低，同时400~450 nm范围的吸光度值升高。
[0012]图4标准曲线(定量计算)
配制内含4~16 mg/L的四价、五价钒的培养基，在对应波长下测定吸光度值，绘制标准曲线。每条线最近处的方程是取截距为零的线性拟合方程，R2表示相关系数。
【具体实施方式】
[0013]主要试剂配置
1、四价钒标准液:钒含量为20%的V0S04(分子量163)0.25g，浓磷酸Iml定容到500ml (0.1 mg.L 1)；
2、五价钒标准液=Na3VO4.12H20 (分子量 400) 0.4g，定容到 500 ml (0.1 mg.l-1)；
3、磷钨酸应用液(显色剂)=Na2WO4.2Η20 (分子量330) 132g，溶于300 ml水，磷酸调PH= 3，定容于 500ml (0.8M)；
4、调整后的牛肉膏蛋白胨培养基:蛋白胨4g、牛肉膏2 g、氯化钠5 g、蒸馏水500 mlρΗ=7.4。
[0014]操作流程
培养基中标准参考吸光度曲线制作:(8.5-a)ml去离子水，0.1 ml不含钒培养基，a ml(0.4<a<l.6)钒标准液，0.2 ml浓硫酸，0.2 ml浓磷酸，I ml磷钨酸应用液。摇匀静置显色0.5~1 h (显色及沉淀)取上清液过0.22 μ m水系滤膜。在40(T600 nm范围内做吸光度曲线作为参考曲线(如图1)。五价钒在420 nm记录吸光度值并绘制标准曲线I,得到吸光度系数A1 (0.0319为实例中测试结果，见图4，下同);四价钒在510 nm和420 nm记录吸光度值并绘制标准曲线II和III分别得到吸光度系数A2 (0.0131)和^ (0.0107)，图4为一例。
[0015]样品测定:无菌培养基中含有已知浓度的四价钥;或五价钥;(400~1600 mg.!/1),无菌操作接入已知菌种，培养一段时间。取样品0.lml，加入到8.5 ml去离子水中，然后加入0.2 ml浓硫酸，0.2 ml浓磷酸，I ml磷钨酸应用液。摇匀静置显色0.5^1 h(显色及沉淀)，取上清液过0.22 μπι水系滤膜。在40(T600 nm范围内做吸光度曲线，并记录510 nm和420 nm处的吸光度值，分别记做E1和E2。[0016]结果比较与计算
定性分析:将样品吸光度曲线与标准吸光度曲线参考曲线形状和位置比较做出定性结论(具体见图3说明)
定量分析:样品中四价钒的含量=E1A2
样品中五价钥;的含量=(E2-E1^a3A2) /A1 定量方法准确性评估
为评估方法的可靠性，将配置好的已知浓度的样品当做未知样品测定，通过测定吸光度进行计算得到计算值，将计算值与真值(添加量)比较的到较满意的回收率，方法准确度较高。其中回收率(％)=计算值/添加量*100。
【权利要求】
1.一种原位同时测定培养基中四价、五价钒的方法，主要是通过培养基配方改进，显色反应体系建立，测定波长选择，实现了培养基中四价、五价钒的原位同时测定，方法的特征在于培养基调整，显色体系条件设定及波长的选择。
2.根据权利要求1所述的一种原位同时测定培养基中四价、五价钒的方法，其特征是对牛肉膏蛋白胨培养基组成进行改进，将牛肉膏和蛋白胨的比例降低10%~30%，使其干扰降低。
3.根据权利要求1所述的一种原位同时测定培养基中四价、五价钒的方法，其特征是用同等浓度的培养基作为背景溶剂，配置四价和五价钒标准样品。
4.根据权利要求1所述的一种原位同时测定培养基中四价、五价钒的方法，其特征是显色反应体系为:依次向试管中添加8.5 ml去离子水、0.1 ml培养基(样品)、0.2 ml浓硫酸、0.2 ml浓磷酸、1 ml磷钨酸，混合均匀室温静置0.5-1 h ;取上清液过0.22 μ m水系滤膜测定。
5.根据权利要求1所述的一种原位同时测定培养基中四价、五价钒的方法，其特征是使用分光光度检测滤液，测试并绘制400-600 nm范围内的吸光度曲线，作为定性分析数据依据；记录波长为510 nm和420 nm处的吸光度值，作为定量计算依据。
【文档编号】G01N21/31GK103512853SQ201310428377
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2013年9月18日 优先权日:2013年9月18日
【发明者】杨杰, 杨金燕, 李廷强, 王斌 申请人:四川大学, 浙江大学