一种鉴定柳杉瘿瘤病感染状况的方法
【专利摘要】本发明公开了一种鉴定柳杉瘿瘤病感染状况的方法，包括：取适量待检柳杉枝条或针叶，经干燥、研磨成粉末后与溴化钾混合，制成压片；采集所述压片的红外光谱图；根据红外光谱图，判断待检柳杉是否感染瘿瘤病。本发明利用傅里叶变换红外光谱技术发现了健康柳杉与患瘿瘤病柳杉的红外光谱图之间特征峰的差异，利用该差异来检测柳杉是否被瘿瘤病原菌侵染，检测过程无损、快速、准确，操作方便，不依赖于人的经验，且安全性和重复性均较高，为有效的预防和控制柳杉瘿瘤病提供了新的技术手段。
【专利说明】一种鉴定柳杉瘿瘤病感染状况的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于植物病原菌检测【技术领域】，具体涉及一种鉴定柳杉瘿瘤病感染状况的方法。
【背景技术】
[0002]柳杉(Cryptomeriafortunei)为杉科(Taxodiaceae)柳杉属(Cryptomeria)常绿针叶乔木，是国家一级保护树种，主要分布于长江以南地区。拟隐孢壳属(Cryptosporiopsis)真菌会引起柳杉摧患瘿瘤病,病害主要发生在柳杉树干、枝条和嫩枝上，可导致落叶、枝条枯萎，甚至整株柳杉死亡。瘿瘤病原菌主要靠气流、雨水传播，由酸雨腐蚀产生的伤口侵入柳杉分枝或主干。
[0003]近年来，瘿瘤病在柳杉种群中不断蔓延扩散，成为引起全株衰退的一种非常严重的病害，严重降低了柳杉的观赏价值和林木材质，造成经济损失。目前国内对该病的鉴定研究工作相对比较缺乏，相关的报道更是少之又少，及早发现病原，掌握瘿瘤病的发病情况对于柳杉瘿瘤病的预防、监测、防治至关重要。
[0004]目前，一般检测病原菌存在与否方法主要有症状观察和PCR检测，前者不仅耗时耗力，且常常依赖于人的经验判断，若需准确识别病害并非易事，并且所需的离体植物组织样本量大；而聚合酶链式反应(PCR)，操作方便，在一定程度上简化了柳杉瘿瘤病菌的检测，但是需要核酸提取过程，时间较长，且常规PCR诊断常受假阳性和假阴性的影响，重复性和准确性较差。
[0005]傅里叶变换红外光谱技术(FT-1R)作为一种测定样品分子结构的工具已经被广泛地应用在化学、农业、生物科学、医药等众多领域，是分析物质结构的有效手段。核酸、蛋白质、脂质、碳水化合物等细胞大分子物质的结构和组成信息可以反映在红外光谱图上。虽然组成细菌细胞的生化物质基本相同，但是其中某些功能基团的差异可以成为区分和鉴定不同菌株的基础，以此作为一种鉴定检测微生物的快速无损的新型方法(代群威，董发勤.FTIR技术在几株细菌鉴定的应用[J].西南科技大学学报，2009，24(I):114_117)。文献(刘刚，刘建宏，等.食用菌的傅里叶变换红外光谱鉴定[J].光谱学与分析光谱.2004，24(8):941-945)利用FT-1R技术成功地鉴别了食用菌的不同种类，区分了同一种食用菌的不同部位以及不同产地；文献(慈云祥，臧凯赛，等.几种微生物的红外光谱研究[J].高等学校化学学报，2002，23 (6):1047-1049)采集酵母菌、谷氨酸菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的红外谱图，确定了这几种微生物红外谱图的分析灵敏区，并对此区域内的主要吸收峰进行了辨别和归属，找到了不同微生物之间的差异性。
[0006]由此可见，FT-1R技术可用于对微生物进行准确快速的检测鉴定，但目前尚未出现FT-1R应用于瘿瘤病原菌检测的相关报道。
【发明内容】
[0007]本发明提供了一种鉴定柳杉瘿瘤病感染状况的方法，该方法采用FT-1R技术采集柳杉枝条的红外光谱，通过分析谱图中的特征峰对柳杉是否感染瘿瘤病原菌进行准确、快速的检测。
[0008]—种鉴定柳杉瘿瘤病感染状况的方法，包括:
[0009](I)取适量待检柳杉枝条或针叶，经干燥、研磨成粉末后与溴化钾混合，制成压片;
[0010](2)采集所述压片的红外光谱图；
[0011](3)根据红外光谱图，判断待检柳杉是否感染瘿瘤病；
[0012]当利用柳杉枝条制作压片时，若红外光谱图在2847.81~2856.31cm—1波长范围内出现特征峰，则待检柳杉感染瘿瘤病；若红外光谱图在3383.15~3391.65cm^\l421.30~1429.80cm_\l263.33 ~1271.83cm_1 和 1028.93 ~1037.43cm—1 波长范围内均出现特征峰，则待检柳杉未感染瘿瘤病；
[0013]当利用柳杉针叶制作压片时，若红外光谱图在2847.95~2856.45cm—1波长范围出现特征峰，则待检柳杉未感染瘿瘤病。
[0014]病原菌侵染寄主植物后，寄主植物中核酸、蛋白的代谢发生变化，原本存在的物质被降解，同时合成积累一些新的次生代谢物、相关酶类等，同时，病原菌自身的物质组成也与寄主植物有差别。傅立叶变换红外光谱(FT-1R)分辨率高，不仅能提供分子基团特征的振动吸收谱带，而且能敏锐地探测分子基团及其周围环境的变化，被侵染的寄主植物中，原有物质的消失、新物质的生成以及差别物质的结构和组成信息都可以反映在红外光谱图上，形成可辨别的特征峰。
[0015] 申请人:将未染病柳杉与染病柳杉的红外光谱图进行比较后发现，未染病柳杉枝条的红外光谱图中具有 3383.15 ~3391.65cm_1U421.30 ~1429.80cm_\l263.33 ~1271.83CHT1和1028.93~1037.4`3cm—1波长范围内的特征峰，而感染瘿瘤病的柳杉枝条的红外光谱图中，在上述波长范围内均未出现或在部分波长范围内未出现特征峰，且在2847.81~2856.31cm_1波长范围出现特征峰。由此可以判断待检柳杉是否被瘿瘤病原菌侵染。而柳杉针叶的红外光谱图中，2847.95~2856.45cm^波长范围内的特征峰是未染病柳杉针叶所特有，若在该范围内检测到特征峰，则待检柳杉未被瘿瘤病原菌侵染；但若在该范围内未检测到特征峰，则无法断定待检柳杉是否被瘿瘤病原菌侵染，因为该特征峰的消失也可能是其他原因造成的，需作进一步检测。
[0016]具体地，本发明鉴定柳杉瘿瘤病感染状况的方法包括:
[0017](I)取适量待检柳杉枝条或针叶，经干燥、研磨成粉末后与溴化钾混合，制成压片;
[0018]将待检柳杉枝条或针叶冷冻干燥后研磨成粉末，再与事先烘干或冻干、研磨的溴化钾混合均匀，制成压片。为免对柳杉枝条或针叶中的物质造成破坏影响检测结果，采用冷冻干燥方式处理待检柳杉枝条或针叶。并且，由于红外光谱采集的区段是中红外区，即波数4000~400CHT1范围内，而溴化钾在中红外区没有吸收峰，用它制作压片不会对样品信号产生干扰。
[0019]柳杉枝条或针叶的粉末粒径会影响红外光谱的图像质量，作为优选，柳杉枝条或针叶粉末和溴化钾的粒径均小于2 μ m。若粒径过大，制备的压片透光性差，散射作用强，易造成红外光谱图基线的漂移，谱带发生畸变。[0020]溴化钾可以稀释柳杉的枝条或针叶，并易于压片的压制成型。优选地，柳杉枝条粉末或针叶粉末与溴化钾的重量比为I?3:100,更优选为1:100。两者的重量比维持在适宜的范围，有利于全面的采集特征峰信号，若柳杉枝条或针叶粉末过多，会导致红外光谱吸收饱和现象；若柳杉枝条或针叶粉末过少，则容易丢失红外光谱图中信号较弱的特征峰。
[0021]为得到高质量的红外光谱图，所述压片的厚度要均匀一致。一般地，所述压片的厚度为0.5?Imm,优选为1mm。
[0022](2)采集所述压片的红外光谱图；
[0023]采集红外光谱图时，扫描次数优选为32?128次，更优选为32次。适宜的扫描次数可以增强待检测样品在中红外区的信息，减弱背景噪声，提高光谱信噪比。
[0024]采集红外光谱图时，扫描分辨率优选为0.125?32CHT1，更优选为4CHT1。分辨率过高，则扫描速度慢，影响检测速度；分辨率过低，又会导致样品信息丢失，影响检测的准确性。
[0025]红外光谱图的采集过程中，通常需向傅里叶变换红外光谱分析仪的样品区连续通入干燥空气，用以驱除水蒸气，避免水分对红外光谱分析的影响。
[0026](3)根据红外光谱图，判断待检柳杉是否感染瘿瘤病；
[0027]当利用柳杉枝条制作压片时，若红外光谱图在2847.81?2856.31cm—1波长范围内出现特征峰，优选为在2851.81?2852.31CHT1波长范围内出现特征峰，更优选为出现2852.06cm-1特征峰，则待检柳杉感染瘿瘤病；
[0028]若红外光谱图在3383.15 ?3391.65cm_\l421.30 ?1429.80cm_\l263.33 ?1271.83CHT1和1028.93?1037.43cm_1波长范围内均出现特征峰，优选为在3387.15?3387.65cm_\l425.30 ?1425.80cm_\l267.33 ?1267.83cm_1 和 1032.93 ?1033.43cm_1波长范围内均出现特征峰，更优选为出现3387.40CHT1、1425.55cm_\l267.58cm_1和
1033.18cm-1特征峰，则待检柳杉未感染瘿瘤病；
[0029]当利用柳杉针叶制作压片时，若红外光谱图在2847.95?2856.45cm—1波长范围出现特征峰，优选为在2851.95?2852.45cm_1波长范围内出现特征峰，更优选为出现2852.20cm1特征峰，则待检柳杉未感染瘿瘤病。
[0030]与现有技术相比，本发明的有益效果体现在:
[0031]本发明利用傅里叶变换红外光谱技术发现了健康柳杉与患瘿瘤病柳杉的红外光谱图之间特征峰的差异，利用该差异来检测柳杉是否被瘿瘤病原菌侵染，检测过程无损、快速、准确，操作方便，不依赖于人的经验，且安全性和重复性均较高，为有效的预防和控制柳杉瘿瘤病提供了新的技术手段。
【专利附图】
【附图说明】
[0032]图1为感染瘿瘤病柳杉针叶与未感染瘿瘤病柳杉针叶的红外光谱图比较；
[0033]图2为感染瘿瘤病柳杉枝条与未感染瘿瘤病柳杉枝条的红外光谱图比较。
【具体实施方式】
[0034]实施例1感染瘿瘤病柳杉与未感染瘿瘤病柳杉特征峰的获取
[0035]I红外分析用压片的制备[0036]I)样品采集:于浙江省天目山分别采集感染瘿瘤病柳杉的枝条和针叶，以及未感染瘿瘤病柳杉的枝条和针叶；
[0037]2)冻干研磨:将采集的柳杉样品置于-70°C冰冻干燥后，在研钵中分别研磨成粒径小于2 μ m的样品粉末；
[0038]3)溴化钾准备:将溴化钾(KBr)粉体置于台式烘箱内，在120°C下烘烤24h进行干燥处理，将溴化钾粉体在干净的玛瑙研钵中研细后过200目分样筛，红外灯下干燥4h，放入干燥皿中保存备用；
[0039]4)制备压片:取IOOmg干燥的溴化钾与Img样品粉末混匀，在压片机中以以100kg/cm2 (1200psi)的压力压制约8分钟，制成厚度为0.5?Imm的薄盘状压片。
[0040]2红外光谱的采集和数据分析
[0041]用傅里叶变换红外光谱分析仪对制备的压片进行扫描，获取红外光谱，并对感染瘿瘤菌的柳杉样品与未感染瘿瘤病的柳杉样品的红外光谱进行比较分析。扫描过程中，向傅里叶红外光谱分析仪内的样品区连续通入干燥空气，以驱赶水蒸气。
[0042]红外光谱的扫描条件如下:
[0043]温度:室温(25°C);
[0044]扫描范围:4000?500CHT1 ；
[0045]分辨率:4cm1 ；
[0046]扫描次数:32次。
[0047]红外光谱数据的分析由Grams32@ 软件(Galactic Industries, Salem, NH, USA)分析后获得，分析光谱范围即4000?500cm-l区段。
[0048]吸收峰的位置由样品重量的中心点确定，光谱分析得到的平均值是基于平行性试验、基线校准、数据正常化，在此基础上通过同一软件可测得吸收峰的光谱范围。光谱分析的均值以及正常化的调整虽然只能从视觉表征上给出差异，但是光谱的各项参数、均值的计算、统计分析、基线校准等因素均会被考虑在内。
[0049]感染瘿瘤菌与未感染瘿瘤菌柳杉针叶样品的扫描结果见图1，主要吸收峰的分析比较结果见表I。
[0050]表I感染瘿瘤菌与未感染瘿瘤菌柳杉针叶样品的主要吸收峰比较
[0051]
【权利要求】
1.一种鉴定柳杉瘿瘤病感染状况的方法，包括: (1)取适量待检柳杉的枝条或针叶，经干燥、研磨成粉末后与溴化钾混合，制成压片； (2)采集所述压片的红外光谱图； (3)根据红外光谱图，判断待检柳杉是否感染瘿瘤病； 当利用柳杉枝条制作压片时，若红外光谱图在2847.81~2856.31^1波长范围内出现特征峰，则待检柳杉感染瘿瘤病；若红外光谱图在3383.15~3391.65cm^U421.30~1429.80cm_\l263.33 ~1271.83cm_1 和 1028.93 ~1037.43cm—1 波长范围内均出现特征峰，则待检柳杉未感染瘿瘤病； 当利用柳杉针叶制作压片时，若红外光谱图在2847.95~2856.45CHT1波长范围出现特征峰，则待检柳杉未感染瘿瘤病。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，当利用柳杉枝条制作压片时，若红外光谱图在2851.81~2852.3Icm^1波长范围内出现特征峰，则待检柳杉感染瘿瘤病。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，当利用柳杉枝条制作压片时，若红外光谱图出现2852.06CHT1特征峰，则待检柳杉未感染瘿瘤病。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，当利用柳杉枝条制作压片时，若红外光谱图在 3387.15 ~2275.65cm_1U425.30 ~1425.80cm_\l267.33 ~1267.83cm_1 和1032.93~1033.43cm—1波长范围内均出现特征峰，则待检柳杉未感染瘿瘤病。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，当利用柳杉枝条制作压片时，若红外光谱图出现3387.40cm_1U425.55cm_\l267.58cm_1和1033.1ScnT1特征峰，则该待检柳杉未感染瘿瘤病。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，当利用柳杉针叶制作压片时，若红外光谱图在2851.95~2852.45cm^波长范围内出现特征峰，则待检柳杉未感染瘿瘤病。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，当利用柳杉针叶制作压片时，若红外光谱图出现2852.20CHT1特征峰，则待检柳杉未感染瘿瘤病。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，柳杉枝条或针叶粉末和溴化钾的粒径均小于2 μ m。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，柳杉枝条或针叶粉末与溴化钾的重量比为I~3:100。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述压片的厚度为0.5~1mm。
【文档编号】G01N21/3563GK103630511SQ201310517883
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2013年10月28日 优先权日:2013年10月28日
【发明者】李斌, 王丽, 葛梦禹, 单长林, 陈晓玲, 谢关林 申请人:浙江大学