一种酶联免疫显色底物液的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种酶联免疫底物液，所述的底物液包括显色液A和显色液B，本发明提供的底物液能在2～8℃条件下稳定放置2年，显色效果可以持续1小时，而且显色的强度明显增强，同时没有增加本底，提高了检测的灵敏度，达到了稳定高效的目的，满足酶联免疫试剂盒对显色底物液的各项要求。
【专利说明】一种酶联免疫显色底物液
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种稳定高效的酶联免疫底物显色液，属于临床体外检测【技术领域】。【背景技术】
[0002]1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测丨定(enzyme linkedimmunosorbent assay, elisA)用于IrG定量测定的文章，使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。这一方法的基本原理是:①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗体与辣根过氧化物酶(HRP)连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本(测定其中的抗体或抗原)和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入辣根过氧化物酶(HRP)反应的底物液后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关。由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。该检测体系中，底物显色液作为最终决定了最后检测的显色程度，理想的显色底物液应该具有稳定性高、保存时间长、显色背景低、酶促显色强度高的特点。
[0003]HRP催化过氧化物的氧化反应，最具代表性的过氧化物为H2O2，其反应式如下:DH2+ H2O2——? D+ H2O,上式中，DH2为供氧体，H2O2为受氢体。在ELISA中，DH2 —般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物，以便作比色测定。常用的供氢体有邻苯二胺(0-phenylenediamine, 0PD)、四甲基联苯胺(3, 3’, 5, 5’ -tetramethylbenzidine, TMB)和ABTS [2, 2' -azino-d1-(3-ethylbenziazobine sulfonate-6)]。
[0004]OPD氧化后的产物呈橙红色,用酸终止酶反应后,在492nm处有最高吸收峰,灵敏度高，比色方便，是HRP结合物最常用的底物。OPD本身难溶于水，OPD.2HCL为水溶性。曾有报道OPD有致异变性，操作时应予注意。OPD见光易变质，与过氧化氢混合成底物应用液后更不稳定，须现配置现用。在试剂盒中，OPD和H2O2 —般分成二组分，OPD可制成一定量的粉剂或片剂形式，片剂中含有发泡助溶剂，使用更为方便。过氧化氢则配入底物缓冲液中，有制成易保存的浓缩液，使用时用蒸馏水稀释。先进的ELISA试剂盒中则直接配成含保护剂的工作浓度为0.02% H2O2的应用液，只需加入OPD后即可作为底物应用液。
[0005]TMB经HRP作用后共产物显蓝色，目视对比鲜明。TMB性质较稳定，可配成溶液试剂，只需与H2O2溶液混和即成应用液，可直接作底物使用。另外，TMB又有无致癌性等优点，因此在ELISA中应用日趋广泛。酶反应用HCL或H2SO4终止后，TMB产物由蓝色呈黄色，可在比色计中定量，最适吸收波长为405nm。
[0006]ABTS虽不如OPD和TMB敏感，但空白值极低，也为一些试剂盒所采用。
[0007]各种供氢体的性质各不相同，市场上常见的供氢体选用的为TMB。但是TMB比较难溶于水中，而且在溶液状态中性质不稳定，比较难以存放，这就造成了市场上常规TMB显色液稳定性差，显色不够持久，经过长时间放置后显色强度降低等问题。
【发明内容】
[0008]针对于以上常规TMB显色底物液存在的问题，本发明提供一种稳定高效的TMB显色液配方和配制方法，保证显色底物液能在2?8°C条件下稳定放置2年，显色效果可以持续I小时，满足市场试剂盒。
[0009]本发明的TMB显色底物液是由两个试剂组分组成的，具体组分和浓度如下: 显色液A:
朽1檬酸钠5-20g/L
柠檬酸2-10 g/L
过氧化脲0.5-lg/L
焦磷酸钠0.5-5g/L
双氧水0.5-lmL/L
聚氧乙烯月桂醇醚0.2-lmL/L
N-Methylisothiazolone-HCl (MIT) 1-lOg/L 各组分分别溶于IL蒸懼水中制备完成；
显色液B:
TMB0.3-5 g/L
柠檬酸2-10 g/L
乙二胺四乙酸二钠0.2-2 g/L
甘油1-10 mL/L
二甲基亚砜5-10 mL/L
先将TMB溶解到二甲基亚砜后，再加入IL蒸馏水中，其他组分依次加入溶解。
[0010]本发明提供的TMB显色底物液加入有机溶剂对TMB进行溶解，增强了试剂组分的均一性，配制的显色液稳定，另外在显色液A中加入了过氧化脲、焦磷酸钠，有效的保护了双氧水的稳定性。该配制方法和组分，保证了显色底物液能在2?8 °C条件下稳定放置2年，显色效果可以持续I小时，而且显色的强度明显增强，同时没有增加本底，提高了检测的灵敏度，达到了稳定高效的目的，满足酶联免疫试剂盒对显色底物液的各项要求。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1为本发明的底物液与常规底物液的不同检测时间对检测结果的对比图。【具体实施方式】
[0012]下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
[0013]实施例1:TMB显色底物液制备 显色液A:
柠檬酸钠20g/L
柠檬酸10 g/L
过氧化脲I g/L焦磷酸钠5g/L
双氧水lmL/L
聚氧乙烯月桂醇醚OlmL/L
N-Methylisothiazolone-HCl (MIT) 10g/L 各组分分别溶于IL蒸懼水中制备完成；
显色液B:
TMB5 g/L
柠檬酸10 g/L
乙二胺四乙酸二钠2 g/L
甘油10 mL/L
二甲基亚砜10 mL/L
先将TMB溶解到二甲基亚砜后，再加入IL蒸馏水中，其他组分依次加入溶解。
[0014]利用丙型肝炎核心抗原检测试剂盒(双抗夹心ELISA)对显色底物液进行检测验证。具体操作步骤为:(I)设定好加样孔，将50 μ L系列HCV定标品加在HCV试剂盒的包被板上，再加50 μ L抗HCV单抗-HRP酶结合物，37°C反应I小时后，洗板5次，拍干；(2)每孔加入显色液A液和B液各50uL，避光37°C显色15min。(3)每孔加入终止液各50uL，用酶标仪在波长450nm/630nm处读取吸光度(OD)值。
[0015]对比市场上常见的显色底物液进行检测，获得不同浓度标准品所得的OD值(λ =450nm/630nm)如下表 I 所不:
表1标准品检测结果
【权利要求】
1.一种酶联免疫显色底物液，其特征在于，包括显色液A和显色液B ; 所述显色液A的组分及含量如下: 朽1檬酸钠5-20g/L 柠檬酸2-10 g/L 过氧化脲0.5-lg/L 焦磷酸钠0.5-5g/L 双氧水0.5-lmL/L 聚氧乙烯月桂醇醚0.2-lmL/L N-Methylisothiazolone-HCl l-10g/L 显色液A的制备方法:各组分分别溶于IL蒸馏水中制备完成； 所述显色液B的组分及含量如下: TMB0.3-5 g/L 柠檬酸2-10 g/L 乙二胺四乙酸二钠0.2-2 g/L 甘油1-10 mL/L 二甲基亚砜5-10 mL/L 显色液B的制备方法:先将TMB溶解到二甲基亚砜后，再加入IL蒸馏水中，其他组分依次加入溶解。
【文档编号】G01N33/52GK103645181SQ201310676535
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年12月13日 优先权日:2013年12月13日
【发明者】谭柏清, 王进, 甘宜梧 申请人:山东博科生物产业有限公司