葡萄糖传感器的制造方法
【专利摘要】本发明提供了一种对样品中葡萄糖的量进行定量的方法，该样品可以还包括干扰物，诸如甘露糖醇。使用对样品中的干扰物的量的灵敏度不同的测量方法来获得至少两个测量结果，从而能够进行比较这些结果以确定样品中是否存在任何干扰物。还提供了进行本文描述的方法的葡萄糖传感器。
【专利说明】葡萄糖传感器
【技术领域】
[0001 ] 本文件涉及检测样品中葡萄糖的葡萄糖传感器，该样品可含有干扰物质，例如甘 露糖醇。还提供了对这种样品中葡萄糖的量进行定量的方法。
【背景技术】
[0002] 已知硼酸与1，2-二醇和1，3-二醇形成可逆加成物。这种现象已通过将硼酸受体 附接至发色团或荧光团来用于设计连续测量葡萄糖的传感器的尝试中。二硼酸荧光团化学 成分也已被设计，该化学成分与1，2-二醇产生1:1的加合物。而且，如果二硼酸经由短的 连接基团连接至荧光团，那么该化学成分通过光诱导电子转移（"PET"）机制起作用。
[0003] 在传感器的发展中已经出现了利用这些化学成分来测量生理葡萄糖的巨大驱动 力。重点是提高计算葡萄糖浓度的准确性和可靠性。
【发明内容】
[0004] 血液中有时可能存在显著量的干扰物质。例如，临床环境（clinical setting)中 可能存在甘露糖醇。干扰物质，包括甘露糖醇，能够与葡萄糖竞争结合到葡萄糖传感器中的 硼酸受体。
[0005] 干扰物质，诸如甘露糖醇，可以在葡萄糖传感方法期间导致错误。一些潜在的干扰 物，诸如糖类（例如甘露糖醇），具有与葡萄糖相似的分子量和化学结构。因此，尽管保护性 阻挡层可被用于阻挡一些潜在干扰物，但是某些潜在干扰物，包括甘露糖醇，可以透过葡萄 糖可渗透的阻挡层。在监测患者的血糖水平期间（例如，由于血液中干扰物诸如甘露糖醇 的存在）出现显著错误的情况下，可能出现医疗的潜在危险的错误诊断和/或模式。
[0006] 本文提供的葡萄糖传感器和方法解决了葡萄糖传感器指示化学期间出现的误差 的问题，特别是当这些误差的出现是由样品中干扰物的存在引起时。
[0007] 本文提供的方法可以包括使用第一测量方法和第二测量方法来获得葡萄糖的量 的两个测量结果，这些方法在对样品中干扰物的量的灵敏度的方面不同。两个测量结果之 间的比较可被用于确定样品中是否存在任何干扰物，如果存在任何干扰物，将要采用合适 步骤例如准确估算待获得的样品中的葡萄糖浓度来解决这个问题。
[0008] 因此，一种对样品中葡萄糖的量进行定量的方法，该样品可以还包括干扰物，该方 法可以包括：
[0009] 将葡萄糖传感器插入到样品中，葡萄糖传感器包括：
[0010] 传感区域，传感区域至少包括第一指示剂体系，第一指示剂体系包括
[0011] 结合到葡萄糖的第一受体和与第一受体缔合的第一荧光团；以及
[0012] 光波导，光波导用于将光引导到所述传感区域上；
[0013] 将入射光提供到传感器的传感区域，并且通过第一测量方法来获得葡萄糖的量的 第一测量结果，第一测量方法包括检测所述第一荧光团的发光；
[0014] 通过第二测量方法来获得葡萄糖的量的第二测量结果，其中，第二测量方法在对 样品中所述干扰物的量的灵敏度的方面上不同于第一测量方法；以及
[0015] 比较所述第一测量结果和所述第二测量结果，并由此确定样品中是否存在任何所 述干扰物；
[0016] 其中，所述干扰物是能够干扰葡萄糖与所述第一受体结合的物质。
[0017] 在一些情况下，本文提供的方法包括：
[0018] 将葡萄糖传感器插入到样品中，葡萄糖传感器包括：
[0019] 传感区域，传感区域包括：
[0020] 第一指示剂体系，第一指示剂体系包括结合到葡萄糖的第一受体和与第一受体缔 合的第一荧光团，其中，所述第一受体与葡萄糖具有缔合常数Kei，并且与所述干扰物具有缔 合常数Km，以及
[0021] 第二指示剂体系，第二指示剂体系包括结合到葡萄糖的第二受体和与第二受体缔 合的第二荧光团，其中，所述第二受体与葡萄糖具有缔合常数K e2，并且与所述干扰物具有缔 合常数Km2，并且其中，Ke2/K M2不同于K ei/KM1;以及
[0022] 光波导，光波导用于将光引导到所述传感区域上；
[0023] 将入射光提供到传感器的传感区域；
[0024] 通过第一测量方法来获得葡萄糖的量的第一测量结果，第一测量方法包括检测所 述第一荧光团的发光；
[0025] 通过第二测量方法来获得葡萄糖的量的第二测量结果，第二测量方法包括检测所 述第二荧光团的发光；
[0026] 比较所述第一测量结果和所述第二测量结果，由此确定样品中是否存在任何所述 干扰物，并且校正样品中任何所述干扰物的存在。
[0027] 这种优选的方法是特别有利的，因为单个实验方案可以同时使用以获得第一测量 结果和第二测量结果，即，涉及将入射光提供到传感器的传感区域（在单个步骤中）并检测 (在单个发光光谱/单次发射测量中）第一荧光团和第二荧光团的发光的发射荧光技术。 如本文进一步描述的，两个荧光团的荧光之间的比较可以允许校正（消除）该体系的荧光 的任何干扰物贡献。
[0028] 因此，在这种优选的方法中，不需要例如通过采取血样并且使其经受实验室分析 (例如，通过电化学方法）对样品的干扰物含量进行单独的实验验证。因此，该文件的优选 方法是特别方便、快速且易于操作（例如，在没有经过特殊训练的医务人员的存在下）。
[0029] 本文件还提供了相关的葡萄糖传感器，特别是对样品的葡萄糖的量进行定量的葡 萄糖传感器，该样品还可以包括干扰物，该传感器包括：
[0030] 传感区域，该传感区域包括：
[0031] 第一指示剂体系，该第一指示剂体系包括结合到葡萄糖的第一受体和与第一受体 缔合的第一荧光团，其中，所述第一受体与葡萄糖具有缔合常数K ei，并且与所述干扰物具有 缔合常数Km，以及
[0032] 第二指示剂体系，第二指示剂体系包括结合到葡萄糖的第二受体和与第二受体缔 合的第二荧光团，其中，所述第二受体与葡萄糖具有缔合常数K e2，并且与所述干扰物具有缔 合常数Km2，并且其中，Ke2/K M2不同于K ei/KM1;以及
[0033] 光波导，光波导用于将光引导到所述传感区域上。
[0034] 这种葡萄糖传感器可以用于执行本文件的优选方法。
[0035] 进一步优选的特征和实施方式被描述在所附的说明书和所附的权利要求中。
【专利附图】
【附图说明】
[0036] 图1和图Ia描述了并入光纤的传感器和这种传感器的显示器。
[0037] 图2、图3和图3a描述了传感器的传感区域的各种实施方式。
[0038] 图4描述了示意性示出本文提供的方法的流程图。
[0039] 图5描述了示意性示出本文提供的方法的一个实施方式的流程图。
[0040] 图6描述了示意性示出本文提供的方法的另一个实施方式的流程图。
[0041] 图7描述了实施例2的结果，如下：A)在350nm和405nm的激发波长下且在214mM 的[D-葡萄糖]Sg下，PBS中水凝胶4对D-葡萄糖的结合研宄中记录的荧光发光光谱（请 注意，下部线至上部线按照低浓度到高浓度的顺序）；B)在350nm和405nm的激发波长下且 在184mM的[甘露糖醇]_下，PBS中水凝胶4对D-甘露糖醇的结合研宄中记录的荧光发 光光谱（请注意，下部线至上部线按照低浓度到高浓度的顺序）；C) λ ex = 350nm、λ em = 380nm和λ ex = 405nm、λ em = 487nm，水凝胶4对D-葡萄糖的相对焚光强度与碳水化合 物浓度曲线；以及 D) λ ex = 350nm、λ em = 380nm 和 λ ex = 405nm、λ em = 487nm，水凝胶 4对D-甘露糖醇的相对荧光强度与碳水化合物浓度曲线。
【具体实施方式】
[0042] 本文描述的方法可以包括葡萄糖传感器的使用，包括：
[0043] 传感区域，传感区域至少包括第一指示剂体系，第一指示剂体系包括
[0044] 结合到葡萄糖的第一受体和与第一受体缔合的第一荧光团；以及
[0045] 光波导，光波导用于将光引导到所述传感区域上。
[0046] 虽然本文描述的方法可以使用光纤葡萄糖传感器（即，光波导是光纤的葡萄糖传 感器），但是也可以用具有不同类型的光波导的传感器来进行目前描述的方法。
[0047] 本文描述的葡萄糖传感方法可以在水溶液中进行。在一些情况下，本文描述的葡 萄糖传感方法可以在体液诸如间质组织或血液中进行。例如，本文描述的葡萄糖传感器可 以被用作侵入性传感器并且插入到血管中。本文提供的葡萄糖传感方法可以使用体外使用 的非侵入性传感器、可植入性传感器，和/或皮下传感器。
[0048] 图1和图Ia中描述了并入光纤的传感器的实例。传感器1包括光纤2,光纤2在 其远端包括传感区域3。在一些情况下，传感器1可以是侵入性传感器。传感器1包括纤维 2。纤维2可以适于插入到患者体内，例如通过套管插入到血管内。传感区域3 (更详细地 描述在图2、图3和图3a中）含有单元或室7,在单元或室7中含有或均含有指示剂体系。 光纤通过电缆4延伸到连接器5,连接器5适于与合适的显示器8配合。显示器可以包括另 外的光缆4a，在5a或者在其它分叉处光缆4a与连接器配合以连接到：（a)用于光传感器的 合适入射光源9,和（b)用于返回信号的检测器10。
[0049] 在一些实施方式中，上述传感器是一次性传感器（disposable sensor)。一次性传 感器可以适于连接到非一次性显示器，非一次性显示器包括光源9和检测器10。
[0050] 如图2所描述的，传感区域3将以室的形式的单元7并入在纤维内。该单元可以 采取任何形式，只要一个或多个指示剂体系被包含在由波导（例如，纤维）所引导的入射光 的路径中。因此，上述单元可以被附接到纤维或波导的远端，或者可以为具有任何所需形状 的处于纤维内的室的形式。
[0051] 可选地，如本文进一步描述的，反应性氧物质（"ROS"）猝灭剂可以存在于传感 器中，例如在传感区域内或者可选的阻挡层（如文中进一步描述的）内。反应性氧物质的 实例是过氧化氢（H 2O2)。合适的ROS-猝灭剂被描述在美国专利申请61/524525和PCT/ GB2012/051921中，其内容通过引用而被并入本文。用于将ROS-猝灭剂并入葡萄糖传感器 的合适的装置也被描述在美国专利申请61/524525和PCT/GB2012/051921中，并且再次通 过引用而被并入本文。
[0052] 葡萄糖传感器的传感区域3具有使得葡萄糖进入单元中的一个或多个开口 6a、开 口 6b。葡萄糖可渗透的阻挡层"BL"可以被可选地设置为横跨这些开口，以便葡萄糖通过阻 挡层进入该单元。本文提供的葡萄糖传感器中使用的葡萄糖可渗透的阻挡层可以能够至少 部分地限制高分子量材料诸如蛋白质通过。
[0053] 在图2、图3和图3a中，可选的阻挡层BL被设置在整个传感区域3上。或者，然 而，可选的阻挡层BL可以仅被设置在传感区域的一部分上，例如仅横跨开口 6a和开口 6b 上。
[0054] 简要地说，图2示出了可选的阻挡层BL被直接涂覆到传感区域3上的实施方式， 在此处，可选的阻挡层BL经由接合点（例如，热成型的附接点）Ja和Jb被直接涂覆到光纤 的尖端上。在图3中，传感区域3被设置在单独的支承件11内，并且阻挡层BL(再次经由 接合点Ja和Jb)被设置在支承件11上。在图3a中，阻挡层本身形成支承结构"BL/11"。 对当并入阻挡层时的合适传感器构造和对这种阻挡层的合适材料的进一步细节被描述在 美国专利申请61/524525、PCT/GB2012/051921和TO2011/101626中，其内容通过引用而被 并入本文。
[0055] 具有附图中示出的设计特征之外或与其不同的设计特征的葡萄糖传感器当然 是可能的，前提条件是这些葡萄糖传感器包括所需的：（i)传感区域，传感区域至少包括 第一指示剂体系，第一指示剂体系包括结合到葡萄糖的第一受体和与第一受体缔合的 第一荧光团；以及（ii)光波导，光波导用于将光引导到传感区域。例如，可以使用诸如 W02008/141241、W02008/098087和W02011/113020中描述并示出的葡萄糖传感器。
[0056] "指示剂体系"是指结合到葡萄糖的受体和与其缔合的荧光团的组合，以使得当葡 萄糖结合到受体时荧光团的发光模式（例如，波长、强度、寿命）改变（从而使得荧光团的 发光行为充当葡萄糖的存在的"指示剂"）。
[0057] 第一受体和第一荧光团可以直接彼此结合，作为第一受体-第一荧光团构造。合 适的第一荧光团的实例包括蒽、芘及它们衍生物。合适的第一受体的实例是硼酸受体，诸如 具有至少一个（例如一个或两个）或者至少两个（例如两个或三个）硼酸基团的化合物。
[0058] 合适的受体还包括含砷受体、含碲受体和含锗受体，例如包括式H3As03、H 2AsO3' H6Te〇6、H5Te(V、Ge (OH)6或GeO(OH) ^或者它们的衍生物中的一种或多种基团的受体。这种 受体的实例包括US2005/0158245中公开的受体，其内容通过整体引用而被并入本文。又 一个合适的受体包括合成的凝集素，合成的凝集素能够例如经由非共价相互作用（诸如氢 键、CH-π相互作用和/或疏水相互作用）而结合到葡萄糖。这种合成的凝集素的实例被 描述在《自然化学》2012年4(9)期718-23页（Nat Chem. 2012 4(9)718-23)中，其内容通 过整体引用而被并入本文。
[0059] 在优选的实施方式中，第一受体是通式（I)的基团
[0060]
【权利要求】
1. 一种对样品中葡萄糖的量进行定量的葡萄糖传感器，所述样品可以还包括干扰物， 所述传感器包括： 传感区域，所述传感区域包括： 第一指示剂体系，所述第一指示剂体系包括结合到葡萄糖的第一受体和与所述第一受 体缔合的第一荧光团，其中，所述第一受体与葡萄糖具有缔合常数，并且与所述干扰物具 有缔合常数KM1，以及 第二指示剂体系，所述第二指示剂体系包括结合到葡萄糖的第二受体和与所述第二受 体缔合的第二荧光团，其中，所述第二受体与葡萄糖具有缔合常数Ku，并且与所述干扰物具 有缔合常数KM2，并且其中，Ke2/KM2不同于Kei/K M1;以及 光波导，所述光波导用于将光引导到所述传感区域上。
2. 根据权利要求1所述的葡萄糖传感器，其中，所述第一荧光团和所述第二荧光团具 有相差至少5nm的峰值发射波长。
3. 根据权利要求1或2所述的葡萄糖传感器，其中，[KJKJ/D^/KJ大于2或小于 0. 5〇
4. 根据前述权利要求中任意一项所述的葡萄糖传感器，其中，所述第一受体和所述第 二受体是硼酸受体。
5. 根据权利要求4所述的葡萄糖传感器，其中，所述第一受体含有两个硼酸基团，并且 所述第二受体含有一个硼酸基团。
6. 根据前述权利要求中任意一项所述的葡萄糖传感器，其中，所述干扰物选自：(a)包 括顺式二醇基团的干扰物；(b)胺。
7. 根据权利要求6所述的葡萄糖传感器，其中，所述包括顺式二醇基团的干扰物选自 糖醇和糖类。
8. 根据前述权利要求中任意一项所述的葡萄糖传感器，其中，所述干扰物选自由甘露 糖醇、山梨糖醇、半乳糖醇、肌醇、果糖、半乳糖、阿拉伯糖、谷氨酰胺和儿茶酚胺组成的组。
9. 根据权利要求8所述的葡萄糖传感器，其中，所述干扰物是甘露糖醇。
10. -种对样品中葡萄糖的量进行定量的方法，所述样品可以还包括干扰物，所述方法 包括： 将葡萄糖传感器插入到所述样品中，所述葡萄糖传感器包括： 传感区域，所述传感区域至少包括第一指示剂体系，所述第一指示剂体系包括结合到 葡萄糖的第一受体和与所述第一受体缔合的第一荧光团；以及 光波导，所述光波导用于将光引导到所述传感区域上； 将入射光提供到所述传感器的所述传感区域上，并且通过第一测量方法来获得葡萄糖 的量的第一测量结果，所述第一测量方法包括检测所述第一荧光团的发光； 通过第二测量方法来获得葡萄糖的量的第二测量结果，其中，所述第二测量方法在对 所述样品中所述干扰物的量的灵敏度的方面上不同于所述第一测量方法；以及 比较所述第一测量结果和所述第二测量结果，并由此确定所述样品中是否存在任何所 述干扰物； 其中，所述干扰物是能够干扰葡萄糖与所述第一受体结合的物质。
11. 根据权利要求10所述的方法，包括： 将葡萄糖传感器插入到所述样品中，所述葡萄糖传感器包括： 传感区域，所述传感区域包括： 第一指示剂体系，所述第一指示剂体系包括结合到葡萄糖的第一受体和与所述第一受 体缔合的第一荧光团，其中，所述第一受体与葡萄糖具有缔合常数，并且与所述干扰物具 有缔合常数KM1，以及 第二指示剂体系，所述第二指示剂体系包括结合到葡萄糖的第二受体和与所述第二受 体缔合的第二荧光团，其中，所述第二受体与葡萄糖具有缔合常数Ku，并且与所述干扰物具 有缔合常数KM2，并且其中，Ke2/KM2不同于Kei/K M1;以及 光波导，所述光波导用于将光引导到所述传感区域上； 将入射光提供到所述传感器的所述传感区域； 通过第一测量方法来获得葡萄糖的量的第一测量结果，所述第一测量方法包括检测所 述第一荧光团的发光； 通过第二测量方法来获得葡萄糖的量的第二测量结果，所述第二测量方法包括检测所 述第二荧光团的发光； 比较所述第一测量结果和所述第二测量结果，由此确定所述样品中是否存在任何所述 干扰物，并且校正所述样品中任何所述干扰物的存在。
12. 根据权利要求11所述的方法，其中，所述第一测量结果和所述第二测量结果在单 个发射检测步骤中获得。
13. 根据权利要求11或12所述的方法，其中，所述第一荧光团和所述第二荧光团具有 相差至少5nm的峰值发射波长。
14. 根据权利要求11至13中任意一项所述的方法，其中，[Ke2/KM2]/[Kei/K M1]大于2或 小于0. 5。
15. 根据权利要求11至14中任意一项所述的方法，其中，所述第一受体和所述第二受 体是硼酸受体。
16. 根据权利要求15所述的方法，其中，所述第一受体含有两个硼酸基团，并且所述第 二受体含有一个硼酸基团。
17. 根据权利要求10至16中任意一项所述的方法，其中，可以还包括干扰物的所述样 品是体内样品。
18. 根据权利要求10所述的方法，其中，可以还包括干扰物的所述样品是体内样品，并 且其中，所述方法包括： (i) 在时间点获得所述第一测量结果； (ii) 在所述时间点通过所述第二测量方法来获得所述第二测量结果，其中，所述 第二测量方法包括电化学测量所述样品中葡萄糖的量或所述干扰物的量；以及 (iii) 比较所述第一测量结果和所述第二测量结果，由此确定所述第一测量结果是否 含有来自所述样品中所述干扰物的贡献。
19. 根据权利要求18所述的方法，其中，所述方法对人类主体或动物主体进行，并且所 述样品是所述主体的体内体液，并且其中，步骤（i)包括在时间％^对所述体液进行体内测 量，并且其中，步骤（ii)包括在时间^^从所述主体提取出所述体液的一部分并且对所述 体液的一部分进行体外电化学测量。
20. 根据权利要求18或19所述的方法，其中，所述方法包括进行步骤（i)至（iii)的 顺序一次或多次，每次在不同的时间点，直到在比较所述第一测量结果和所述第二测量结 果的步骤（iii)中确定了所述第一测量结果基本上不含有来自所述干扰物的贡献或者含 有减少的来自所述干扰物的贡献。
21. 根据权利要求18或19所述的方法，其中，在比较所述第一测量结果和所述第二测 量结果的所述步骤（iii)中，获得在^_时所述样品中所述干扰物的量的估算结果，并且其 中，所述方法还包括： (iv) 在对所述样品中存在的任何所述干扰物允许足以基本上清除所述样品的时 间延迟；以及 (v) 将入射光提供到所述传感器的所述传感区域，并且检测所述第一荧光团的发光，从 而获得所述样品中葡萄糖的量的第三测量结果，所述第三测量结果基本上不具有来自所述 干扰物的贡献或者具有减少的来自所述干扰物的贡献。
22. 根据权利要求中10至21中任意一项所述的方法，其中，所述干扰物选自：(a)包括 顺式二醇基团的干扰物；(b)胺。
23. 根据权利要求22所述的方法，其中，所述包括顺式二醇基团的干扰物选自糖醇和 糖类。
24. 根据权利要求中10至23中任意一项所述的方法，其中，所述干扰物选自由甘露糖 醇、山梨糖醇、半乳糖醇、肌醇、果糖、半乳糖、阿拉伯糖、谷氨酰胺和儿茶酚胺组成的组。
25. 根据权利要求24所述的方法，其中，所述干扰物是甘露糖醇。
26. -种对样品中葡萄糖的量进行定量的葡萄糖传感器，所述样品可以还包括干扰物， 所述传感器包括： 传感区域，所述传感区域包括： 第一指示剂体系，所述第一指示剂体系包括结合到葡萄糖的包括两个硼酸基团的第一 受体和与所述第一受体缔合的第一荧光团，以及 第二指示剂体系，所述第二指示剂体系包括结合到葡萄糖的包括一个硼酸基团的第二 受体和与所述第二受体缔合的第二荧光团；以及 光波导，所述光波导用于将光引导到所述传感区域上。
27. 根据权利要求26所述的葡萄糖传感器，其中，所述糖类包括顺式二醇基团。
28. 根据权利要求26所述的葡萄糖传感器，其中，所述糖类选自由甘露糖醇、山梨糖 醇、半乳糖醇、肌醇、果糖、半乳糖和阿拉伯糖组成的组。
29. 根据权利要求26所述的葡萄糖传感器，其中，所述糖类是甘露糖醇。
30. 根据权利要求26所述的葡萄糖传感器，其中，所述第一受体与葡萄糖具有缔合常 数，并且与所述干扰物具有缔合常数KM1，并且所述第二受体与葡萄糖具有缔合常数Km 并且与所述干扰物具有缔合常数KM2，并且其中，不同于KM/KM1。
【文档编号】G01N33/487GK104428670SQ201380032352
【公开日】2015年3月18日 申请日期:2013年6月18日 优先权日:2012年6月21日
【发明者】巴里·科林·克兰, 威廉·帕特森, 尼古拉斯·保罗·巴威尔, 彼得·埃奇利 申请人:灯船医药有限公司