无染色剂蛋白定量和标准化的制作方法

无染色剂蛋白定量和标准化的制作方法
【专利摘要】本发明公开了使用卤烷基化色氨酸荧光进行蛋白定量和标准化的方法。使用与色氨酸残基反应以形成荧光产物的卤代有机化合物(即卤代烷)处理来自没有共同蛋白分布的多种来源的复杂的蛋白样品(即各自含有1000或更多种不同蛋白的样品)。随后使用紫外光对样品进行辐照并对所得来自各样品中所有蛋白的荧光发射进行检测和定量以获得多个样品之间总蛋白含量的可比数值。发现如此获得的数值是比较性总蛋白含量的有效指标，尽管由于来源各异，色氨酸水平在任何单个样品的多种蛋白和样品间存在广泛差异，这将倾向于在特性和所含蛋白的相对量方面对其自身进行区分。还对蛋白样品进行标准化以校正样品稀释、样品加载和蛋白转移不一致造成的差异，方法为对各样品中总蛋白进行无染色剂检测或对各样品中的子样品进行检测。
【专利说明】无染色剂蛋白定量和标准化
[0001] 相关申请的交叉参考
[0002] 本申请要求2012年4月27日提交的标题为"Stain-freetotalprotein quantificationofcomplexsamplesfromdiversesources(来自多种来源的复杂样品 的无染色剂总蛋白定量）"的美国临时申请号61/639, 692的优先权，其全部内容通过引用 纳入本文以用于所有目的。本申请还要求2012年4月27日提交的标题为"Stain-free technologyforwesternblottotalnormalization(用于western印迹总体标准化的无 染色剂技术）"的美国临时申请号61/639, 686的优选权，其全部内容通过引用纳入本文以 用于所有目的。
[0003] 发明背景
[0004] 生物技术中的实验室过程通常包括单个蛋白的检测、鉴定和定量。然而，除各混合 物中的单个蛋白外，某些步骤还需要对整个蛋白混合物进行定量，同时需要或不需要使单 个蛋白彼此分离或区分。这类总蛋白定量是有价值的，例如在比较来自不同样品的蛋白量 时，包括来自不同对象、不同生物体和不同物种，或者来自处于不同发育阶段或疾病或疾病 病症的不同阶段的同一物种或对象的样品。在这些情况下，总蛋白测定可揭示基因表达的 定量变化，在诊断、治疗和治疗剂的测试中具有价值。总蛋白测定也可用于检测分析系统中 的样品加载和蛋白转移。例如，在将样品加载至微孔板的单个孔或电泳凝胶的单条泳道中 时，需要多个孔或泳道间具有均一和恒定的加载量以确保对样品所进行的任何分离或其他 步骤中能够做出适当的比较。蛋白转移在例如Western印迹中发生，这也是受关注的领域， 因为总蛋白定量可显示印迹是否正确实施，或是否出现了不完全转移。
[0005] 使用常规染色剂（如C00MASSIE?亮蓝（巴斯夫公司（BASF Aktiengesellschaft)，德国路德维希）、PonceauS(西格玛-艾尔德里奇公司 (Sigma-Aldrich)，美国密苏里州圣路易斯）和SYPR0RUBY?(西格玛-艾尔德里奇公司）的 蛋白检测和定量是已知的。Edwards等在美国专利号US7, 569, 103B2 (2009年8月4日） 和US8, 007, 646B2 (2011年8月30日）中公开了无染色剂技术，其中引发色氨酸的吲哚部 分和多个卤素取代的有机化合物中任意一个（特别提到了氯仿、三氯乙醇和三氯乙酸）之 间的UV光诱导的反应以生成发射波长在可见光范围内的荧光化合物。该技术因此包括使 用含卤素试剂处理蛋白或其中存在蛋白的凝胶，使蛋白或凝胶暴露于UV光，并对所得单个 蛋白条带的发射光进行检测和定量。
[0006] 色氨酸在蛋白中相对稀少，且各蛋白中色氨酸残基与总氨基酸残基的比例彼此间 差异很大。基于此，对目前无染色剂技术应用的认识受到了限制。因此，已知该技术可用 于比较同一蛋白的不同样品，例如，通过比较各样品中相同分子量蛋白的单个条带的强度。 不同样品中不同蛋白条带之间的比较是徒劳的，因为不同蛋白很可能具有不同的色氨酸含 量，因此无法预期在以相同量存在时产生相同的信号强度。然而，色氨酸差异不必然限制该 技术在单个蛋白比较中的应用。对来自同一来源的样品进行测定时，总蛋白测定是有效的。 该技术可用于印迹实验中，例如用于比较印迹前后凝胶中的无染色剂信号以确定任何蛋白 是否仍存在于凝胶中。通过使用蛋白的已知浓度范围构建标准曲线并评估含未知量同一蛋 白的样品（前提是样品中的蛋白量在标准曲线的范围内），该技术还可用于绝对定量。然 而，在所有情况下，比较都是同一样品在一些操作前后或者不同样品中同一单个蛋白之间 的直接比较。在这些情况下，不同蛋白之间色氨酸含量的任何差异都不会否定结果的有效 性。
[0007] 在研究样品中感兴趣的单个蛋白时，有时相对于样品中一种或多种其他蛋白或者 相对于样品中的全部蛋白对该蛋白量进行标准化是有益处的。标准化是一种校正实验数据 的方法，以适应样品稀释、样品加载或蛋白转移不一致中的差异。例如，如果两种不同细胞 培养物被用作样品，可能各培养物含有不同的细胞数目。如果两种样品中各细胞含有相同 量的特定蛋白，则含有更多细胞的培养物含有更多的蛋白。在不知道一种样品所含细胞多 于另一种样品的情况下，会不正确地总结出一种培养物中的平均细胞含有的蛋白多于另一 种培养物中的平均细胞。标准化用于校正这类差异。
[0008] 最常见的标准化方法是使用管家蛋白（HKP)。作为HKP，该蛋白在所有样品中必需 以大致相同的量存在。通常选择微管蛋白、GAPDH和肌动蛋白作为HKP，由于其通常缺乏与 实验条件变化相关的差异。然而，许多发表物显示，选择HKP时需要持谨慎态度，因为在实 验条件或样品类型变化的情况下并非所有HKP都是恒定的。基于此，通常推荐使用多种HKP 以确证结果，这使western印迹实验增加了时间和复杂程度。
[0009] 使用HKP作为印迹标准化的方法是令人畏缩的。两种频繁使用的技术是"剥离和 重新探测（stripandreprobe)"和多重突光检测。与所使用的方法无关，使用GAPDH、肌动 蛋白或微管蛋白的基于HKP的标准化需要对检测的线性范围、抗体稀释、孵育时间和成像 设置进行优化。
[0010] 使用剥离和重新探测方法时，对感兴趣的蛋白进行探测和检测。随后使用热、去污 剂或还原剂的一些组合将抗体和检测化学物质从膜上剥离下来。随后可使用HKP特异性抗 体重新探测或重新检测印迹。该步骤不仅是耗时的，而且该剥离步骤会不可避免地除去一 些水平的抗原，从而损害下游结果。
[0011] 多重荧光western印迹是一种较好的解决方案，其中可使用多种荧光标记的二抗 同时探测和检测多个抗原。多重Western印迹需要上述相同的优化，但具有诸如抗体交叉 反应性的其他挑战，并应在尝试多重检测前单独验证各抗原的检测的位置具有优化步骤。
[0012] 如果希望通过剥离和重新探测避免与使用HKP或者多重荧光印迹检测的优化相 关的挑战，作为代替，可使用称作总蛋白标准化（TPN)的技术。有三种常规使用以进行TPN 的方法。第一种是在分析前对样品进行蛋白测定并随后将其稀释至相同浓度以用于分析。 这通常使用Bradford染色测定、二辛可宁酸（BCA)测定或其他类似方法完成。不幸的是， 该方法假定该过程中没有差异，而事实通常并非如此。制备样品和将样品加载在凝胶上时 的任何吸液差异都无法得到解释且该方法也无法解释凝胶和膜之间的印迹效率差异。进行 TPN的另一种方法是在凝胶运行结束后对其染色。这可使用可逆染色完成，如使用结合凝胶 中蛋白进行检测并可洗去的锌基或铜基染色剂以不干扰印迹过程和后续免疫检测。虽然该 方法会解释样品制备和凝胶加载中的差异，但其无法解释印迹效率的差异且其使过程增加 了时间和复杂性。进行TPN的第三种方法是在膜上使用着色或荧光染色剂，如SYPRORuby、 PonceauS和酰胺黑（AmidoBlack)。该方法能够解释样品制备和转移效率中的差异，但其 仍使过程增加了时间和复杂性。
[0013] 本发明提供了一种新的且较容易的方法，通过使用无染色剂技术进行TPN，从而避 免HKP相关的困难并消除现有TPN方法的缺陷。


【发明内容】

[0014] 本文提供了使用卤烷基化色氨酸荧光以定量并比较一种或多种目标蛋白样品中 蛋白总量，并对蛋白样品之中或之间的一种或多种蛋白量进行标准化的方法。
[0015] 在一些实施方式中，提供了使用测得的卤烷基化色氨酸荧光以对目标蛋白样品中 蛋白总量进行定量的方法。该方法包括，对于多个参考蛋白样品的各蛋白样品，提供参考蛋 白样品中的蛋白总量，并对从参考蛋白样品中检测到的卤烷基化色氨酸荧光量进行定量。 该方法还包括对从目标蛋白样品中检测到的卤烷基化色氨酸荧光量进行定量。此外，该方 法包括基于参考蛋白样品中的蛋白总量和从参考蛋白样品和目标蛋白样品中检测到的卤 烷基化色氨酸荧光量，对目标蛋白样品中的蛋白总量进行定量。
[0016] 在该方法的一个实施方式中，在计算机上对目标蛋白样品中的蛋白总量进行定 量。
[0017] 在该方法的另一个实施方式中，目标蛋白样品包含约1000或更多种不同蛋白。
[0018] 在该方法的又一个实施方式中，目标蛋白样品获自血清样品、组织匀浆或细胞裂 解物。
[0019] 在该方法的又一个实施方式中，各参考蛋白样品包含约1000或更多种不同蛋白。
[0020] 在该方法的另一个实施方式中，至少一种参考蛋白样品获自血清样品、组织匀浆 或细胞裂解物。
[0021] 在该方法的又一个实施方式中，至少两种参考蛋白样品获自同一生物个体的不同 细胞或组织。
[0022] 在该方法的又一个实施方式中，至少两种参考蛋白样品获自同一物种的不同生物 个体。
[0023] 在该方法的另一个实施方式中，至少两种参考蛋白样品获自不同物种。
[0024] 在该方法的另一个实施方式中，至少一种参考蛋白样品中的蛋白总量由分光光度 测量得到。
[0025] 在其他实施方式中，该方法还包括构建使参考蛋白样品的蛋白总量与卤烷基化色 氨酸荧光量进行定量关联的标准曲线的步骤，并使用标准曲线对目标蛋白样品中的蛋白总 量进行定量。可通过线性内推法或线性外推法对目标蛋白样品中蛋白总量进行定量。
[0026] 还提供了一种使用测得的卤烷基化色氨酸荧光定量比较两种目标蛋白样品中相 对蛋白总量的方法。该方法包括对从各目标蛋白样品中检测到的卤烷基化色氨酸荧光量进 行定量；计算从目标蛋白样品中检测到的卤烷基化色氨酸荧光量的比例；并基于该比例比 较目标蛋白样品中相对蛋白总量。
[0027] 在该方法的一个实施方式中，在计算机上比较目标蛋白样品中的相对蛋白总量。
[0028] 在本发明的另一个实施方式中，从目标蛋白样品中检测到的卤烷基化色氨酸荧光 量的比例被视为目标蛋白样品中蛋白总量的比例。
[0029] 在该方法的又一个实施方式中，各目标蛋白样品包含约1000或更多种不同蛋白。
[0030] 在该方法的又一个实施方式中，各目标蛋白样品获自血清样品、组织匀浆或细胞 裂解物。
[0031] 在上述任何方法中，可通过获取电泳凝胶或印迹膜的部分的图像（所述部分包括 蛋白样品）并确定图像中蛋白样品所引发的卤烷基化色氨酸荧光的总量，从而对从各蛋白 样品中检测到的卤烷基化色氨酸荧光量进行定量。在一些实施方式中，电泳凝胶或印迹膜 包括多个泳道，且电泳凝胶或印迹膜的部分对应一条泳道。在一些实施方式中，使蛋白样品 接触卤代烷，使电泳凝胶或印迹膜暴露于UV光，并记录具有约400nm至约500nm波长的荧 光再发射光，从而获取图像。卤代烷可选自氯仿、三氯乙酸和三氯乙醇。
[0032] 在这些方法的一些实施方式中，通过卤烷基化色氨酸荧光对该图像的面积进行积 分来测量图像中蛋白样品引发的卤烷基化色氨酸荧光的总量。
[0033] 在这些方法的其他实施方式中，蛋白样品引发的卤烷基化色氨酸荧光是波长为约 400nm至约500nm的光，所述光在蛋白样品暴露于UV光时从蛋白样品中发射。
[0034] 这些方法的其他实施方式还包括进行背景扣除步骤。该步骤包括：从包含蛋白样 品的电泳凝胶或印迹膜中获取背景图像，其中背景图像对应于凝胶或膜中基本不含蛋白的 部分；测量背景图像中的卤烷基化色氨酸荧光总量或平均量；并从蛋白样品引发的卤烷基 化色氨酸荧光总量中减去背景图像中的卤烷基化色氨酸荧光总量或平均量。在一些这类实 施方式中，背景扣除步骤在计算机上进行。
[0035] 还提供了一种通过使用测得的卤烷基化色氨酸荧光将蛋白样品的第一子样品中 的蛋白量对蛋白样品的第二子样品中的蛋白量进行标准化的方法。该方法包括：对从第一 子样品中检测到的卤烷基化色氨酸荧光量进行定量；对从第二子样品中检测到的卤烷基化 色氨酸荧光量进行定量；并基于从第一子样品和第二子样品中检测到的卤烷基化色氨酸荧 光量，将第一子样品中的蛋白量对第二子样品中的蛋白量进行标准化。
[0036] 在该方法的一个实施方式中，第一子样品是一种蛋白。在另一个实施方式中，第二 子样品是样品中的所有蛋白。在又一个实施方式中，第二子样品是管家蛋白。在又一个实 施方式中，标准化在计算机上进行。
[0037] 在本方法的另一个实施方式中，标准化步骤包括使用从第一子样品中检测到的卤 烷基化色氨酸量除以从第二子样品中检测到的卤烷基化色氨酸量以获得比例。
[0038] 此外，还提供了一种比较第一蛋白样品和第二蛋白样品中目标蛋白相对量的方 法。该方法包括：根据上述标准化方法，将第一蛋白样品中的目标蛋白量对第一蛋白样品中 的所有蛋白的量进行标准化，以获得第一蛋白样品的比例；根据上述标准化方法，将第二蛋 白样品中的目标蛋白量对第二蛋白样品中的所有蛋白的量进行标准化，以获得第二蛋白样 品的比例；并比较第一和第二蛋白样品的比例。在该方法中，第一蛋白样品和第二蛋白样品 可获自相同的细胞、组织或生物体。第一蛋白样品和第二蛋白样品还可获自同一物种的生 物体。
[0039] 在一些实施方式中，上述将蛋白样品的第一蛋白子样品对第二蛋白子样品进行标 准化的方法还包括获得包含蛋白样品的电泳凝胶或印迹膜的图像的步骤，并使用该图像对 从各子样品中检测到的卤烷基化色氨酸荧光量进行定量。可通过使蛋白样品接触卤代烷， 使电泳凝胶或印迹膜暴露于UV光，并记录具有约400nm至约500nm波长的荧光再发射光， 从而获取图像。卤代烷可选自氯仿、三氯乙酸和三氯乙醇。电泳凝胶或印迹膜可包含多个 泳道，且蛋白样品可出现在一条泳道中。
[0040] 在标准化方法的一些实施方式中，获取图像，并通过以下方法对从各子样品中检 测到的卤烷基化色氨酸荧光量进行定量：将图像部分指定为对应于子样品；并测量该图像 部分中子样品所引发的卤烷基化色氨酸荧光总量。对应于第一和第二子样品的图像部分可 以重叠。
[0041] 对应于第一子样品的图像部分可以是电泳凝胶或印迹膜上的一条条带，且第一子 样品可以是一种蛋白。对应于第二子样品的图像部分可以是电泳凝胶或印迹膜的整条泳 道，且第二子样品可以是样品中的全部蛋白。或者，对应于第二子样品的图像部分可以是电 泳凝胶或印迹膜上的一条条带，且第二子样品可以是管家蛋白。在任何实施方式中，管家蛋 白可以是甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH)、肌动蛋白或微管蛋白。
[0042] 电泳凝胶或印迹膜还可包括分子量标准品，并可基于分子量指定对应于第一子样 品或第二子样品的图像部分。
[0043] 在该方法的一个实施方式中，图像部分相应部分中的卤烷基化色氨酸荧光对该图 像的该部分的面积进行积分以测量各子样品引发的卤烷基化色氨酸荧光总量。
[0044] 在该方法的另一个实施方式中，各子样品引发的卤烷基化色氨酸荧光是波长为约 400nm至约500nm的光，所述光在子样品暴露于UV光时从子样品中发射。
[0045] 标准化方法还可包括进行背景扣除步骤。该步骤包括：从包含蛋白样品的电泳凝 胶或印迹膜中获取背景图像，其中背景图像对应于基本不含蛋白的一部分凝胶或膜；测量 背景图像中的卤烷基化色氨酸荧光总量或平均量；并从图像各部分的卤烷基化色氨酸荧光 总量中减去背景图像中的卤烷基化色氨酸荧光总量或平均量。背景扣除步骤可在计算机上 进行。
[0046] 本发明还提供了一种检测不同生物来源的多种生物样品中总蛋白含量差异的方 法，各样品含有约1000或更多种不同蛋白。该方法包括以下步骤：(a)使所述多种样品各自 接触卤代有机化合物（即卤代烷），所述卤代有机化合物在紫外光的辐照下与色氨酸残基 反应以形成荧光化合物；(b)在接触所述卤代有机化合物（即卤代烷）的同时，使用所述紫 外光辐照所述样品，并定量检测从各所述样品的所有蛋白中发射的总荧光信号；以及（c) 比较所述多种生物样品之间的所述总荧光信号，作为总蛋白含量差异的指标。
[0047] 在该方法的一些实施方式中，所述样品悬浮于凝胶中。该凝胶可以是聚丙烯酰胺 凝胶。该方法的步骤（a)可包括仅在所述样品悬浮于凝胶中后使用所述卤代有机化合物 (即卤代烷）处理该凝胶。可以通过在将所述多种样品加载至凝胶上前将所述卤代有机化 合物（即卤代烷）整合在凝胶中来对凝胶进行预处理。各所述样品可占据凝胶的单个泳道， 并可通过电泳使各所述样品的所述蛋白分布于各所述泳道中。凝胶可包含溶解在其中的所 述卤代有机化合物（即卤代烷），且步骤（a)可包括通过电泳使全部所述样品的全部蛋白迁 移至所述凝胶中。
[0048] 在检测多种生物样品中总蛋白含量差异的方法的其他实施方式中，样品是Western印迹。Western印迹可保留在支持物上，所述支持物选自硝酸纤维素、尼龙和聚二 氟乙烯。在一个实施方式中，所述支持物是硝酸纤维素膜。
[0049] 在该方法的其他实施方式中，所述多种样品包括来自不同哺乳动物物种的样品。 多种样品可以是血清样品、组织匀浆或细胞裂解物。
[0050] 在该方法中，卤代有机化合物（即卤代烷）选自氯仿、三氯乙酸和三氯乙醇。卤代 有机化合物（即齒代烷）可以是三齒代化合物或三氯化合物。或者，齒代有机化合物（即 卤代烷）可以选自三卤代脂肪醇、三卤代脂肪酸、三卤代脂肪胺和三卤代脂肪烷。
[0051] 本发明还提供了用于校正蛋白混合物样品之间比较的实验数据以适应样品稀释、 样品加载或蛋白转移不一致中差异的方法。该方法包括以下步骤：(a)使多种所述样品各 自接触卤代有机化合物（即卤代烷），所述卤代有机化合物在紫外光的辐照下与色氨酸残 基反应以形成荧光化合物；(b)在接触所述卤代有机化合物的同时，使用所述紫外光辐照 所述样品，并定量检测从各所述样品的所有蛋白中发射的总荧光信号；以及（c)对所述多 种生物样品之间的所述总荧光信号进行标准化。
[0052] 附图简要说明
[0053] 图1显示了电泳凝胶和印迹膜上来源于细胞裂解物的卤烷基化色氨酸荧光的检 测，以及蛋白总量与荧光强度的关联性。（A)由TGX"任何KD"Criterion无染色剂1-DSDS 凝胶（18槽）分离并使用ChemiDocMP成像的Hela细胞裂解物（每条泳道2. 5 -80iig总蛋 白）。M=标记物蛋白。（B)由TGX"任何KD"18槽Criterion无染色剂1-DSDS凝胶分离、 转印至硝酸纤维素膜并使用ChemiDocMP成像的Hela细胞裂解物（每条泳道2. 5 - 80yg 总蛋白）。M=标记物蛋白。（C)印迹膜上无染色剂技术的线性：由TGX"任何KD" 18槽 Criterion无染色剂1-DSDS凝胶分离并转印至硝酸纤维素膜的Hela细胞裂解物（每条泳 道2. 5 - 80yg总蛋白）。以类似方法使用PVDF膜进行实验。
[0054] 图2显示了使用卤烷基化色氨酸荧光在电泳凝胶和印迹膜上对获自大鼠肝脏 (A)、大豆（B)和人血清（C)的蛋白提取物的检测。显示了加载至各泳道的蛋白总量g)。
[0055] 图3显示了从大鼠肝脏、大豆和人血清蛋白提取物的样品中检测到的卤烷基化色 氨酸荧光强度与各样品蛋白总量之间的相关性。通过获取印迹膜（如图2中的那些）的图 像对齒烷基化色氨酸荧光进行定量。
[0056] 图4显示了使用卤烷基化色氨酸荧光和免疫荧光观察的印迹膜上的LCL细胞裂 解物。（A)由TGX"任何KD"Criterion无染色剂1-DSDS凝胶分离、转印至PVDF膜并使 用ChemiDocMP成像的LCL细胞裂解物（每条泳道30yg总蛋白）。（B)不同波长下使用 ChemiDocMP对LCL样品的DNA复制因子MCM7和管家蛋白GAPDH(用作加载对照）进行的 免疫荧光成像。针对MCM7 (小鼠）和GAPDH(兔）的单克隆抗体分别1:1000和1:2500稀 释。来自罗克兰公司（Rockland)的二抗是抗兔DyLight549(1:10,000)和抗小鼠DyLight 649(1:20, 000)。
[0057] 图5显示了本发明的一些实施方式使用的计算机系统。
[0058] 发明详述
[0059] 无染色剂技术是一种独特的胶内化学方法，其中凝胶制剂包含卤代有机化合物， 当暴露于UV辐照时，能够激活凝胶中卤代有机化合物和蛋白上色氨酸残基之间的共价反 应，形成荧光产物从而允许通过UV诱导的荧光进行检测。本文中这类卤代有机化合物也称 作"卤代烷"，且这些化合物与色氨酸残基之间的反应被称作齒烷基化。因此，如果色氨酸残 基经历卤烷基化反应，则认为该色氨酸残基被卤烷基化，且这类残基的UV诱导的荧光被称 作卤烷基化色氨酸荧光。
[0060] 现在，已发现用于共同来源的单个蛋白或蛋白混合物的同一无染色剂检测技术也 可应用于非共同来源或不具有共同蛋白分布的复杂蛋白混合物，并仍获得了有效且有用的 结果。因此，可以进行整个不相关样品的批量蛋白定量，且结果可用于比较不同样品之间的 蛋白总量，甚至当样品的蛋白构成不同时也能进行比较。可使用已知浓度的任何复杂样品 构建标准曲线并评价含未知蛋白总量的相同或不同的复杂样品（前提是复杂样品中的蛋 白量在标准曲线的范围中），从而进行绝对定量。可用的样品是含大量蛋白（这对于生物样 品而言是典型的）以及未以任何方式处理或修饰以改变蛋白组成或分布的复杂生物样品。 因此，对于给定样品中的蛋白，其残基是色氨酸残基的比例可能大幅变化，且不同样品会具 有不同的蛋白组合，但所有都将具有大量不同蛋白，如1000或更多。
[0061] 多种卤代有机化合物（即卤代烷）可用于本发明的实践中，实际上，可以使用会与 色氨酸发生化学反应以形成暴露在激发光下会产生荧光的物质的任何齒代有机化合物。特 别感兴趣的卤代有机化合物是三卤代化合物，尤其是三氯化合物和分子量为200或更低的 那些。三卤代脂肪醇、三卤代脂肪酸、三卤代脂肪胺和三卤代脂肪烷都是有用的。特定的示 例是氯仿、三氯乙酸和三氯乙醇。卤代有机化合物可单独使用或联用，例如两种或三种这类 化合物以大致相等的摩尔比联用。
[0062] 可通过本领域已知的使用这些化合物的常规方法将卤代化合物（即卤代烷）应用 于蛋白。例如，当蛋白在凝胶中时，可将凝胶浸没在卤代化合物的溶液中。溶液中溶剂的选 择和卤代化合物的浓度可广泛变化并可易于依据最终产生的信号强度进行优化。可使用溶 解该化合物的任何溶剂或溶剂组合。在多数情况下，水或水和低分子量纯（如甲醇、乙醇或 异丙醇）的混合物就足够了。浓度的范围可以为约1% (重量百分比）至约30% (重量百 分比），或在许多情况下约5%至约20% (重量百分比）。依据凝胶中卤代化合物本身的 量，这也可以广泛变化，但有效且高效的结果通常是在凝胶中使用约0. 2%至约2. 0%的卤 代化合物获得的，且在许多情况下是约〇. 1%至约〇. 5% (体积百分比）。在一些实施方式 中，在倾倒时将卤代化合物加入凝胶中，使得在凝胶运行时蛋白接触化合物，且无需使用化 合物对凝胶进行其他处理（例如将凝胶浸没在化合物的溶液中）以允许化合物与蛋白的色 氨酸残基进行反应。
[0063] 蛋白（即其色氨酸残基）和卤代化合物之间反应的反应时间和条件可广泛变化。 可在室温（70-75°F)下进行接触，但也可使用较高和较低的温度，前提是这类温度下不发 生额外或不需要的反应，不发生相变且反应在经济上可行的反应速率下发生。同样，接触时 间可以变化。在室温下，通常使用约30秒至约30分钟范围内的接触时间可实现有效的结 果，且在许多情况下，使用约1分钟至约10分钟的接触时间可实现最佳效率。通过将凝胶浸 没在卤代化合物的溶液中实现接触时，接触时间后可使用水清洗凝胶以去除过量的溶液。 [0064] 一旦接触完成且去除了过量的卤代化合物，可通过使用足够强度的UV(紫外）光 对包含蛋白和化合物的介质辐照足够常的时间来完成蛋白和化合物之间的反应，以引起反 应发生并产生可被检测和定量的荧光发射。检测和定量的容易程度可根据使用的检测器类 型而变化。有用的波长通常包括约200nm至约400nm范围内的那些，且约30秒至约30分 钟，或更有效地，约1分钟至约10分钟的暴露时间通常会提供合适的结果。辐照可通过透 照或白光照明实现，且检测可通过成像实现，如通过使用摄影，或通过电子传感器（如光电 二极管、电荷耦合器件（CCD)检测器或补充金属氧化物半导体（CMOS)检测器）。可通过常 规成像软件分析数码结果。使用激发光用于检测发射目的的辐照也可在偶联反应发生后进 行，用于初始检测或用于重复检测。
[0065] 通常存在于本文所用术语"复杂样品"中的不同蛋白的数目可以是约50或更多 种，通常在约50种至约100, 000种以内，且在许多情况下为约100种至约50, 000种。这些 蛋白的分子量可广泛变化，且许多这类样品具有范围为小于20个氨基酸至1000或更多个 氨基酸（包括多达5000个氨基酸）的分子量。同样，单个样品中蛋白之间的色氨酸残基数 目可处于低至0至高至5%的范围内。如上所述，复合物样品的示例是血清样品、细胞裂解 物和组织匀浆。可对不同生物来源的样品之间进行比较，如不同成年人、不同年龄的人、患 病和健康的人、不同人种或种族或来自世界不同地区的人、经受不同疾病治疗的人、经受治 疗的人对比未经受治疗的人、人对比非人哺乳动物或任何变量对比对照。其它示例对于本 领域技术人员是显而易见的。
[0066] 在本发明的某些实施方式中，蛋白混合物悬浮于凝胶中。在其他实施方式中，混 合物粘附于或悬浮于膜中或膜上。在其他实施方式中，混合物粘附于或沉淀在固体表面 上，如样品孔的孔底或孔壁。其中悬浮有蛋白的凝胶包括例如聚丙烯酰胺凝胶、淀粉凝胶 和琼脂糖凝胶。其中，最常用的是聚丙烯酰胺凝胶。其上附着有蛋白的膜通常是Western 印迹中使用的那些，且示例是硝酸纤维素、聚偏二氟乙烯和尼龙，其中最常用的是硝酸纤维 素。在许多情况下，将悬浮在凝胶中的蛋白加入凝胶中用于在凝胶中通过电泳进行分离的 目的，且可在分离前或分离后在凝胶中进行总蛋白定量。在单个凝胶或单个膜中，通常将多 种样品在空间上分离以允许其之间进行比较，且可将样品放置于平板凝胶的不同泳道中或 Western印迹膜上转印过程期间样品将会迁移至的相应位置处，以实现这类空间分离。 [0067] 本发明实践中使用的卤代化合物优选在没有任何蛋白染色剂的情况下使用，使得 过程是真正无染色剂的。"蛋白染色剂"指其上本身（即不与氨基酸残基进行任何反应的情 况下）具有颜色或荧光的化合物，且通过除偶联反应外的方法与蛋白粘附。存在许多这类 染色剂，如上文所述，示例为⑶0MMASSIE?亮蓝、PonceauS和SYPRORUBY?。然而，本领域 普通技术人员应理解，用于蛋白定量或标准化的本文所述方法中的许多方法可通过检测染 色的蛋白而非卤烷基化色氨酸荧光进行。例如，与测得的卤烷基化色氨酸荧光量类似，可将 蛋白样品中的染色总量与足够多样化的样品中的蛋白总量相关联。
[0068] 一旦感兴趣的蛋白样品（本文中称作目标蛋白样品）与卤代有机化合物（即卤代 烷）发生反应，可使用UV光进一步辐照样品并可记录得到的荧光再发射光以对样品中蛋白 进行定量。如果样品的蛋白保持互相混合，如在试管中，可使用分光光度计、光电二极管或 其他类似仪器记录再发射光。如果样品的蛋白在电泳凝胶中或印迹膜上彼此物理分离，则 可使用上述胶卷或CCD相机将再发射光记录在凝胶或膜的图像中。随后可将样品的荧光再 发射光（即卤烷基化色氨酸荧光）量与一种或多种参考样品再发射的量进行比较以进行定 量，其中参考样品中的蛋白总量是已知的。
[0069] 为允许对来自目标蛋白样品和来自参考蛋白样品的卤烷基化色氨酸荧光进行直 接比较，可以类似方法制备样品。例如，可在同一电泳凝胶上运行目标和参考蛋白样品，接 触同一卤化烷，使用同一UV光源和/或使用相同的检测设备进行成像。两种类型样品中 更多数目的蛋白导致单个蛋白的色氨酸含量被掩盖，使得来自样品的卤烷基化色氨酸荧光 的整体水平与蛋白总量之间形成更好的关联。因此，如果目标蛋白样品和参考蛋白样品都 是上文所述的"复杂样品"，可进行更精确的目标蛋白样品定量。可使用分光光度测量方法 (如Lowry或Bradford测定，或本领域已知的其他方法）测量参考样品中的蛋白总量。
[0070] 可通过分析凝胶或膜的图像来测量电泳凝胶或印迹膜中蛋白样品引发的卤烷基 化色氨酸荧光量。在一些实施方式中，该图像是凝胶或膜中包含蛋白样品的部分，如凝胶或 膜的一条泳道。可使用任何所需方法分析图像，如通过像素强度对该图像的面积进行积分 或加合。取决于图像是如何获取的，卤烷基化色氨酸荧光可表现为图像的暗或亮的区域，或 具有特定颜色的区域。获取图像时应谨慎，以确保对于样品中尽可能多的卤烷基化蛋白，记 录的荧光量超过检测所需的最低量但没有超过饱和阈值。这有助于确保对样品检测的卤烷 基化色氨酸荧光的总体水平精确地反映蛋白总量。不受限制地，可通过指定图像中感兴趣 的二维区域（例如正方形、长方形或圆形）并加合该区域中的像素强度来进行积分。或者， 可通过图像（如沿凝胶或膜的泳道中央向下）划线以生成强度剖面（intensityprofile), 其可作为单变量函数进行数值积分。
[0071] 在一些实施方式中，在测量蛋白样品引发的卤烷基化色氨酸荧光量时进行背景扣 除步骤。背景扣除涉及在卤烷基化蛋白样品不存在的情况下，在与该样品存在时所用相同 或相似条件（例如以相同的波长或使用相同的检测设备）下记录光。该光并非由卤烷基化 色氨酸荧光引发，而是环境的或检测方法的人工痕迹。随后从对样品检测得到的卤烷基化 色氨酸荧光量中扣除记录的光水平（本文中称为背景光水平）。通过除去从样品中检测的 卤烷基化色氨酸荧光量的人为贡献，背景扣除允许多种样品间卤烷基化色氨酸荧光量与蛋 白总量之间更精确的关联。
[0072] 如果在样品处于试管中时测量蛋白样品的卤烷基化色氨酸荧光，则可通过使用UV 光辐照试管中的不同组合物并记录任何再发射的光来测量背景光水平。该组合物可以是例 如未与卤代烷接触的蛋白样品，其中悬浮蛋白样品的缓冲液，或水。或者，如果在样品处于 电泳凝胶或印迹膜中时检测蛋白样品的卤烷基化色氨酸荧光，则可以通过获取背景图像来 测量背景光水平。这是凝胶或膜中基本不含蛋白、或者含有尚未与卤代烷接触的蛋白的部 分的图像。随后图像中符合卤烷基化色氨酸荧光的任何信号可对该图像的面积进行积分， 通过分析上述背景图像测量背景光水平。背景光水平还可以是背景图像中记录的色氨酸荧 光的平均水平。在一些实施方式中，背景图像的大小与对应于一个蛋白样品的图像相同，例 如凝胶或膜的一条泳道的大小。在其他实施方式中，背景图像较小，例如对应于两条泳道之 间的区域。为进行背景扣除，可对各蛋白样品（即对目标蛋白样品和各参考蛋白样品）测 量不同的背景光水平，或者相同的背景光水平可用于超过一种蛋白样品。
[0073] -旦检测到了目标蛋白样品和参考蛋白样品的卤烷基化色氨酸荧光，且对各样品 的卤烷基化色氨酸荧光量进行了定量（扣除任何背景光水平），则可对目标蛋白样品中的 蛋白总量进行定量。在一些实施方式中，这可通过构建标准曲线来完成，如下文所述。首先， 使用卤烷基化色氨酸荧光量相对于参考蛋白样品的蛋白总量进行作图（参见图1)。然后， 使用分析函数拟合已绘制的点，从而建立进行作图的两种变量之间的函数关系。不受理论 的限制，拟合函数可以是直线或任何其他单调函数。最后，通过确定目标蛋白样品中检测到 的卤烷基化色氨酸荧光量所对应的蛋白量，通过拟合函数对目标样品中的蛋白总量进行定 量。
[0074] 在拟合函数是直线的实施方式中，可使用线性回归进行拟合，例如最小二乘法。当 目标蛋白样品中检测到的卤烷基化色氨酸荧光量（分别）落在参考蛋白样品检测值范围的 内部或外部时，可通过线性内插或线性外插确定目标蛋白样品中的蛋白总量。发明人惊讶 地发现，定量相似的标准曲线获自具有多种来源的蛋白样品一例如，获自不同细胞类型 或生物体的样品（参见图2和3)。因此，并不需要对每个目标蛋白样品构建新的标准曲线， 并且为了对目标蛋白样品中的蛋白总量进行精确定量，参考蛋白样品的蛋白含量无需与目 标蛋白样品密切相关。相反，可使用任何来源的一组参考蛋白样品构建标准曲线，前提是这 些样品中的每个都含有足够多样性的蛋白，且该曲线可用于对多种不同目标蛋白样品中的 蛋白总量进行定量。
[0075] 在本发明的一些实施方式中，可以在不构建标准曲线的情况下或者依赖从多种参 考蛋白样品中检测到的卤烷基化色氨酸荧光量对目标蛋白样品中的蛋白总量进行定量或 表征。例如，在一些实施方式中，可比较目标蛋白样品与单个参考蛋白样品的卤烷基化色氨 酸荧光量。如果参考蛋白样品中蛋白总量是已知的（例如通过上述分光光度测量），则该量 乘以两种样品的卤烷基化色氨酸荧光量的比例就得到了目标蛋白样品中蛋白总量的预测 值。该预测值的精确程度依赖目标和参考蛋白样品中蛋白数目、样品的蛋白中色氨酸残基 的平均数目和是否进行了背景扣除等因素。在其他实施方式中，可比较两种目标蛋白样品 的卤烷基化色氨酸荧光量，此时各样品的蛋白总量是未知的。这里，可通过计算测得的卤烷 基化色氨酸荧光量的比例来比较样品。该比例可视作蛋白总量的比例，或其预测值。例如， 在其它条件都相同的情况下，如果目标蛋白样品发射的卤烷基化色氨酸荧光是另一样品的 两倍，则目标蛋白样品所含蛋白也大约是另一样品的两倍。该预测值的精确程度取决于多 种因素，如上文所述。
[0076] 用于对从蛋白样品中检测到的卤烷基化色氨酸荧光量进行定量的本文所述方法 还可用于进行标准化。在一些实施方式中，标准化涉及鉴定蛋白样品的一种或多种子样品。 子样品是样品中蛋白的子集，且可以是一种蛋白、多种蛋白或样品中的所有蛋白。子样品在 需要时可与样品中任何其他蛋白分离，例如在电泳凝胶或印迹膜上，并使用分子量标准品、 共迁移染料或者凝胶或膜上的条带图样等方法进行鉴定。一旦完成鉴定，则可对从子样品 中检测到的卤烷基化色氨酸荧光量进行定量。在一些实施方式中，标准化包括对从两种不 同子样品（即第一子样品和第二子样品）中检测到的卤烷基化色氨酸荧光量进行定量，并 比较这些量。
[0077] 可使用上文所述电泳凝胶或印迹膜进行定量。可首先指定图像部分以对应于子样 品，从而对从各子样品中检测到的卤烷基化色氨酸荧光量进行定量。这可通过使用软件标 记图像中感兴趣的区域来完成，且可基于分子量，例如通过参考也在图像中出现的凝胶或 膜上的分子量标准品。在优选实施方式中，图像部分与整个子样品共延伸。然后，测量子样 品引发的卤烷基化色氨酸荧光总量。该测量可通过对图像的指定部分上像素强度进行积分 或者在需要时分析图像部分来完成。在一些实施方式中，还进行了背景扣除步骤，如上文所 述获取凝胶或膜的背景图像，测量背景图像相关的背景光水平（例如卤烷基化色氨酸荧光 总量或平均量）并从图像的各指定部分中的卤烷基化色氨酸荧光总量中扣除背景光水平。
[0078] 在使用电泳凝胶或印迹膜的图像进行标准化时，提取第一和第二子样品的蛋白样 品可出现在凝胶或膜的一条泳道中。因此，对应于第一子样品和第二子样品的图像部分可 以是同一条泳道的不同部分。在一些实施方式中，第一或第二子样品是单个蛋白且图像的 相应部分是凝胶或膜上的单个条带。具体而言，第二子样品可以是管家蛋白，且标准化可以 相对于管家蛋白进行，如本领域中使用其他检测技术（如抗体）所实践的那样。在一些实 施方式中，第二子样品是样品中的所有蛋白，且因此图像的相应部分是凝胶或膜上的整条 泳道。这些实施方式促进了总蛋白标准化（TPN)。实际上，可按需要且不受限制地选择并鉴 定第一和第二子样品。因此，对应于第一和第二子样品的图像部分可以重叠。
[0079] 在一些实施方式中，标准化步骤包括使用从第一子样品中检测到的卤烷基化色氨 酸荧光量除以从第二子样品中检测到的卤烷基化色氨酸荧光量以获得比例。在这种情况 下，称第一子样品对第二子样品进行标准化。当第二子样品是整个样品时，则以该方式除检 测的荧光量构成了TPN，且比例反映了相对于样品中的所有蛋白的第一子样品中的蛋白丰 度。在大多数情况下，标准化产生的比例不等于第一和第二子样品中蛋白总量的比例，因为 两种子样品都不含有足够多样的蛋白以掩盖个体蛋白之间的色氨酸含量差异。然而，可在 类似来源的样品之间比较标准化比例以追踪第一和第二子样品中蛋白相对丰度的差异，前 提是对于不同样品，以相同的方法鉴定子样品。例如，可对来自第一蛋白样品和第二蛋白样 品的单个目标蛋白进行总蛋白标准化，且所得比例可用于比较两种样品中目标蛋白的相对 量（参见图4和表1)。这两种样品可获自相同的细胞、组织或生物体，或者相同物种的细 胞、组织或生物体。可以不同方式处理这两种样品，或者其来源的细胞、组织或生物体（例 如，一种使用药物且另一种用作对照），且样品中蛋白的标准化量可反映该差异化处理。
[0080] 本文所公开的许多方法都可在计算机上或使用计算机系统进行。这些方法包括但 不限于：对从蛋白样品中检测到的卤烷基化色氨酸荧光量进行定量，如在图像中；对图像 中的像素密度进行积分；指定图像部分用于分析；进行背景扣除；另外操纵或处理图像；构 建标准曲线，如通过进行线性回归；计算比例；和比较比例。可使用本领域技术人员已知的 编程语言和结构编码用于进行这些方法的计算机算法，并在标准计算机系统上执行。下文 提供了本发明实施方式中所用计算机系统的进一步公开。
[0081] 本文所述任何计算机系统可利用任何适当数目的子系统。这类子系统的示例如图 5中计算机设备500所示。在一些实施方式中，计算机系统包括单个计算机设备，其中子系 统可以是该计算机设备的组件。在其他实施方式中，计算机系统可包括多个计算机设备，各 是一个子系统，具有内部组件。
[0082] 图5所示的子系统经由系统总线575互联。显示了其他子系统，如打印机574、键 盘578、储存装置579、与显示适配器582偶联的监视器576等。与输入/输出（I/O)控制 器571偶联的周边和I/O装置可通过任何数量的本领域已知方式（如串行端口 577)连接 至计算机系统。例如，串行端口 577或外部接口 581 (例如以太网、Wi-Fi等）可用于将计 算机系统500连接至广域网（如因特网）、鼠标输入装置或扫描仪。经由系统总线575的互 联允许中央处理器573与各子系统连通并控制来自系统内存572或储存装置579 (例如固 定磁盘，如硬盘或光盘）指令的执行以及子系统间信息的交换。系统内存572和/或储存 装置579可包含计算机可读介质。本文所述的任何数据都可从一种组件输出至另一种组件 并可输出至用户。
[0083] 计算机系统可包括多种相同的组件或子系统，例如通过外部接口 581或通过内部 接口连接在一起。在一些实施方式至，计算机系统、子系统或设备可通过网络连通。在这种 情况下，可将一台计算机作为客户端并将另一台计算机作为服务器，其中各计算机都可以 是同一计算机系统的部分。客户端和服务器可各包括多个系统、子系统或组件。
[0084]应理解，本发明的一些实施方式可使用硬件（例如专用集成电路或现场可编程门 阵列）以控制逻辑的形式和/或通过通常可编程的处理器使用计算机软件以模块化或集成 化的方式来实施。如本文中所用，处理器包括同一集成芯片上的多核处理器或者单个电路 板上或网络连接的多个处理单元。基于本发明的公开和教导，本领域普通技术人员应知晓 并理解使用硬件以及硬件和软件的组合来实施本发明的实施方式的其他方式和/或方法。
[0085] 本申请中描述的任何软件组件或函数都可作为软件代码使用，以由处理器使用任 何适当的计算机语言（如Java、C++或Per1 )、使用例如常规或面向对象的技术来执行。软件 代码可作为一系列指令或命令储存于计算机可读介质上用于储存和/或传输，合适的介质 包括随机存取存储器（RAM)、只读存储器（ROM)、磁性介质（如硬盘或软盘）、光学介质（如 光盘（⑶）或DVD(数字多功能光盘）、闪速存储器等）。计算机可读介质可以是这类储存或 传输装置的任意组合。
[0086] 也可使用适用于传输的载波信号经由遵循多种协议的有线、光纤和/或无线网络 (包括因特网）编码和传输这类程序。同样，可使用这类程序编码的数据信号根据本发明的 实施方式创建计算机可读介质。程序代码编码的计算机可读介质可与兼容装置打包或由其 他装置单独地提供（例如通过因特网下载）。任何这类计算机可读介质可存在于单个计算 机产品（例如硬盘、CD或整个计算机系统）之上或之内，且可存在于系统或网络中不同计 算机产品之上或之内。计算机系统可包括监视器、打印机或其他合适的显示器，用于向用户 提供任何本文所述结果。
[0087] 本文所述方法可全部或部分地使用包括一个或多个处理器的计算机系统进行，可 对其进行配置以完成步骤。因此，实施方式可针对经配置以进行本文所述任意方法的步骤 的计算机系统，其中不同组分可能完成相应步骤或相应步骤组合。虽然以编号的步骤形式 显示，但本文中方法的步骤可同时或以不同顺序进行。此外，这些步骤的部分可与来自其他 方法的其他步骤的部分一同使用。同样，步骤的全部或部分可以是可选的。此外，任何方法 的任何步骤都可使用模块、循环或用于进行这些步骤的其他方法进行。
[0088] 实施例1:卤烷基化色氨酸荧光强度与细胞裂解物总蛋白量的关联
[0089] 无染色剂技术使SDSPAGE凝胶和相应印迹的荧光观察成为可能。图la显示了由 TGX"任何KD"Criterion无染色剂1-DSDS凝胶（18槽）分离并使用ChemiDocMP成像的 Hela细胞裂解物（每条泳道2.5-80iig总蛋白）的电泳图，其中M泳道表示标记物蛋白。 图lb显示了使用同一泳道加载的同一凝胶中同一细胞裂解物的Western印迹，印迹在硝酸 纤维素膜上并使用ChemiDocMP成像，其中M泳道仍表示标记物蛋白。可以容易地监测印 迹前SDS-PAGE分离的质量，并且在印迹过程后可以通过对膜（参见图lb)和SDS凝胶进行 成像以迅速地检查印迹过程的转移效率。可计算印迹上各泳道中总蛋白的相对量并用于定 量标准化。
[0090] 无染色剂技术为常规的印迹染色（如SYPRORuby和PonceauS)提供了相当的灵 敏度，并提供了更好的再现性和线性。图lc是总泳道强度（平均值）相对于每条泳道蛋白 Ug数的图，取自图lb，显示无染色剂技术的线性范围延伸至最多80yg蛋白，对于18孔。 线性范围可进一步延伸至12孔中型凝胶中每条泳道110yg(数据未显示）。这些范围与定 量Western印迹实验中通常的蛋白加载量拟合得很好并可在宽的蛋白加载范围上进行加 载对照计算。
[0091] 实施例2 :总卤烷基化色氨酸荧光与蛋白提取物来源和组成的恒定关系
[0092] 为确定多样化蛋白混合物的来源和组成是否会影响从混合物中检测到的卤烷基 化色氨酸荧光总量，从不同生物体中获取蛋白提取物。随后将提取物稀释至已知浓度以获 得参考蛋白样品，其在卤烷基化后在印迹膜上检测。将从各样品中检测到的卤烷基化色氨 酸荧光总量与样品中的蛋白总量相关联。
[0093] 蛋白提取物获自大鼠肝脏、大豆和人血清，并使用已建立的分光光度法测量各提 取物中蛋白的浓度。将从提取物中制备的参考蛋白样品（60、40、20、10、5、2. 5、1.25iig) - 式两份加载至CriterionTGX12-2孔"任何kD"聚丙烯酰胺凝胶（伯乐公司）上并使用电 泳分离。随后使用Trans-BlotTurbo系统（伯乐公司）将来自各凝胶的样品转移至硝酸 纤维素膜上。在转移前后使用GelDocEZ系统（伯乐公司）对卤烷基化色氨酸荧光进行 成像（图2)。凝胶和膜图像显示不同蛋白提取物的不同蛋白分子量分布。
[0094] 分析膜的图像以对来自各泳道的总卤烷基化色氨酸荧光进行定量。使用ImageLab 软件中的"条带和泳道"根据进行分析。对所有参考蛋白样品而言，无论样品来源于何种生 物体，总荧光强度相对蛋白总量的图（图3)在很大程度上是相同的。
[0095] 实施例3:使用无染色剂技术的Western印迹分析验证了半定量蛋白质谱研究 [0096]类似2-DPAGE的蛋白组学技术通常用于半定量蛋白质谱研究。通过质谱鉴定并 表征以不同量表达的蛋白后，需要通过第二种独立的方法（如Western印迹）验证定量数 据。
[0097] 通过2-DPAGE研究了Y辐照对人LCL细胞系（淋巴母细胞细胞系）的影响。 在以不同量表达的许多其他蛋白中，与未受辐照的对照相比，在辐照的LCL样品中鉴定到 MCM7(-种DNA复制因子）下调了一半。为验证该结果，使用针对MCM7的单克隆抗体进行 了定量Western印迹实验。应用并比较了两种数据标准化方法，即使用GAPDHHKP和本发 明的无染色剂技术的数据标准化。
[0098] 图4显示了由TGX"任何kD"Criterion无染色剂1-DSDS凝胶分离、转印至PVDF 膜并使用ChemiDocMP成像的LCL细胞裂解物（每条泳道30yg总蛋白），并显示抗体孵育 前LCL样品的相应高质量PVDF(聚偏二氟乙烯）印迹，将对照样品（度数标志标记）与受福 照样品（星号标记）比较。图4b显示了不同波长下使用ChemiDocMP对LCL样品的DNA复 制因子MCM7和管家蛋白GAPDH(用作加载对照）进行的免疫荧光成像。针对MCM7 (小鼠） 和GAPDH(兔）的单克隆抗体分别1:1000和1:2500稀释。来自罗克兰公司（Rockland)的 二抗是抗兔DyLight549 (1:10, 000)和抗小鼠DyLight649(1:20,000)。因此，图 4b显示 使用多重荧光方法探测目标蛋白MCM7和加载对照蛋白GAPDH的同一PVDF印迹。通过运行 每条泳道10-50Ug的LCL样品的稀释梯度，事先已证明30iig蛋白加载量和图4b所述的 抗体稀释的组合可提供线性荧光信号（数据未显示）。
[0099]使用GAPDH数据和无染色剂数据进行的MCM7信号强度的数据标准化（参见表 1)显示，MCM7的下调系数是0. 59 (使用GAPDH(p值〈0. 03))和0. 44 (使用无染色剂（p值 〈0.008))。两种系数都良好地反映了最初从2-DPAGE实验中获得的约50%的预期下调。 原始MCM7信号（未标准化）的比较揭示下调系数为0. 48 (p值〈0. 02)，标准偏差35 %。虽 然在实现标准化方面两种标准化方法都是成功的，但本发明的无染色剂技术不需要方法优 化，进行的操作步骤较少，为获得结果所用时间较少，并允许从凝胶或印迹追踪蛋白。
[0100]经2-DPAGE鉴定，MCM7下调了约50%，且Western印迹确认了该结果。使用无染 色剂技术进行的数据标准化显示了 0. 44的下调系数，GAPDH标准化的下调系数为0. 59。
[0101] 表 1
[0102] 使用来自图2a的无染色剂数据和图4b的GAPDH信号对图4b的MCM7 (DNA复制因 子）信号进行的标准化

【权利要求】
1. 一种使用测得的卤烷基化色氨酸荧光对目标蛋白样品中蛋白总量进行定量的方法， 所述方法包括： 对各个参考蛋白样品，提供所述参考蛋白样品中的蛋白总量并对从所述参考蛋白样品 中检测到的卤烷基化色氨酸荧光量进行定量； 对从所述目标蛋白样品中检测到的卤烷基化色氨酸荧光量进行定量；以及 基于所述参考蛋白样品中的蛋白总量和从所述参考蛋白样品和所述目标蛋白样品中 检测到的卤烷基化色氨酸荧光的量，对所述目标蛋白样品中的蛋白总量进行定量。
2. 如权利要求1所述的方法，在计算机上对所述目标蛋白样品中的蛋白总量进行定 量。
3. 如权利要求1所述的方法，所述目标蛋白样品含有约1000或更多种不同蛋白。
4. 如权利要求1所述的方法，所述目标蛋白样品获自血清样品、组织匀浆或细胞裂解 物。
5. 如权利要求1所述的方法，所述参考蛋白样品各含有约1000或更多种不同蛋白。
6. 如权利要求1所述的方法，至少一种参考蛋白样品获自血清样品、组织匀浆或细胞 裂解物。
7. 如权利要求1所述的方法，至少两种参考蛋白样品获自同一生物个体的不同细胞或 组织。
8. 如权利要求1所述的方法，至少两种参考蛋白样品获自同一物种的不同生物个体。
9. 如权利要求1所述的方法，至少两种参考蛋白样品获自不同物种。
10. 如权利要求1所述的方法，至少一种所述参考蛋白样品中的蛋白总量由分光光度 测量测得。
11. 如权利要求1所述的方法，还包括构建使所述参考蛋白样品的蛋白总量与卤烷基 化色氨酸荧光量相关联的标准曲线的步骤，并使用所述标准曲线对所述目标蛋白样品中的 蛋白总量进行定量。
12. 如权利要求11所述的方法，通过线性内插法或线性外推法对所述目标蛋白样品中 的蛋白总量进行定量。
13. -种使用测得的卤烷基化色氨酸荧光定量比较两种目标蛋白样品中相对蛋白总量 的方法，所述方法包括： 对从各目标蛋白样品中检测到的卤烷基化色氨酸荧光量进行定量； 计算从所述目标蛋白样品中检测到的卤烷基化色氨酸荧光量的比例；以及 基于所述比例比较所述目标蛋白样品中的相对蛋白总量。
14. 如权利要求13所述的方法，在计算机上比较所述目标蛋白样品中的相对蛋白总 量。
15. 如权利要求13所述的方法，从所述目标蛋白样品中检测到的卤烷基化色氨酸荧光 量的所述比例被解释为所述目标蛋白样品中总蛋白量之间的比例。
16. 如权利要求13所述的方法，各目标蛋白样品含有约1000或更多种不同蛋白。
17. 如权利要求13所述的方法，各目标蛋白样品获自血清样品、组织匀浆或细胞裂解 物。
18. 如权利要求1或13所述的方法，通过获取电泳凝胶或印迹膜的部分的图像，并测量 所述图像中所述蛋白样品所引起的卤烷基化色氨酸荧光总量，从而对从各蛋白样品中检测 到的卤烷基化色氨酸荧光量进行定量，所述电泳凝胶或印迹膜的部分包含所述蛋白样品。
19. 如权利要求18所述的方法，所述电泳凝胶或印迹膜包括多条泳道，且所述电泳凝 胶或印迹膜的部分对应一条泳道。
20. 如权利要求18所述的方法，通过使所述蛋白样品接触卤代烷，使所述电泳凝胶或 印迹膜暴露于UV光，并记录具有约400nm至约500nm波长的荧光再发射光，从而获取所述 图像。
21. 如权利要求20所述的方法，所述卤代烷选自氯仿、三氯乙酸和三氯乙醇。
22. 如权利要求18所述的方法，所述图像中所述蛋白样品引发的卤烷基化色氨酸荧光 总量通过所述齒烷基化色氨酸荧光对所述图像的面积进行积分来测量。
23. 如权利要求18所述的方法，所述蛋白样品引发的卤烷基化色氨酸荧光是波长为约 400nm至约500nm的光，所述光在所述蛋白样品暴露于UV光时从所述蛋白样品中发射。
24. 如权利要求18所述的方法，还包括进行背景扣除步骤，包括： 从包括所述蛋白样品的所述电泳凝胶或印迹膜处获取背景图像，所述背景图像对应于 所述电泳凝胶或印迹膜中基本不含蛋白的部分； 测量所述背景图像中卤烷基化色氨酸荧光的总量或平均量；以及 从所述蛋白样品所引发的卤烷基化色氨酸荧光总量中扣除所述背景图像中卤烷基化 色氨酸荧光的总量或平均量。
25. 如权利要求24所述的方法，所述背景扣除步骤在计算机上进行。
26. -种通过使用检测到的卤烷基化色氨酸荧光将蛋白样品的第一子样品中的蛋白量 对所述蛋白样品的第二子样品中的蛋白量进行标准化的方法，所述方法包括： 对从所述第一子样品中检测到的卤烷基化色氨酸荧光量进行定量； 对从所述第二子样品中检测到的卤烷基化色氨酸荧光量进行定量；以及 基于从所述第一子样品和所述第二子样品中检测到的卤烷基化色氨酸荧光量，将所述 第一子样品中的蛋白量对所述第二子样品中的蛋白量进行标准化。
27. 如权利要求26所述的方法，所述第一子样品是一种蛋白。
28. 如权利要求26所述的方法，所述第二子样品是所述样品中的所有蛋白。
29. 如权利要求26所述的方法，所述第二子样品是管家蛋白。
30. 如权利要求26所述的方法，所述标准化在计算机上进行。
31. 如权利要求26所述的方法，所述标准化包括使用从所述第一子样品中检测到的卤 烷基化色氨酸量除以从所述第二子样品中检测到的卤烷基化色氨酸量以获得比例。
32. -种比较第一蛋白样品和第二蛋白样品中目标蛋白相对量的方法，所述方法包括 根据权利要求31，将所述第一蛋白样品中所述目标蛋白的量对所述第一蛋白样品中所 有蛋白的量进行标准化，以获得所述第一蛋白样品的比例； 根据权利要求31，将所述第二蛋白样品中所述目标蛋白的量对所述第二蛋白样品中所 有蛋白的量进行标准化，以获得所述第二蛋白样品的比例；以及 比较所述第一和第二蛋白样品的比例。
33. 如权利要求32所述的方法，所述第一蛋白样品和所述第二蛋白样品获自相同的细 胞、组织或生物体。
34. 如权利要求32所述的方法，所述第一蛋白样品和所述第二蛋白样品获自相同物种 的生物体。
35. 如权利要求26所述的方法，还包括获得包含所述蛋白样品的电泳凝胶或印迹膜的 图像的步骤，并使用所述图像对从各子样品中检测到的卤烷基化色氨酸荧光量进行定量。
36. 如权利要求35所述的方法，通过使所述蛋白样品接触卤代烷，使所述电泳凝胶或 印迹膜暴露于UV光，并记录具有约400nm至约500nm波长的荧光再发射光，从而获取所述 图像。
37. 如权利要求36所述的方法，所述卤代烷选自氯仿、三氯乙酸和三氯乙醇。
38. 如权利要求35所述的方法，所述电泳凝胶或印迹膜包括多条泳道，且所述蛋白样 品出现在一条泳道中。
39. 如权利要求35所述的方法，通过以下方法对所述从各子样品中检测到的卤烷基化 色氨酸荧光量进行定量： 指定所述图像的部分以对应于所述子样品；并 测量所述图像的部分中所述子样品引发的卤烷基化色氨酸荧光总量。
40. 如权利要求39所述的方法，对应于所述第一和第二子样品的所述图像的部分重 叠。
41. 如权利要求39所述的方法，对应于所述第一子样品的所述图像的部分是所述电泳 凝胶或印迹膜上的一条条带，且所述第一子样品是一种蛋白。
42. 如权利要求39所述的方法，对应于所述第二子样品的所述图像的部分是所述电泳 凝胶或印迹膜上的一条完整泳道，且所述第二子样品是所述样品中的所有蛋白。
43. 如权利要求39所述的方法，对应于所述第二子样品的所述图像的部分是所述电泳 凝胶或印迹膜上的一条条带，且所述第二子样品是管家蛋白。
44. 如权利要求29或43所述的方法，所述管家蛋白是甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH)、 肌动蛋白或微管蛋白。
45. 如权利要求39所述的方法，所述电泳凝胶或印迹膜还包括分子量标准品，并可基 于所述分子量指定对应于所述第一子样品或所述第二子样品的所述图像的部分。
46. 如权利要求39所述的方法，通过所述图像的相应部分中的卤烷基化色氨酸荧光对 所述图像的该部分的面积进行积分以测量所述各子样品引发的卤烷基化色氨酸荧光总量。
47. 如权利要求39所述的方法，各子样品引发的卤烷基化色氨酸荧光是波长为约 400nm至约500nm的光，所述光在所述子样品暴露于UV光时从所述子样品中发射。
48. 如权利要求39所述的方法，还包括进行背景扣除步骤，包括： 从包括所述蛋白样品的所述电泳凝胶或印迹膜处获取背景图像，所述背景图像对应于 所述电泳凝胶或印迹膜中基本不含蛋白的部分； 测量所述背景图像中卤烷基化色氨酸荧光的总量或平均量；以及 从所述图像的各部分中的卤烷基化色氨酸荧光总量中扣除所述背景图像中卤烷基化 色氨酸荧光的总量或平均量。
49. 如权利要求48所述的方法，所述背景扣除步骤在计算机上进行。
【文档编号】G01N21/33GK104412097SQ201380034366
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2013年4月25日 优先权日:2012年4月27日
【发明者】S·福瑞比, 刘宁, K·麦克唐纳德, A·保勒斯, A·珀什 申请人:生物辐射实验室股份有限公司