一种具有解酒功效的中药材及活性因子的高通量筛选方法
【专利摘要】本发明公开了一种具有解酒功效的中药材及活性因子的高通量筛选方法，是先将待筛选的若干种中药材分别粉碎，再分别用有机溶剂提取40-60分钟，离心分离，得若干上清液；此上清液即作为待测样本溶液；再在微孔板中加入反应体系；将空白对照样品和待测样品一起置于酶标仪中震荡孵育30min后，迅速在每孔中加入0.04～0.2mmol/L的乙醛溶液15μL，摇匀后立即开始测定各样品在340nm处的吸光值；利用酶标仪自带软件记录吸光度值并绘制出空白对应样品及待测样品吸光度值变化曲线；得出样品曲线净面积NetAUC值；本发明方法一次可筛选上百种甚至几百种中药材,快速、准确率高，操作方便。
【专利说明】—种具有解酒功效的中药材及活性因子的高通量筛选方法【技术领域】
[0001]本发明涉及一种高通量筛选活性物质的方法，具体是一种具有解酒功效的中药材及活性因子的高通量筛选方法。
【背景技术】
[0002]中国是一个具有深厚酒文化底蕴的国家，大小喜事、聚会以及各种节日都离不开酒。但过量饮酒给人类健康和社会治安造成危害的报道已屡见不鲜。传统中药用于解酒有悠久的历史，目前，我国常用中药材达几百种，如何从常用中药材中寻找具有一定解酒功效的中药，并将其开发成具有解酒功效，安全方便的药物或保健品，使醉酒者服用后可快速起效，已成为相关行业开发解酒产品的主要途径。现在常规的筛选方法一次只能筛选一种中药，耗时长，试剂用量大，不能满足企业产品开发的需求。
【发明内容】
[0003]本发明的目的就是提供一种高效、快捷、简便的具有解酒功效的中药材及活性因子的高通量筛选方法。
[0004]本发明采用的技术方案包括下述步骤:
a.将待筛选的若干种中药材分别粉碎至20~100目，分别用30%~90%乙醇、甲醇或丙酮中的一种提取40-60分钟，离心分离，得若干上清液；或将待筛选的若干活性因子分别用30%~90%乙醇、甲醇或丙酮中的一种提取40-60分钟，离心分离，得若干上清液；此上清液即作为待测样本溶液；
b.在微孔板中的每个微孔中加入下述反应体系:50_200mmol/L、pH7.8-8.5的磷酸钾缓冲液75-90 μ L，0.1~0.5mmol/L的二硫苏糖醇10-15 μ L，0.1~2mg/ml乙醛脱氢酶20-25 μ L, 0.0625 ~20mmol/L NAD+ 溶液 30 μ L ;
c.再在上述其中一个微孔中加入90mmol/L、ρΗ8.5的磷酸钾缓冲溶液25 μ L作为空白对照样品，余下微孔中一一加入各待测样本溶液25 μ L作为待测样品并编号；然后一起置于酶标仪中震荡孵育30min后，迅速在每孔中加入0.04~0.2 mmol/L的乙醛溶液15 u L,摇勾后立即开始测定各样品在340nm处的吸光值；
d.利用酶标仪自带软件记录吸光度值并绘制出空白对照样品及待测样品吸光度值变化曲线；将所得到的待测样品曲线的积分面积减去空白对照样品的曲线积分面积，得出待测样品曲线净面积Net AUC值，此值即为激活率；激活率为正数时证明该样品中所加入的中药材或活性因子具有激活乙醛脱氢酶的能力，也说明该药材或活性因子具有解酒的功效；反之，激活率为负数时，说明该样品中所加入的中药材或活性因子不具备激活或具有抑制乙醛脱氢酶的能力，也说明该药材或活性因子不具有解酒的功效。
[0005]本发明的优选方法包括下述步骤: a.将待筛选的若干种中药材分别粉碎至100目，分别用70%乙醇提取60分钟，离心分离，得若干上清液；或将待筛选的若干活性因子分别用70%乙醇溶解，离心分离，得若干上清液；上述所得的上清液即作为待测样本溶液；
b.在微孔板中的每个微孔中加入下述反应体系:100mmol/L、pH8.5的磷酸钾缓冲液90 μ L, 0.5mmol/L 的二硫苏糖醇 10 μ L, lmg/ml 乙醒脱氢酶 25 μ L, IOmmoI/LNAD+ 溶液30 μ L ；
c.再在上述其中一个微孔中加入90mmol/L、pH8.5的磷酸钾缓冲溶液25 μ L作为空白对照样品，余下微孔中一一加入各待测样本溶液25 μ L作为待测样品并编号；然后一起直于酶标仅中震汤鮮育30min后,迅速在每孔中加入0.lmmol/L的乙溶液15 μ L,摇勾后立即开始测定各样品在340nm处的吸光值；
d.利用酶标仪自带软件记录吸光度值并绘制出空白对照样品及待测样品吸光度值变化曲线；将所得到的待测样品曲线的积分面积减去空白对照样品的曲线积分面积，得出待测样品曲线净面积Net AUC值，此值即为激活率；激活率为正数时证明该样品中所加入的中药材或活性因子具有激活乙醛脱氢酶的能力，也说明该药材或活性因子具有解酒的功效；反之，激活率为负数时，说明该样品中所加入的中药材或活性因子不具备激活或具有抑制乙醛脱氢酶的能力，也说明该药材或活性因子不具有解酒的功效。
[0006]本发明中所述的活性因子是单体化合物或复合物。
[0007]本发明的方法是基于以下原理来实现的:乙醇(酒精)通过胃和肠道吸收进入人体血液循环，然后再进行代谢分解，乙醇氧化成乙醛，乙醛在乙醛脱氢酶和NAD+ (氧化态辅酶I)作用下，氧化成乙酸，同时NAD+还原成NADH (还原态辅酶I)，而NADH在340nm处有吸收而其他反应物在此波长下均无吸收。利用酶标仪测定此波长下生成物吸光度的大小及变化，即可以预测加入物质对乙醛脱氢酶(ALDH)的作用，从而筛选得到具有解酒功效的中药材及活性因子。
[0008]本发明与现有技术相比，具有以下特点:
1.本发明首次利用高通量方法对具有解酒功效的中药材或活性因子进行筛选，根据需要选择不同规格的微孔板，一次最多可筛选上百种或几百种中药材或活性因子，耗时短，精确率高，试剂用量少；
2.选用的反应体系更简单，操作方便；
3.本发明选用96孔微孔板作为反应容器，根据辅酶I变化吸收值来筛选乙醛脱氢酶活性，进而筛选具有解酒功效的中药材或活性因子活性因子，为开发解酒产品提供一定依据。
【专利附图】
【附图说明】
[0009]图1是空白对照样品及加入百合样品后在一定时间内的吸光度值变化曲线。
[0010]图中:1一空白对照样品曲线，2—百合样品曲线。
【具体实施方式】
[0011]为了进一步说明本发明专利内容，以具体实施例说明。
[0012]实施例1
1.将待筛选的95种中药材(见表I待筛选药材清单)分别粉碎过100目药典筛后，分别用70%乙醇提取60分钟，离心分离(6000rpm，15min)，得各药材的上清液；此上清液即为待测样本溶液(为操作方便，可先将此上清液转入微孔板中，并根据检测需要作适当稀释，也可不经过此步骤);
表1待筛选药材清单
【权利要求】
1.一种具有解酒功效的中药材及活性因子的高通量筛选方法，其特征在于包括下述步骤: a.将待筛选的若干种中药材分别粉碎至20?100目，分别用30%?90%乙醇、甲醇或丙酮中的一种，提取40-60分钟，离心分离，得若干上清液；或将待筛选的若干活性因子分别用30%?90%乙醇、甲醇或丙酮中的一种，提取40-60分钟，离心分离，得若干上清液；此上清液即作为待测样本溶液； b.在微孔板中的每个微孔中加入下述反应体系:50-200mmol/L、pH7.8-8.5的磷酸钾缓冲液75-90 μ L, 0.1?0.5mmol/L的二硫苏糖醇10-15 μ L, 0.1?2mg/ml乙醒脱氢酶20-25 μ L, 0.0625 ?20mmol/L NAD+ 溶液 30 μ L ; c.再在上述其中一个微孔中加入90mmol/L、pH8.5的磷酸钾缓冲溶液25 μ L作为空白对照样品，余下微孔中一一加入步骤a.所制备的待测样本溶液25 μ L，作为待测样品并编号；然后一起直于酶标仅中震汤鮮育30min后,迅速在每孔中加入0.04?0.2 mmol/L的乙醛溶液15 μ L，摇匀后立即开始测定各样品在340nm处的吸光值； d.利用酶标仪自带软件记录吸光度值并绘制出空白对照样品及待测样品吸光度值变化曲线；将所得到的待测样品曲线的积分面积减去空白对照样品的曲线积分面积，得出待测样品曲线净面积Net AUC值，此值即为激活率；激活率为正数时证明该样品中所加入的中药材或活性因子具有激活乙醛脱氢酶的能力，也说明该药材或活性因子具有解酒的功效；反之，激活率为负数时，说明该样品中所加入的中药材或活性因子不具备激活或具有抑制乙醛脱氢酶的能力，也说明该药材或活性因子不具有解酒的功效。
2.根据权利要求1所述的一种具有解酒功效的中药材及活性因子的高通量筛选方法，其特征在于包括下述步骤: a.将待筛选的若干种中药材分别粉碎至100目，分别用70%乙醇提取60分钟，离心分离，得若干上清液；或将待筛选的若干活性因子分别用70%乙醇溶解，离心分离，得若干上清液；上述所得的上清液即作为待测样本溶液； b.在微孔板中的每个微孔中加入下述反应体系:100mmol/L、pH8.5的磷酸钾缓冲液90 μ L, 0.5mmol/L 的二硫苏糖醇 10 μ L, lmg/ml 乙醒脱氢酶 25 μ L, 10mmol/L NAD+ 溶液30 μ L ； c.再在上述其中一个微孔中加入90mmol/L、pH8.5的磷酸钾缓冲溶液25 μ L作为空白对照样品，余下微孔中一一加入步骤a.所制得的待测样本溶液25 μ L，作为待测样品并编号；然后一起直于酶标仅中震汤鮮育30min后,迅速在每孔中加入0.lmmol/L的乙溶液15 u L,摇勾后立即开始测定各样品在340nm处的吸光值； d.利用酶标仪自带软件记录吸光度值并绘制出空白对照样品及待测样品吸光度值变化曲线；将所得到的待测样品曲线的积分面积减去空白对照样品的曲线积分面积，得出待测样品曲线净面积Net AUC值，此值即为激活率；激活率为正数时证明该样品中所加入的中药材或活性因子具有激活乙醛脱氢酶的能力，也说明该药材或活性因子具有解酒的功效；反之，激活率为负数时，说明该样品中所加入的中药材或活性因子不具备激活或具有抑制乙醛脱氢酶的能力，也说明该药材或活性因子不具有解酒的功效。
3.根据权利要求1或2所述的一种具有解酒功效的中药材及活性因子的高通量筛选方法，其特征在于:所述的活性因子是单体化合物或复合物。
【文档编号】G01N21/33GK103983598SQ201410255847
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年6月11日 优先权日:2014年6月11日
【发明者】刘源才, 赖富丽, 熊瑜, 冯声宝 申请人:劲牌有限公司