一种评价转基因棉花对大草蛉影响的生物测定方法
【专利摘要】本发明提供了一种评价转基因棉花对大草蛉影响的生物测定方法，包括在培养皿底部铺入琼脂；将转基因棉花叶片放入琼脂表面，接入初孵棉铃虫幼虫；大草蛉初孵幼虫先用豌豆蚜饲喂1-3天，之后用取食转基因棉花叶片1-3天的棉铃虫幼虫饲喂大草蛉幼虫；从饲喂棉铃虫幼虫第1天起每天观察大草蛉幼虫生长发育情况，直至化蛹、羽化；设置对照组；以大草蛉的化蛹率、羽化率、幼虫重量、成虫重量、总发育时间作为指标，比较处理组与对照组的差异，通过方差分析比较其差异显著性，评价转基因棉花对大草蛉的影响，该生物测定方法适用广泛，对利用“转基因植物-害虫-捕食性天敌”营养关系评价转基因植物中高剂量蛋白对捕食性天敌的影响都能够进行有效测定。
【专利说明】一种评价转基因棉花对大草蛉影响的生物测定方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物保护【技术领域】，具体地说，涉及一种利用Bt抗性棉铃虫评价转基因棉花对大草蛉生长发育影响的生物测定方法。
【背景技术】
[0002]大草蛉Chrysopa pallens属于昆虫纲，脉翅目，草蛉科。它是许多作物生态系统中普遍存在的、资源丰富的天敌，其幼虫和成虫都是捕食性的，可以取食蚜虫、叶螨、鳞翅目的卵和低龄幼虫等，捕食范围广泛。早期人们评价转基因植物对草蛉的影响结果表明转基因植物对草蛉没有不良影响，如Li等的研究发现，普通草蛉取食表达CrylAb或Cry3Bbl的玉米花粉后，其存活率、产卵前期、生殖力、产卵量及成虫干重与取食非转基因玉米花粉的草蛉没有显著差异(Li&ROmeis，2010);雒捃瑜等发现和常规棉花相比，饲喂取食转双价抗虫棉(表达CrylAc和Cry2Ab蛋白)和单价抗虫棉(表达CrylAc蛋白)的棉铃虫初孵幼虫，使中华草蛉Chrysoperla sinica Tjeder的生长发育时间延长,但差异未达到显著水平(雒裙瑜等,2011)。但Hilbeck等的室内非选择性生测结果却表明普通草蛉Chrysopacarnea幼虫在捕食Bt玉米上的欧洲玉米螟Ostrinia nubiIalis和埃及棉夜蛾SpodopteraIittoralis后,其死亡率高于对照；用加入CrylAb蛋白的人工饲料饲喂草蛉幼虫,其死亡率仍然高于对照；但该报道之后的一系列试验证明CrylAb对普通草蛉幼虫没有直接毒性(Hilbeck et al.，1998)。Romeis等认为以Bt敏感的昆虫作为猎物对捕食性天敌的不利影响是因为Bt毒素造成猎物营养质量下降，进而间接影响了捕食性天敌的生长发育，并不是Bt本身对天敌的毒性造成的(Romeis et al.，2004)。Yu等也认为当前使用的抗虫转基因作物作用范围较窄，对非靶标生物没有直接的不利影响，而且提高了一些有益昆虫的丰度和对害虫的自然控制作用(Yu et al.，2011)。
[0003]2003年，孟山都公司通过杂交在Bollgard(转基因抗虫保铃棉)基础上转入一个新的Cry2Ab基因，开发出表达CrylAc和Cry2Ab两种不同杀虫蛋白的Bollgard II。这个转基因棉花品种，在美国、澳大利亚、南非、墨西哥和菲律宾等国家已开始商业化种植。所以研究这个品种对非靶标昆虫的影响具有重要意义。
[0004]大草蛉能够捕食取食转基因棉叶的棉铃虫Helicoverpa armigera、棉姆Aphisgossypii Glover等,利用食物营养关系研究转双价抗虫棉花中表达蛋白CrylAc和Cry2Ab对大草蛉的影响至关重要。利用抗性棉铃虫建立评价体系，使取食转基因棉花的棉铃虫体内含有更多Bt蛋白，可以传递更多的蛋白到捕食棉铃虫的大草蛉体内，更有利于评价高剂量Bt对大草蛉的影响；而且由于棉叶的保鲜问题使棉铃虫的存活率较低，因此建立适用于“转基因新鲜棉叶-抗性棉铃虫-大草蛉”评价体系的生物测定方法，是准确评价转基因棉花对大草蛉影响的关键，结果将为转基因作物的安全性评价奠定基础。
[0005]Li Y, Romeis J.Bt maize expressing Cry3Bbldoes not harm the spidermite, Tetranychus urticae, or its ladybird beetle predator, Stethorus punctilium.B1logical Control, 2010，53(3):337-344。
[0006]雒裙瑜，崔金杰，辛惠江.转CrylAc+Cry2Ab基因棉花对天敌生长发育的影响.中国棉花研究报告，2011，38(12): 11-36。
[0007]Hilbeck A，Baumgartner Mj Fried P M，et al.Effects of transgenicBacillus thuringiensis corn-fed prey on mortality and development timeof immature Chrysoperla cornea (Neuroptera:Chrysopidae)。Environmentalentomology, 1998，27(2):480-487。
[0008]Romeis J，Dutton A，Bigler F.Bacillus thuringiensis toxin(CrylAb)has nodirect effect on larvae of the green lacewing Chrysoperla carnea (Stephens)(Neuroptera:Chrysopidae).Journal of Insect Phys1logy，2004，50 (2):175-183。
[0009]Yu H Lj Li Y Hj Wu K M.Risk Assessment and ecological effects oftransgenic Bacillus thuringiensis crops on non-target organisms.Journal ofintegrative plant b1logy，2011，53(7):520-538。
【发明内容】
[0010]针对现有技术不足，本发明的目的是提供一种利用Bt抗性棉铃虫评价转基因棉花对大草蛉生长发育影响的生物测定方法。
[0011]为实现上述目的，本发明提供一种评价转基因棉花对大草蛉影响的生物测定方法，包括以下步骤:
[0012]I)在培养皿底部铺入浓度为2%的琼脂，此浓度琼脂硬度适于棉花叶片的叶柄插入，同时达到保持叶片新鲜的目的；
[0013]2)将转基因棉花叶片放入琼脂表面，接入初孵棉铃虫幼虫，使其取食转基因棉叶1-3天，保证棉铃虫幼虫体内一定的Bt蛋白含量；
[0014]3)大草蛉初孵幼虫先用豌豆蚜饲喂1-3天，确保大草蛉的存活率，且增加大草蛉幼虫的捕食棉铃虫的能力，之后用取食转基因棉花叶片1-3天的棉铃虫幼虫饲喂大草蛉幼虫；
[0015]4)从饲喂棉铃虫幼虫第I天起每天观察大草蛉幼虫生长发育情况，直至化蛹、羽化；
[0016]5)以取食常规非转基因棉花叶片的棉铃虫幼虫饲喂大草蛉幼虫作为对照组；
[0017]6)在大草蛉取食4-5天棉铃虫后，以大草蛉的化蛹率、羽化率、最后一次取食棉铃虫后的幼虫重量、羽化后24小时的成虫重量、总发育时间等作为指标，比较处理组与对照组的差异，通过方差分析比较其差异显著性，评价转基因棉花对大草蛉的影响:如果差异显著，表明存在影响；反之，不存在影响。
[0018]优选的，步骤5)中，如果与取食豌豆蚜的大草蛉幼虫相比，对照组中大草蛉幼虫生长缓慢，需同时给处理组和对照组的大草蛉幼虫补充营养，使大草蛉幼虫顺利完成生活史。
[0019]优选的，取食非转基因棉花亲本的叶片，以排除其他影响因素。
[0020]优选的，通过饲喂豌豆蚜和/或鳞翅目害虫卵补充营养。
[0021]优选的，采用隔天补充营养:一天棉铃虫幼虫、一天豌豆蚜和/或鳞翅目害虫卵，或者采用后期补充营养。
[0022]优选的，将琼脂粉与蒸馏水混合得到的2 %琼脂溶液加热煮沸，将热的琼脂溶液倒入一次性塑料培养皿中冷却至室温制得2%的琼脂。
[0023]优选的，所述步骤2)中转基因棉花叶片为苗期5叶期的叶片。
[0024]优选的，叶片反面贴放在琼脂表面，可以更好保湿，且有利于棉铃虫取食。
[0025]优选的，所述初孵棉铃虫室内用Bt (如CrylAc、Cry2Ab、Vip3Aa等)筛选的抗性棉铃虫，品系的选择根据需要测定的转基因棉花中表达的相应Bt蛋白种类而确定，以敏感棉铃虫为对照。
[0026]优选的，所述大草蛉和棉铃虫饲养条件为:温度25±2°C，湿度75±10%，光照16:8(L:D)h。
[0027]优选的，所述大草蛉每天饲喂5-10头棉铃虫幼虫。
[0028]具体地，本发明提供了一种利用Bt抗性棉铃虫评价转基因棉花对大草蛉影响的生物测定方法，包括如下步骤:
[0029]I)将琼脂粉Agar与蒸馏水混合得到的2%琼脂溶液加热煮沸，将热的琼脂溶液30-40ml倒入上表面直径9cm，底面直径8.7cm的一次性塑料培养皿中冷却I小时至室温；
[0030]2)转基因棉花苗期5叶期叶片反面贴放在冷却的琼脂表面，接入初孵Bt抗性棉铃虫幼虫或敏感棉铃虫，使其取食转基因棉花叶片2天，用橡胶圈绷紧培养皿防止棉铃虫初孵幼虫逃逸；
[0031]3)大草蛉初孵幼虫先用豌豆蚜饲喂2天，之后用取食转基因棉花叶片2天的棉铃虫幼虫饲喂大草蛉幼虫，每天更换新鲜棉铃虫幼虫；
[0032]4)从饲喂棉铃虫幼虫第I天起每天观察大草蛉幼虫生长发育情况，直至化蛹、羽化；
[0033]5)以取食常规非转基因棉花亲本叶片的棉铃虫幼虫饲喂大草蛉幼虫作为对照组；
[0034]6)在大草蛉取食5天棉铃虫后，以大草蛉的化蛹率、羽化率、最后一次取食棉铃虫后的幼虫重量、羽化后24小时的成虫重量、总发育时间等作为指标，比较处理组与对照组的差异，通过方差分析比较其差异显著性，评价转基因棉花对大草蛉的影响:如果差异显著，表明存在影响；反之，不存在影响。
[0035]本发明的优点在于，该生物测定方法适用广泛，对利用“转基因植物-害虫-捕食性天敌”营养关系，评价转基因植物中高剂量蛋白对捕食性天敌的影响都能够进行有效测定。并利用琼脂的保湿作用解决了转基因棉花叶片的保鲜问题，而且能够使大草蛉幼虫阶段捕食到棉铃虫和豌豆蚜，可以使测定更接近实际田间状况，具有很强的实用性。
【具体实施方式】
[0036]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0037]实施例1
[0038]将琼脂粉与蒸馏水混合得到的2%琼脂溶液加热煮沸，将热的琼脂溶液倒入一次性塑料培养皿中冷却至室温；将供试的转基因棉花苗期叶片反面贴放在冷却的琼脂表面，接入初孵CrylAc抗性棉铃虫幼虫或敏感棉铃虫，用橡胶圈绷紧培养皿防止棉铃虫初孵幼虫逃逸。
[0039]棉花品种:转基因棉花33B (表达CrylAc蛋白)、转双价棉花品种Bollgard II (表达CrylAc+Cry2Ab)、非转基因棉花亲本33。棉铃虫品系:Cry IAc抗性品系(在室内用CrylAc蛋白筛选的棉铃虫抗性品系)、敏感棉铃虫。
[0040]将大草蛉初孵幼虫用豌豆蚜饲养2天，然后用取食转基因棉花(33B、Bollgard II ) 2天的棉铃虫幼虫饲喂大草蛉幼虫，每天更换新的棉铃虫幼虫，待大草蛉取食棉铃虫幼虫5天后，改用充足的豌豆蚜每天饲喂大草蛉，观察记录大草蛉生长发育情况直至羽化。
[0041]每个棉花品种处理每天接90头棉铃虫初孵幼虫(每培养皿接30头)，连续接5天。棉铃虫取食两天后选取生长良好的幼虫饲喂给大草蛉幼虫，每头大草蛉每天给予5-10头的棉铃虫。5天后给予大草蛉幼虫足够的豌豆蚜，从取食棉铃虫开始,每天记录大草蛉幼虫的存活及蜕皮情况并称重。试验重复3次，评价棉叶中的蛋白通过棉铃虫对大草蛉的影响。
[0042]对照组饲喂非转基因棉花亲本33，其余操作相同。
[0043]敏感棉铃虫取食转基因棉花两天后，幼虫表现为明显的死亡或拒食现象，幼虫不能正常生长，因此没有继续饲喂给大草蛉。其他处理的结果如表1所示。
[0044]表1转基因棉花对大草蛉的生物学参数影响
[0045]
【权利要求】
1.一种评价转基因棉花对大草蛉影响的生物测定方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)在培养皿底部铺入浓度为2%的琼脂； 2)将转基因棉花叶片放入琼脂表面，接入初孵棉铃虫幼虫，使其取食转基因棉花叶片1_3 天； 3)大草蛉初孵幼虫先用豌豆蚜饲喂1-3天，之后用取食转基因棉花叶片1-3天的棉铃虫幼虫饲喂大草蛉幼虫，每天更换新鲜棉铃虫幼虫； 4)从饲喂棉铃虫幼虫第I天起每天观察大草蛉幼虫生长发育情况，直至化蛹、羽化； 5)以取食常规非转基因棉花叶片的棉铃虫幼虫饲喂大草蛉幼虫作为对照组； 6)以大草蛉的化蛹率、羽化率、最后一次取食棉铃虫后的幼虫重量、羽化后24小时的成虫重量、总发育时间作为指标，比较处理组与对照组的差异，通过方差分析比较其差异显著性，评价转基因棉花对大草蛉的影响:如果差异显著，表明存在影响；反之，不存在影响。
2.根据权利要求1所述的生物测定方法，其特征在于，步骤5)中，如果与取食豌豆蚜的大草蛉幼虫相比，对照组中大草蛉幼虫生长缓慢，需同时给处理组和对照组的大草蛉幼虫补充营养，使大草蛉幼虫顺利完成生活史。
3.根据权利要求2所述的生物测定方法，其特征在于，通过饲喂豌豆蚜和/或鳞翅目害虫卵补充营养。
4.根据权利要求3所述的生物测定方法，其特征在于，采用隔天补充营养:一天棉铃虫幼虫、一天豌豆蚜和/或鳞翅目害虫卵。
5.根据权利要求1-4任一所述的生物测定方法，其特征在于，所述步骤2)中转基因棉花叶片为苗期5叶期的叶片。
6.根据权利要求5所述的生物测定方法，其特征在于，叶片反面贴放在琼脂表面。
7.根据权利要求1-4任一所述的生物测定方法，其特征在于，所述初孵棉铃虫用Bt筛选的抗性棉铃虫，品系的选择根据需要测定的转基因棉花中表达的相应Bt蛋白种类而确定，以敏感棉铃虫为对照。
8.根据权利要求1-4任一所述的生物测定方法，其特征在于，所述大草蛉每天饲喂5-10头棉铃虫幼虫。
【文档编号】G01N33/48GK104133054SQ201410318625
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2014年7月4日 优先权日:2014年7月4日
【发明者】王英丽, 梁革梅, 魏纪珍, 袁向东, 赵曼 申请人:中国农业科学院植物保护研究所