纸基微流控芯片阳极电流检测水污染物生物毒性的方法
【专利摘要】纸基微流控芯片阳极电流检测水污染物生物毒性的方法，先制作纸基微流控芯片，再利用纸基微流控芯片测定水污染物生物毒性，基于微生物呼吸链-对BQ体系电化学检测原理，在丝网印刷PDMS亲水微通道和碳浆三电极系统的纸基微流控芯片上，采用小片纤维素膜导通亲水微通道上的疏水阀来控制液流释放和流动时间，实现培养液与细胞分离、清洗和污染物孵育细胞等环节，从而降低在采用电流信号检测装置的阳极电流定量测定污染物毒性时的干扰，具有质量轻、便携、低成本、一次性分析、所需样品的体积小、分析速度快，适用于偏远地区、野外现场水污染、土壤污染、食品安全以及空间搭载等场合的生物毒性检测。
【专利说明】纸基微流控芯片阳极电流检测水污染物生物毒性的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微流控分析应用于微生物检测污染毒性【技术领域】，特别涉及纸基微流 控芯片阳极电流检测水污染物生物毒性的方法。
【背景技术】
[0002] 微流控芯片作为从九十年代提出的微全分析系统的核心技术，是当前发展最迅速 的领域之一，而纸质微流控芯片是近期发展起来的一种新的微流控芯片形式。纸基微流控 以色谱纸作为芯片材料，使用光刻、等离子体氧化、喷墨印刷、蜡印刷和打印PDMS等技术制 作而成（Xu Li，et al.，2012, 6, 1932-1058)。以试纸和侧向流动的应用为特征的纸基微流 控芯片，由于其便携、批量印刷、制备工艺简单、无需复杂外围设备、可一次性使用、低成本、 样品和试剂用量小、分析速度快和同时检测多种成份等优点，可以促使在家庭、资源匮乏的 偏远地区、野外现场以及空间飞行器等场合使用，当然也就适合在消费市场迅速普及（Ali Kemal Yetisen, et al.，Lab Chip, 2013, 13, 2210-2251)。多种类型和广泛的应用场合使纸 基微流控芯片在化学、生物、医学、环境保护和空间生命科学等领域有着广阔发展前景。
[0003] 用微生物测定样品溶液毒性试验是基于微生物的光学性质（如发光细菌）、呼吸 链活性（如氧化还原介质〇 2和8〇等）或毒物诱导微生物形态变化等类型的基本原理。 就以细菌呼吸链活性测量污染物毒性而言，2008年Wang等用冻干大肠杆菌的生物传感 器经复苏并加入氧化还原介质BQ后，用CellSense软件记录传感器电流（Hong Wang，et al.，Chinese Chemical Letters, 2008, 19, 211-214)，成为 申请人:所见到的最初采用氧化 还原介质BQ反映污染物影响大肠杆菌呼吸链活性的电化学方法。Li等采用明胶包埋大肠 杆菌细胞于玻碳电极表面，仍以BQ作为氧化还原介质测定了混合重金属离子溶液的生物 毒性（Jiuming Li，et al.，Electrochimica Acta，2013,97,52_57)。Yu 等仍米用 BQ 作为 氧化还原介质并与污染物孵育大肠杆菌后，用微玻碳阵列电极测定反映重金属离子毒性的 阳极电流（Dengbin Yu, et al·，Analyst, 2013, 138, 3297-3302)。上述三篇 Wang、Li 和 Yu 的文献，都是基于污染物影响微生物呼吸链活性原理，用电化学方法通过氧化还原介质BQ 检测污染物毒性。但是，它们都没有将样品预处理和电化学检测两类不同的操作单元集成 在一个微流控芯片（特别是廉价可以批量印刷的纸基微流控芯片）上。实现这类原理方法 的检测过程还涉及细菌悬浮液离心和细胞清洗等步骤和相应外围设备（超声震荡器、离心 机和电化学工作站等）。因此，若能够在纸基微流控芯片上实现样品预处理和电化学检测两 个单元的恰当集成，全面地减少污染物的生物毒性检测成本，显著减少试剂用量和操作时 间，大幅降低操作难度，这对基于这类原理检测污染物生物毒性在多个领域的应用，具有重 要的现实意义。
【发明内容】
[0004] 为了克服上述现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供纸基微流控芯片阳极电 流检测水污染物生物毒性的方法，基于微生物呼吸链-对BQ体系电化学检测原理，在丝网 印刷PDMS亲水微通道和碳浆三电极系统的纸基微流控芯片上，采用小片纤维素膜导通亲 水微通道上的疏水阀来控制液流释放和流动时间，实现培养液与细胞分离、清洗和污染物 孵育细胞等环节，从而降低在采用电流信号检测装置的阳极电流定量测定污染物毒性时的 干扰，克服了传统方法的缺陷，具有质量轻、便携、低成本、一次性分析、所需样品的体积小、 分析速度快，适用于偏远地区、野外现场水污染、土壤污染、食品安全以及空间搭载等场合 的生物毒性检测，从而为在环境保护、生命科学、医学和生物化学等领域的生物毒性测定提 供了 一种新类型设备和新方法。
[0005] 为了达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
[0006] 纸基微流控芯片阳极电流检测水污染物生物毒性的方法，包括如下步骤，
[0007] 步骤一、先制作纸基微流控芯片
[0008] (1. 1)、先用绘图软件设计包含对电极4、工作电极5和参比电极6的三电极，将三 电极加工成第一网板21，在色谱纸22正面用碳浆丝网印刷，烘箱中150°C烘1小时，得到包 含三电极的色谱纸；
[0009] (1.2)、再用绘图软件设计包括五个微通道和进样区3,五个微通道为上微通道 13、下微通道15、左微通道14、右第一微通道12、右第二微通道11，以及与右第二微通道11 连通的电化学检测区7、与上微通道13连通的A废液区8、与左微通道14连通的B废液区 9、与下微通道15连通的C废液区10的微流控芯片构型，将微流控芯片构型加工成第二网 板23,在包含三电极的色谱纸的背面对应位置用聚二甲基硅氧烷PDMS与正硅酸乙酯TE0S 液态胶混合物丝网印刷，PDMS与TE0S液态胶混合物质量比8:1，保证三电极对应在电化学 检测区7,烘箱中75°C烘1小时；
[0010] (1. 3)、在色谱纸正面的A废液区8、B废液区9和C废液区10以及电化学检测区 7分别粘贴与对应区域尺寸相同的吸收垫；
[0011] (1. 4)、再在步骤1. 3所得的色谱纸的背面粘贴硬质纸质底片2,得到纸基微流控 芯片，将纸基微流控芯片加固、平整，用高密度打孔机沿纸基微流控芯片上的虚线MN加工 虚线划痕20,加工虚线划痕20将纸基微流控芯片三个废液区8、9、10所在的A区和电化学 检测区7所在的B区分开，以便在完成细胞样品预处理后使A区和B区容易分离；
[0012] 步骤二、利用纸基微流控芯片测定水污染物生物毒性
[0013] (2. 1)、在上述纸基微流控芯片的进样区3滴加培养12小时的含有大肠杆菌混合 液，用与左疏水阀18尺寸相同的纤维素膜导通亲水左微通道14上的左疏水阀18,使得左微 通道14与进样区3相连通，使培养液沿左微通道14与大肠杆菌细胞分离；
[0014] (2. 2)、用与上疏水阀17和下疏水阀19尺寸相同的纤维素膜导通亲水上微通道13 和下微通道15上的上疏水阀17和下疏水阀19,在上述包含大肠杆菌的纸基微流控芯片进 样区3滴加中性磷酸盐缓冲液清洗大肠杆菌两次，使两次清洗废液依次沿上微通道13和下 微通道15与大肠杆菌细胞分离；
[0015] (2. 3)、再在进样区3滴加混合液，混合液为浓度1. 25mM的苯醌溶液与已知浓度的 重金属离子溶液以及中性磷酸盐缓冲液，三者体积比为5:1:4,并37°C孵育60分钟反应，再 用纤维素膜导通亲水右第一微通道12上的右疏水阀16,使反应后含氢醌成分的混合液经 过亲水右第一微通道12和右第二微通道11与细胞分离进入连通三电极的电化学检测区 7 ；
[0016] (2. 4)、沿纸基微流控芯片上的虚线丽使B区与A区分离，把B区的三电极连接到 外部设备电流信号检测装置，记录阳极电流，根据电流计算呼吸链活性抑制比：
[0017]
【权利要求】
1. 纸基微流控芯片阳极电流检测水污染物生物毒性的方法，其特征在于，包括如下步 骤， 步骤一、先制作纸基微流控芯片 (1. 1)、先用绘图软件设计包含对电极⑷、工作电极（5)和参比电极（6)的三电极，将 三电极加工成第一网板（21)，在色谱纸（22)正面用碳浆丝网印刷，烘箱中150°C烘1小时； 得到包含三电极的色谱纸； (1.2) 、再用绘图软件设计包括五个微通道和进样区（3)，五个微通道为上微通道 (13)、下微通道（15)、左微通道（14)、右第一微通道（12)、右第二微通道（11)，以及与右第 二微通道（11)连通的电化学检测区（7)、与上微通道（13)连通的A废液区（8)、与左微通 道（14)连通的B废液区（9)、与下微通道（15)连通的C废液区（10)的微流控芯片构型，将 微流控芯片构型加工成第二网板（23)，在包含三电极的色谱纸的背面对应位置用聚二甲基 硅氧烷PDMS与正硅酸乙酯TEOS液态胶混合物丝网印刷，PDMS与TEOS液态胶混合物质量 比8:1，保证三电极对应在电化学检测区（7)，烘箱中75°C烘1小时； (1. 3)、在色谱纸正面的A废液区（8)、B废液区（9)和C废液区（10)以及电化学检测 区（7)分别粘贴与对应区域尺寸相同的吸收垫； (1. 4)、再在步骤1. 3所得的色谱纸的背面粘贴硬质纸质底片（2)，得到纸基微流控芯 片，将纸基微流控芯片加固、平整，用高密度打孔机沿纸基微流控芯片上的虚线MN加工虚 线划痕（20)，加工虚线划痕（20)将纸基微流控芯片三个废液区（8、9、10)所在的A区和电 化学检测区（7)所在的B区分开，以便在完成细胞样品预处理后使A区和B区容易分离； 步骤二、利用纸基微流控芯片测定水污染物生物毒性 (2. 1)、在上述纸基微流控芯片的进样区（3)滴加培养12小时的含有大肠杆菌混合液， 用与左疏水阀（18)尺寸相同的纤维素膜导通亲水左微通道（14)上的左疏水阀（18)，使得 左微通道（14)与进样区（3)相连通，使培养液沿左微通道（14)与大肠杆菌细胞分离； (2. 2)、用与上疏水阀（17)和下疏水阀（19)尺寸相同的纤维素膜导通亲水上微通道 (13)和下微通道（15)上的上疏水阀（17)和下疏水阀（19)，在上述包含大肠杆菌的纸基微 流控芯片进样区（3)滴加中性磷酸盐缓冲液清洗大肠杆菌两次，使两次清洗废液依次沿上 微通道（13)和下微通道（15)与大肠杆菌细胞分离； (2.3) 、再在进样区（3)滴加混合液，混合液为浓度1.25mM的苯醌溶液与已知浓度的重 金属离子溶液以及中性磷酸盐缓冲液，三者体积比为5:1:4,并37°C孵育60分钟反应，再用 纤维素膜导通亲水右第一微通道（12)上的右疏水阀（16)，使反应后含氢醌成分的混合液 经过亲水右第一微通道（12)和右第二微通道（11)与细胞分离进入连通三电极的电化学检 测区（7); (2. 4)、沿纸基微流控芯片上的虚线MN使B区与A区分离，把B区的三电极连接到外部 设备电流信号检测装置，记录阳极电流，根据电流计算呼吸链活性抑制比：
式中i和L分别表示水污染物存在与不存在时所记录的电流。
2. 根据权利要求1所述的纸基微流控芯片阳极电流检测水污染物生物毒性的方法，其 特征在于，所述的大肠杆菌混合液中的大肠杆菌能够用酵母菌、亚硝化单胞菌以及它们的
【文档编号】G01N27/26GK104267073SQ201410392974
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年8月11日 优先权日:2014年8月11日
【发明者】梁恒, 许朝萍, 杨峥峥, 刘倩, 欧阳良飞, 孙欢, 杨水云, 徐文 申请人:西安交通大学