胃毒性杀虫剂或转基因杀虫蛋白对意大利蜜蜂幼虫潜在毒性的检测方法
【专利摘要】本发明提供了一种简单灵敏的检测胃毒性杀虫剂或转基因杀虫蛋白对意大利蜜蜂幼虫直接毒性影响的检测方法。该方法通过把受试杀虫化合物均匀地混入人工饲料中直接饲喂给意大利蜜蜂幼虫，并以加入浓度为0.1％(w:w)大豆胰蛋白酶抑制剂SBTI的人工饲料为阳性对照，以纯人工饲料为空白对照，通过比较分析处理组和对照组意蜂幼虫生存率、发育历期、预蛹体重和羽化率等重要生命指标测定受试杀虫化合物对意蜂幼虫的潜在毒性。利用本方法测定了不同浓度SBTI对意蜂幼虫的毒性，结果显示：意蜂幼虫不同生命参数与饲料中SBTI的浓显示出明显的剂量-效应关系，这说明了该方法的有效性和灵敏性。
【专利说明】胃毒性杀虫剂或转基因杀虫蛋白对意大利蜜蜂幼虫潜在毒性的检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及胃毒性杀虫剂或转基因杀虫蛋白对意大利蜜蜂幼虫毒性影响的检测方法。
【背景技术】
[0002]蜜蜂是一种非常重要的经济和生态昆虫(Babendreier et al.，2004)。蜜蜂靠采集花蜜、花粉生存繁衍，客观上起到为植物授粉，促进自然生态平衡发展的作用，这对自然界贡献巨大，是人类以及其他生物所无法比拟的。蜜蜂如意大利蜜蜂以植物花粉为主要蛋白来源，同时也采集植物花蜜和蚜虫或其它昆虫分泌的蜜露。这样，取食过程中可能暴露于杀虫剂或转基因抗虫植物表达的外源杀虫蛋白，如Bt蛋白。取食转基因抗虫植物花粉可能是蜜蜂暴露于转基因外源杀虫蛋白的唯一途径，因为目前还未发现植物花蜜或昆虫蜜露中存在转基因杀虫蛋白。同时，蜜蜂具有重要的经济和生态价值，而且对毒性化合物比较敏感，因此，一直作为重要的指示性物种用于杀虫剂和转基因抗虫植物环境安全评估中(Malone et al.，2001 ；Babendreier et al.，2004，2005 ；Baker et al.，1986 ；Crailsheimet al.，1990)。由于一度缺乏合适的蜜蜂幼虫人工饲料和饲养方法，相关工作中，传统上只釆用蜜蜂工蜂成虫作为受试昆虫。然而，由于蜜蜂幼虫相对成虫对毒性化合物可能更加敏感，釆用蜜蜂幼虫为受试生物可能更能反映出杀虫剂和转基因杀虫蛋白的潜在毒性。因此，最近国际上已逐渐把对蜜蜂幼虫的评价作为杀虫剂和转基因抗虫作物环境安全评价的一个内容。
[0003]主要参考文献:
[0004]Babendreier, D.et al.1nfluence of Bt-transgenic pollen, Bt-toxin andprotease inhibitor (SBTI) ingest1n on development of the hypopharyngeal glandsin honeybees.Apidologie 36,585 (2005).
[0005]Babendreier, D.，Kalbererj N.，Romeis，J.，Flurij P.&Bigler, F.Pollenconsumpt1n in honey bee larvae:a step forward in the risk assessment oftransgenic plants.Apidologie 35，293-300 (2004).
[0006]Baker, H.&Baker, 1.The occurrence and significance of amino acids infloral nectar.Plant Syst.Evol.151，175-186 (1986).
[0007]CrailsheimjK.The protein balance of the honey bee worker.Apidologie21,417-429(1990).
[0008]Malone, L.&Pham-Delegue M-H.Effects of transgene products on honeybees (Apis mellifera)and bumblebees(Bombus sp.).Apidologie 32，1-18 (2001).
[0009]目前，用于评价转基因抗虫作物或杀虫剂对蜜蜂幼虫的潜在影响的技术体系还不完善。这主要涉及人工饲喂体系不能使蜜蜂幼虫保持接近自然条件下的存活率和羽化率，以及所设置的对照不能起到明确的指示作用等因素。其中人工饲喂体系主要涉及人工饲料和饲喂方法两方面，这两方面关联紧密，而且这两方面也会对对照的效果产生影响，而且研究人员不容易找到对体系进行改进依的据或者指示。目前，有一种意蜂幼虫人工饲料，它以蜂王浆和去离子水为主，辅配果糖、葡萄糖和酵母粉。目前利用这类人工饲料建立的意蜂幼虫饲喂体系的7天成活率在80%左右，例如Μ.A.P.Lima, et al.(Does CrylAcBt-toxin impair development of worker larvae of Africanized honey bee? J.App1.Entomo1.135(2011)415 - 422)利用Silva et al.(2009)的人工饲料(组分及相对重量含量如下:蜂王浆49.5%，水36.3%，果糖6.8%，葡萄糖6.8%和酵母粉1.1% )所构建的饲喂体系饲喂意蜂幼虫的成活率如图1所示。
[0010]基于以上所述，目前检测胃毒性杀虫剂或转基因杀虫蛋白对意大利蜜蜂幼虫直接毒性影响的检查方法不够完善，研究人员对现有技术也没有找到改进依据和指示，因此，要提供简单灵敏的检测胃毒性杀虫剂或转基因杀虫蛋白对意大利蜜蜂幼虫直接毒性影响的检查方法相当有难度。
【发明内容】
[0011]本发明的目的是提供一种简单灵敏的检测胃毒性杀虫剂或转基因杀虫蛋白对意大利蜜蜂幼虫潜在毒性的试验方法。
[0012]该方法通过把受试杀虫化合物均匀地混入人工饲料中直接饲喂给意大利蜜蜂幼虫，通过分析意蜂幼虫生命指标评估受试杀虫化合物的潜在毒性，其特征在于，所述人工饲料含有如下组分:蜂王浆45-55重量份，去离子水35-40重量份，果糖6_10重量份，葡萄糖3-5重量份，酵母粉0.8-1.5重量份。
[0013]所述组分优选为:蜂王衆48-52重量份,去尚子水36-38重量份,果糖7_9重量份，葡萄糖3-5重量份，酵母粉0.9-1.2重量份。
[0014]所述组分最好为:蜂王浆50重量份，去离子水37重量份，果糖8重量份，葡萄糖4重量份，酵母粉I重量份。
[0015]所述人工饲料的配置方法优选为:1)称取果糖、葡萄糖和酵母粉置于烧杯A中，蜂王浆置于烧杯B中；2)将去离子水煮沸，待冷却至50°C左右时加入到烧杯A中，充分搅拌溶解；3)将烧杯A中溶液轻轻倒入烧杯B中，搅拌均匀，即为所述人工饲料。
[0016]所述生命指标可以选幼虫生存率、发育历期、老熟幼虫体重、羽化率和新羽化成虫体重中的两种或多种。老熟幼虫体重和新羽化成虫体重为优选评价参数。
[0017]该方法优选以加入大豆胰蛋白酶抑制剂SBTI的人工饲料为阳性对照，以纯人工饲料为空白对照。
[0018]所述阳性对照中大豆胰蛋白酶抑制剂SBTI可以为0.05-0.5%的重量浓度。
[0019]所述阳性对照中大豆胰蛋白酶抑制剂SBTI优选为0.1 %的重量浓度。
[0020]该方法包括如下步骤:
[0021]I)受试幼虫准备；
[0022]2)用移虫针将1.5-2d龄幼虫轻轻转入细胞培养皿的孔穴中，每孔I头幼虫，然后利用移液枪小心地将液态人工饲料加到幼虫周围，使虫体漂浮在饲料上，每天更换饲料；
[0023]3)幼虫排便后(幼虫老熟)，将老熟幼虫用移虫针取出放在吸水纸上，轻轻地翻滚虫体，吸除虫体表面沾有的饲料，称重后转移到新的、孔穴底部垫有滤纸的细胞培养皿中，继续观察，直至羽化；
[0024]4)试验在人工气候箱中进行，温度为34± I°C，无光照，相对湿度70-90%，幼虫阶段的相对湿度高于预蛹至成虫羽化阶段，每个试验处理设多个重复；
[0025]5)实验过程中间隔固定时间观察一次受试蜜蜂，记录幼虫死亡率、发育历期、老熟幼虫体重、成虫羽化率及新羽化成虫体重这些生命参数；
[0026]6)采用合适的生物统计方法比较分析所得生命参数数据，得出试验结论。
[0027]可以参照如下具体方式进行各步骤的操作:
[0028]I)受试幼虫准备:在蜂巢中将蜂王控制在一张空巢脾上产卵24小时后转移蜂王，避免蜂王在该巢脾上继续产卵；
[0029]2)用移虫针将1.5-2d龄幼虫轻轻转入24孔细胞培养皿的孔穴中，每孔I头幼虫，该过程中要避免碰到幼虫体表而伤害幼虫。然后利用移液枪小心地将液态人工饲料，加到幼虫周围，使虫体漂浮在饲料上，避免将人工饲料直接洒到虫体上而使其窒息死亡。饲料每天更换，试验开始第一和第二天每天每头幼虫提供100 μ L饲料，以后每头幼虫每天200 μ L饲料。换饲料时利用真空泵小心将虫体周围剩余的饲料吸干净后加入新的饲料；
[0030]3)当发现虫体周围出现黄色晶体或脂肪体说明幼虫进入排便阶段，幼虫期结束，幼虫老熟，即将进入预蛹期。将老熟幼虫用镊子取出置于吸水纸上，轻轻地翻滚虫体，吸除虫体表面沾有的饲料。称重后转移到新的、孔穴底部垫有滤纸的24孔细胞培养皿中，继续观察，直至羽化。新羽化蜜蜂成虫称重；
[0031]4)试验在人工气候箱中进行，温度为34±1°C，无光照，幼虫阶段的相对湿度为90%，预蛹至成虫羽化的相对湿度为70%，每个试验处理设3-5个重复，每个重复15-24头幼虫。
[0032]5)实验过程中每12小时观察一次受试蜜蜂，记录幼虫死亡率、发育历期、老熟幼虫体重、成虫羽化率及新羽化成虫体重这些生命参数。
[0033]6)所得数据采用生物学统计方法进行分析，比较受试化合物和阳性对照组与空白对照组之间的差异，得出试验结论。
[0034]利用本方法测定了不同浓度SBTI对意蜂幼虫的毒性影响，结果显示意蜂幼虫不同生命参数随SBTI浓度的变化显示出明显的剂量-效应关系，这证明了该方法的有效性和灵敏性。
【专利附图】
【附图说明】
[0035]图1.为一种现有技术(M.A.P.Lima，et al.)所构建的饲喂体系饲喂意蜂幼虫的成活率曲线；
[0036]图2A、2B、2C和2D为利用本发明提供的方法测得的取食含不同浓度SBTI人工饲料的意大利蜜蜂工蜂幼虫的各生命参数。表示处理组与对照组呈显著性差异。
【具体实施方式】
[0037]本发明提供了一种简单灵敏的检测胃毒性杀虫剂或转基因杀虫蛋白对意大利蜜蜂幼虫直接毒性影响的检测方法。该方法通过把受试杀虫化合物均匀地混入人工饲料中直接饲喂给意大利蜜蜂幼虫，并以加入浓度为0.1% (w:w)大豆胰蛋白酶抑制剂SBTI的人工饲料为阳性对照，以纯人工饲料为空白对照，通过比较分析处理组和对照组意蜂幼虫生存率、发育历期、老熟幼虫体重和羽化率等重要生命指标测定受试杀虫化合物对意蜂幼虫的潜在毒性。利用本方法测定了不同浓度SBTI对意蜂幼虫的毒性，结果显示:意蜂幼虫不同生命参数与饲料中SBTI的浓显示出明显的剂量-效应关系，这说明了该方法的有效性和灵敏性。
[0038]I毒性测定体系
[0039]下面说明本发明提供的检测胃毒性杀虫剂或转基因杀虫蛋白对意大利蜜蜂幼虫潜在毒性影响的试验方法的一种具体实施方案。
[0040]1.1意大利蜜蜂幼虫人工饲料制备
[0041]建立检测胃毒性杀虫剂或转基因杀虫蛋白对意大利蜜蜂幼虫潜在毒性影响的试验体系，首先需要一个合适的蜜蜂幼虫人工饲料。本体系采用的蜜蜂幼虫人工饲料为:
[0042]表1.意大利蜜蜂幼虫人工饲料配方
[0043]
I重量(g)
蜂王衆50
去离子水37
D-(+)-果糖 8
D-(+)-葡萄糖~4
WHI
[0044]蜂王浆购置于北京金蜂王蜜蜂产品研究所；果糖和葡糖糖为美国Sigma公司产品；酵母粉为英国Oxoid公司。
[0045]配置方法:1)称取果糖、葡萄糖和酵母置于烧杯A中，蜂王浆置于烧杯B中；2)将去离子水煮沸，待冷却至50°C左右时加入到烧杯A中，充分搅拌溶解；3)将烧杯A中溶液轻轻倒入烧杯B中，搅拌均匀，分装后置于-20 V冰箱保存。
[0046]1.2试验处理设置
[0047]试验一般设三个饲料处理:
[0048]I)纯人工饲料(空白对照)。饲料不加任何其它化合物；
[0049]2)均匀混入受试杀虫化合物的人工饲料；如果受试化合物为转基因杀虫蛋白，浓度一般要求高于转基因植物组织中杀虫蛋白最高表达量的10倍以上；
[0050]3)混入大豆胰蛋白酶抑制剂SBTI (0.1% w:w)的人工饲料。
[0051]为了把受试化合物均匀混入人工饲料，可在配置饲料的第2步，当去离子水温度降至50°C左右时把受试物溶入去离子水。如果需要助溶剂，必须保证该含助溶剂的溶液对意大利蜜蜂幼虫没有显著影响，且要在对照饲料中加入等量该溶液。
[0052]1.3试验操作与观察
[0053]实验具体操作如下:
[0054]I)受试幼虫准备:在蜂巢中将蜂王控制在一张空巢脾上产卵24小时后转移蜂王，避免蜂王在该巢脾上继续产卵；
[0055]2)用移虫针将1.5-2d龄幼虫轻轻转入24孔细胞培养皿的孔穴中，每孔I头幼虫，该过程中要避免碰到幼虫体表而伤害幼虫。然后利用移液枪小心地将液态人工饲料，加到幼虫周围，使虫体漂浮在饲料上，避免将人工饲料直接洒到虫体上而使其窒息死亡。饲料每天更换，试验开始第一和第二天每天每头幼虫提供100 μ L饲料，以后每头幼虫每天200 μ L饲料。换饲料时利用真空泵小心将虫体周围剩余的饲料吸干净后加入新的饲料；
[0056]3)当发现虫体周围出现黄色晶体或脂肪体说明幼虫进入排便阶段，幼虫期结束，幼虫老熟，即将进入预蛹期。将老熟幼虫用镊子取出置于吸水纸上，轻轻地翻滚虫体，吸除虫体表面沾有的饲料。称重后转移到新的、孔穴底部垫有滤纸的24孔细胞培养皿中，继续观察，直至羽化。新羽化蜜蜂成虫称重；
[0057]4)试验在人工气候箱中进行，温度为34±1°C，无光照，幼虫阶段的相对湿度为90%，预蛹至成虫羽化的相对湿度为70%，每个试验处理设3-5个重复，每个重复15-24头幼虫。
[0058]5)实验过程中每12小时观察一次受试蜜蜂，记录幼虫死亡率、发育历期、老熟幼虫体重、成虫羽化率及新羽化成虫体重这些生命参数。
[0059]6)所得数据采用生物学统计方法进行分析，比较受试化合物和阳性对照组与空白对照组之间的差异，得出试验结论。
[0060]2毒性测定体系的有效性验证
[0061]以已知对蜜蜂幼虫有毒的大豆胰蛋白酶抑制剂SBTI为标准化合物验证所提供蜜蜂幼虫毒性测定体系的有效性和灵敏性。把SBTI按以下浓度均匀加入人工饲料中:0，
0.01%，0.1%。以纯人工饲料为空白对照。每个处理设3个重复，每个重复24头幼虫。按照上述方法饲喂意大利蜜蜂工蜂幼虫，研究不同浓度SBTI对意蜂工蜂幼虫生命参数的影响。
[0062]实验结果显示:意大利蜜蜂工蜂幼虫存活率、成虫羽化率、幼虫发育历期及老熟幼虫体重等参数均存在相似的剂量反应(如图2A、2B、2C和2D所示)。其中，取食对照组饲料的蜜蜂幼虫羽化率在90%以上，优于目前国际上报道的蜜蜂幼虫人工饲料配方。说明所采用的蜜蜂幼虫人工饲料可以满足蜜蜂幼虫的正常生长发育，并适合用于该毒性测定试验(在该类试验中，对照组受试生物死亡率一般要求〈20% )。随SBTI浓度的升高，存活率逐渐下降。SBTI浓度为0.01%与0.1%时羽化率明显下降。取食含有SBTI饲料的2个处理组幼虫发育历期与对照组相比均显著延长(P〈0.001)。该试验结果说明本发明所提供的蜜蜂幼虫毒性测定体系可以有效地检测不同胃毒杀虫剂或转基因杀虫蛋白对意大利蜜蜂工蜂幼虫的潜在毒性。
【权利要求】
1.胃毒性杀虫剂或转基因杀虫蛋白对意大利蜜蜂幼虫潜在毒性的检测方法，该方法通过把受试杀虫化合物均匀地混入人工饲料中直接饲喂给意大利蜜蜂幼虫，通过分析意蜂幼虫生命指标评估受试杀虫化合物的潜在毒性，其特征在于，所述人工饲料含有如下组分:蜂王浆45-55重量份，去离子水35-40重量份，果糖6_10重量份，葡萄糖3_5重量份，酵母粉0.8-1.5重量份。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述组分为:蜂王浆48-52重量份，去离子水36-38重量份，果糖7-9重量份，葡萄糖3-5重量份，酵母粉0.9-1.2重量份。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述组分为:蜂王浆50重量份，去离子水37重量份，果糖8重量份，葡萄糖4重量份，酵母粉I重量份。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述人工饲料的配置方法为:1)称取果糖、葡萄糖和酵母粉置于烧杯A中，蜂王浆置于烧杯B中；2)将去离子水煮沸，待冷却至48-52°C左右时加入到烧杯A中，充分搅拌溶解；3)将烧杯A中溶液轻轻倒入烧杯B中，搅拌均匀，即为所述人工饲料。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生命指标可选幼虫生存率、发育历期、老熟幼虫体重、羽化率和新羽化成虫体重中的一种或多种。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法以加入大豆胰蛋白酶抑制剂SBTI的人工饲料为阳性对照，以纯人工饲料为空白对照。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述阳性对照中大豆胰蛋白酶抑制剂SBTI为0.05-0.5%的重量浓度。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述阳性对照中大豆胰蛋白酶抑制剂SBTI为0.1 %的重量浓度。
9.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤: 1)受试幼虫准备； 2)用移虫针将1.5-2d龄幼虫轻轻转入细胞培养皿的孔穴中，每孔I头幼虫，然后利用移液枪小心地将液态人工饲料加到幼虫周围，使虫体漂浮在饲料上，每天更换饲料； 3)幼虫排便后(幼虫老熟)，将老熟幼虫用移虫针取出放在吸水纸上，轻轻地翻滚虫体，吸除虫体表面沾有的饲料，称重后转移到新的、孔穴底部垫有滤纸的细胞培养皿中，继续观察，直至羽化； 4)试验在人工气候箱中进行，温度为34±1°C，无光照，相对湿度70-90%，幼虫阶段的相对湿度高于预蛹至成虫羽化阶段，每个试验处理设多个重复； 5)实验过程中间隔固定时间观察一次受试蜜蜂，记录幼虫死亡率、发育历期、老熟幼虫体重、成虫羽化率及新羽化成虫体重这些生命参数； 6)采用合适的生物统计方法比较分析所得生命参数数据，得出试验结论。
【文档编号】G01N33/48GK104198688SQ201410450031
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年9月4日 优先权日:2014年9月4日
【发明者】李云河, 王园园, 彭于发 申请人:中国农业科学院植物保护研究所