一种快速判定植株光强和温度适应范围的方法及其装置制造方法
【专利摘要】本发明公开了一种快速判定植株光强和温度适应范围的方法，此方法主要基于离体叶片经不同温度和及光强的处理，随后经过一定时间的暗恢复，期间动态监测叶片Fv/Fm荧光参数值，通过绘制处理条件下的Fv/Fm荧光动力学曲线及分析样本处理后Fv/Fm的下降比值与恢复后Fv/Fm的上升比值确定植株植株不可逆光损伤的温度范围。本发明不破坏植物生长，便于在不同温度和光照条件下平行的检测植株叶片光损伤及恢复的状况，进而确定植株光强和温度适应范围并判断不同植株抗性差异。本发明还公开了一种实现快速判定植株光强和温度适应范围的方法的装置，通过改变光源与样品间距离实现光照强度的控制，可以实现对光照强度的连续的控制且在光强改变的同时保证光质恒定不变。
【专利说明】一种快速判定植株光强和温度适应范围的方法及其装置
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种快速判定植株光强和温度适应范围的方法及其装置，具体涉及一 种基于叶绿素荧光（Fv/Fm)参数测定的判定植株的极端光强和温度的方法，属于植物环境 胁迫【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 植物的生长发育依赖于外界的光照、温度、水分和土壤等条件。然而相较于水分和 土壤的因素，植物的叶片对光照和温度的反应是最直接且敏感的。光照是植物光反应过程 中的能量的来源，开启植物的光合作用的过程。温度决定光和反应过程中相关酶的活性，是 暗反应过程中的主要限制因子。适宜的温度和光强有利于维持光合作用中光反应与暗反应 动态平衡，确保植株正常生理活动。光照强度存在明显是时间和空间的异质性，表现为正午 时光照强度达到最高值而在早晨和傍晚光照强度较低，同时林分不同冠层的光照强度存在 明显的差异，顶层的光照强度最强而林下光照强度最弱。温度的分布同样存在明显的时空 变化，夏季中午的气温达到最大值，同时纬度和海拔与温度存在显著的相关性，高纬度高海 拔地区温度明显低于其他地区。不同地区的植株因长期适应于一定光照和温度的生境，植 株呈现不同程度光强和温度的适应性。因此，在植株的栽培管理的过程中，了解植株的温度 及光强的适应范围，有利于了解植株的推广和栽培的范围及相关栽培措施的制定。
[0003] 近年来随着温室效应的加剧，已造成全球温度的升高和异常温度的频发。春季和 夏季异常的高温以及冬季和春季的异常低温，势必造成植株的光抑制；严重胁迫下便会引 起植株的光损伤并出现叶片失绿枯黄的现象。因此去顶植株的光强和温度的适应范围，有 利于在极端环境条件出现时，制定和采取相关的措施，维持植株的正常生长。
[0004] 前人在研究植物温度和光强的适应性时，多采用将植株置于自然条件或人工的条 件下，进行温度和光照的处理，处理的过程中测定相关的指标及参数，其中包括：显微及超 微结构，电导率，半致死温度等参数。在自然的条件下，不能进行温度和光强参数的控制，所 以仅能对不同植株在胁迫条件下适应性的差异的比较。在人工气候室中，通过对于温度和 光强参数的设定，实现植物在不同胁迫条件下适应性差异的比较。然而人工控制光照和温 度，通常需要在人工气候室内进行。但是人工气候室搭建的造价较高，因此很难实现在不同 温度和光照的条件下进行多组的平行实验。在人工的条件下，温度的精准控制往往是较易 的，但是很难实现对光强的精准控制。主要由以下几点原因 ：1)人工气候室内的光源一般 为点光源，因此距离光源不同位置的光照强度存在显著的变化；2)由于植株树度随冠结构 及叶片朝向的差异，很难保证每片叶子所接受的光强一致。因此，在同一处理条件下，胁迫 处理的相关指标在各个样本内存在较大的差异。显然上述的研究方法需要对大量的盆栽样 本进行平行的胁迫处理，实验的周期较长；同时胁迫的条件下植株的生长遭受严重影响，实 验过程中采用的设备造价高，难以大规模的推广。尤其在初步确定某些珍贵稀有的品种的 推广范围的过程中，采用一种基于大范围准确控制离体叶片环境参数，模拟一天过程中叶 片光胁迫及暗恢复过程，通过不同时间荧光参数测定，进而推断植株光强和温度的适应范 围。
[0005] 植物在胁迫的条件下，光系统II(PSII)是整个光合作用过程中最为敏感的部 分。叶绿素荧光参数是一组用于描述植物光合作用机理和光合生理状况的变量或常数 值，被视为是研究植物光合作用与环境关系的内在探针，是反应中心PSII的生物学功能 的重要参数，其中包括：1)初始突光（minimal fluorescence, Ftl),是光系统II (PSII)反 应中心初一完全开放时的荧光产量，与叶片叶绿素浓度有关；2)最大荧光产量（maximal fluorescence，F m)，是PSII反应中心处于完全关闭时的荧光产量。可反映通过PSII的电子 传递情况；3)可变突光（variable fluorescence, Fv = Fm-Ftl)反映了 Qa的还原情况。4)PSII 最大光化学量子产量（optimal/maximal photochemical efficiency of PSII in dark ;Fv/ Fm)，反映 PSII反应中心内光能转换效率（intrinsic PSII efficiency)。在适宜的条件下， 叶片的Fv/Fm参数仅与植株的种类及叶龄有关，同时离体叶片处于适宜条件下，叶片F v/FmS 数值在短时间内并不会出现明显的变化；然而叶片置于胁迫的状态下，PSII反应中心部分 失活，Fv/F mS数值呈现显著的下降。然而，非生物胁迫对于光合机构的影响不仅包括其对 光合机构的伤害程度，还包括逆境消除后光系统活性的恢复情况，其中以光抑制后PSII反 应中心恢复的研究最为广泛。胁迫处理后，经过一定时间的恢复，失活的PSII反应中心结 合新生的Dl蛋白，PSII的活性恢复，同时F v/Fm参数恢复至初始值（胁迫前）；当胁迫条件 超出阈值，胁迫产生的活性氧破坏Dl蛋白的转录因子，导致Dl蛋白合成受阻，PSII的活性 不能恢复，F v/Fm参数显著低于初始值（胁迫前）。植株长时间生长于上述的环境中，必然造 成光合机构的破坏，植株生长不良甚至死亡的现象。
[0006] 因此，在人工控制光照和温度的条件下，同过Fv/Fm参数的测定，发明一种简便、 快速、有效、经济的测定方法，在不损害植物生长的条件下研究植株对温度和光强的适应范 围，对植株分布和推广范围的确定及相关栽培措施的制定具有重大的理论意义和现实意 义；同时通过比较不同植株在同一胁迫处理的条件下，PSII的失活及恢复的程度来比较不 同植株之间抗性的差异，为优良品种选育奠定基础。
【发明内容】
[0007] 为解决现有技术的不足，本发明的目的在于，提供一种不破坏植物生长、便于在不 同温度和光照条件下平行的检测植株叶片光损伤及恢复的状况，进而确定植株光强和温度 适应范围并判断不同植株抗性差异的方法。
[0008] 本发明的技术方案为：一种快速判定植株光强和温度适应范围的方法，其特征是， 包括如下的步骤：
[0009] (1)待测样品的采集：选择正常生长植株上的幼龄叶片，用打孔器截取大小一致 的叶圆片；
[0010] (2)植株叶片的处理：将待测的叶圆片置于精确控制光照强度的水浴锅的网格载 物板上，经过不同光照和温度的胁迫处理后，在常温和黑暗的条件下进行暗恢复；
[0011] (3)荧光参数的测定：在胁迫处理和暗恢复的不同的时间点，取出叶圆片，采用 FMS-2便携脉冲调试式荧光仪测定叶圆片暗适应后的荧光参数初始荧光Ftl和最大荧光产量 Fm，并绘制荧光动力学曲线；
[0012] (4)光照及温度适应范围的确定：利用公SFV/Fm = (Fm-Ftl)/Fm，在不同温度和光照 条件下，比较处理前至处理后Fv/Fm的下降比值与处理后至恢复后Fv/Fm的上升比值，如果 这两个值之间存在显著的差异，则在上述的条件下植株遭受的光损伤不能在暗适应的条件 下恢复，则确定此温度和光强值超出植株的适应范围。
[0013] 进一步地，上述步骤（1)中，截取待测植株的叶圆片后，将叶原片放入避光盒4°C 保存，待测。
[0014] 进一步地，上述步骤（2)中，胁迫处理和暗恢复的过程中，样品置于湿纱布上。
[0015] 进一步地，上述步骤（2)中，温度和光照胁迫时间是根据一天中强光和极端温度 胁迫的时间来设定的，暗恢复的时间是根据夜晚的时长设定的。
[0016] 本发明还提供了一种实现快速判定植株光强和温度适应范围的方法的装置，包括 水浴锅体，其特征是，所述水浴锅体的上方设有调节和固定光源的立柱，所述立柱上设有沿 立柱上、下移动的灯箱，所述灯箱的下方设有可更换的光源，所述光源与设置在灯箱内部的 光源电路相连接。
[0017] 进一步地，所述水浴锅体的槽体内设有可拆卸的网格载物板，在所述网格载物板 的水平面上设有光强传感器，所述光强传感器与光强显示装置相连接。
[0018] 进一步地，在所述网格载物板的水平面上还设有温度传感器，所述温度传感器与 温度调控显示装置相连接。
[0019] 进一步地，所述立柱的水平截面与所述灯箱的水平截面相嵌合，所述立柱与所述 灯箱的结合面设有多个小孔，所述小孔内设有与小孔相配合的紧固件，所述紧固件为T型 支架、螺钉或螺栓。
[0020] 进一步地，所述水浴锅体的外部设有实时显示样品处理温度及光强的数值的温度 显示屏和光强显示屏。
[0021] 进一步地，所述光源为LED灯、钠灯或卤素灯。
[0022] 本发明所达到的有益效果：
[0023] 1.本发明选取离体植物的叶片进行不同光强和温度的处理及暗适应的过程，来模 拟植株在一天的时间内光损伤和光恢复的情况；通过测定处理前、处理后和暗适应后测定 叶片的荧光参数并计算Fv/Fm值，比较处理后和处理前荧光Fv/Fm下降的百分率与暗恢复 后和处理后荧光参数Fv/Fm恢复的百分率的差异，来判断叶片在相应的胁迫条件下，PSII 的损伤是否可以在一定的暗适应后完成恢复，从而提供一种不破坏植物生长的、大范围快 速判定植株光强和温度适应范围的方法。通过此种方法确定植株遭受光损伤的光强和温度 的范围，有利于植株抗性的比较，栽植区域的确定及异常条件下栽培措施的制定。
[0024] 2.实现本发明判定方法的装置中，灯箱可以沿着立柱上、下移动，根据数显的光 强，通过调节光源与网格载物板的距离，精确的控制位于网格载物板上样品的光强。通过改 变光源与样品间距离实现光照强度的控制，可以实现对光照强度的连续的控制且在光强改 变的同时保证光质（光的波长）恒定不变。
【专利附图】
【附图说明】
[0025] 图1是本发明的结构示意图；
[0026] 图2是灯箱自下而上的仰视图；
[0027] 图3是本发明位于宽边1/2处的截面图；
[0028] 图4为4月份不同温度及光照条件下黄叶及绿叶银杏的叶绿素荧光（Fv/F m)动力 学曲线；
[0029] 图5为7月份不同温度及光照条件下黄叶及绿叶银杏的叶绿素荧光（Fv/F m)
[0030] 动力学曲线。
[0031] 图中各附图标记的含义为：
[0032] 1.水浴锅体 2.立柱
[0033] 3.灯箱 4.网格载物板
[0034] 5.光强传感器 6.温度液晶显不屏
[0035] 7.光强液晶显示屏 8.小孔
[0036] 9.光源电路 10.光源
[0037] 11.水浴介质 12.温度调控显示装置
[0038] 13.光强显示装置 14.温度传感器
【具体实施方式】
[0039] 下面结合附图对本发明作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明 的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
[0040] 一种快速判定植株光强和温度适应范围的方法，包括如下的步骤：
[0041] (1)待测样品的采集：
[0042] 分别于4月份和7月份两个时期，采集黄叶及绿叶银杏健康植株上幼龄叶片，采用 打孔器在每个叶片上截取直径为Icm的叶圆片，置于避光盒中4°C保存。
[0043] (2)待测样品处理条件和时间的选择：
[0044] 根据4月份和7月份两个时期银杏栽植地（南京）的月均温和极端温度的值，设 置分别以下的四个温度梯度：26°C，28°C，30°C和32°C (4月份）；36°C，38°C，40°C和42°C (7 月份）。
[0045] 根据林分各层光照强度的差异，设置以下三个光照强度，分别为ISOOymol m 2S \ 1200 μ mol m 2S 1 和 600 μ mol m 2S 1O
[0046] 考虑到光照与温度的交互作用，在4月份和7月份分别设置12个处理。
[0047] 根据一天之内高温和强光胁迫的时间，选择处理为4h。
[0048] 基于相同时期夜晚的平均温度值，设置4月份和7月份暗恢复的温度分别为20°C 和30°C ;同时结合昼夜的时长，选择暗适应的时间为12h。
[0049] (3)待测样品的处理及荧光参数的测定
[0050] 在4月份和7月份两个时期，于实验开始前分别选取黄叶和绿叶银杏的叶片10 片，测定叶片暗适应后的Fv/Fm值。
[0051] 实现待测样品不同处理条件的装置如图1至图3所示，精确控制光照强度的水浴 锅，包括水浴锅体1，所述水浴锅体1的上方设有调节和固定光源10的立柱2,所述立柱2 上设有沿立柱2上、下移动的灯箱3,水浴锅体1的四角连接立柱2的下端，立柱2用于调节 及固定灯箱3的位置。所述灯箱3的下方设有可更换的光源10,所述光源10为LED灯、钠 灯或卤素灯，可以根据具体实验的要求进行更换。所述光源10与设置在灯箱3内部的光源 电路9相连接。
[0052] 所述立柱2的水平截面与所述灯箱3的水平截面相嵌合，所述立柱2与所述灯箱 3的结合面设有多个小孔8,所述小孔8为方形、圆形或椭圆形，通过在小孔8内插入与小孔 8相配合的紧固件，实现对灯箱的固定，所述紧固件为T型支架、螺钉或螺栓。
[0053] 所述水浴锅体1的槽体内设有可拆卸的网格载物板4,网格空隙的大小可以调节， 从而满足不同样本的需求；在所述网格载物板4的水平面上设有光强传感器5,所述光强传 感器5与光强显示装置13相连接，显示网格载物板4处的实时光强。
[0054] 在所述网格载物板4的水平面上还设有温度传感器14,所述温度传感器14与温度 调控显示装置12相连接，控制槽体内的水浴介质11的温度。
[0055] 所述水浴锅体1的外部设有温度显示屏6和光强显示屏7,实时显示样品处理温度 及光强的数值。
[0056] 在装置运行过程中，水浴锅的槽体内填装水浴介质11，填装的的位置与网格载物 板4的上缘平齐，这样可以防止置于网格载物板4上的样品（特别是生物样品）脱水失活。
[0057] 待测样品不同的处理条件分别通过如下的方式实现：
[0058] 1)通过水浴锅体1的温度调控显示装置12控制水浴温度；
[0059] 2)通过调节支架2上灯箱3至网格载物板4的距离结合光强显示装置13确定光 强参数；
[0060] 3)立柱2与灯箱3的结合面设有小孔8,可通过插入T字形支架来实现灯箱3的 固定。
[0061] 之后分别取黄叶及绿叶银杏叶圆片各40片在设定有不同温度和光强水浴锅（12 个处理）的网格载物板4上，放置4h。
[0062] 在处理的过程中，分别于lh，2h，3h和4h取出10片叶圆片，测定叶片暗适应20分 钟后的^/^值，前3次测定后，将测定过的叶圆片丢弃，最后一次测定后将叶圆片置于湿纱 布中，分别于20°C (4月份）和30°C (7月份）黑暗的条件下进行暗适应。
[0063] 在暗适应的过程中，分别于2h，4h，6h和12h，测定叶片的Fv/F m值。
[0064] 以测定时间为X轴，Fv/Fm值为Y轴分别绘制4月份和7月份黄叶及绿叶银杏的F v/ Fm荧光参数的动力学曲线，结果详见图4和图5。
[0065] 由图4和图5所示：在同一温度条件下，随着处理温度的升高，黄叶及绿叶^/^值 的下降幅度逐渐增加；在同一温度的条件下，随着光强的升高，Fv/Fm值的下降幅度也逐渐 的增加。在较低的光强和温度胁迫4h后，植株Fv/Fm值可以通过12h暗适应恢复至初始值。 在较高的光强和温度胁迫4h后，F v/Fm值不可以通过12h暗适应恢复至初始值。相较于绿 叶银杏，黄叶银杏在较低的光照和温度的胁迫下，即遭受不可恢复的光抑制。
[0066] (4)光照及温度适应范围的确定
[0067] 选取实验过程中三个重要时间点的Fv/Fm值：处理前F v/Fm((lh)，处理4h后Fv/Fm(4h) 和恢复12h后Fv/Fm(16h)。计算处理4h后Fv/Fm的下降比例（P d)与恢复12h后Fv/Fm的上升 比例（Pk)，
[0068] Pd = (Fv/Fm (Oh) _Fv/Fm(4h))/Fv/Fm (Oh)
[0069] Pr= (Fv/Fm(16h)-Fv/Fm(4h))/F v/Fm(0h)
[0070] 具体的计算结果参见表1。
[0071] 表1黄叶及绿叶银杏叶片不同处理4h后Fv/Fm的下降比例（P d)
[0072] 与恢复12h后Fv/Fm的上升比例（Pk)
[00731
[0074
【权利要求】
1. 一种快速判定植株光强和温度适应范围的方法，其特征是，包括如下的步骤： (1) 待测样品的采集：选择正常生长植株上的幼龄叶片，用打孔器截取大小一致的叶圆 片； (2) 植株叶片的处理：将待测的叶圆片置于精确控制光照强度的水浴锅的网格载物板 上，经过不同光照和温度的胁迫处理后，在常温和黑暗的条件下进行暗恢复； (3) 荧光参数的测定：在胁迫处理和暗恢复的不同的时间点，取出叶圆片，采用FMS-2 便携脉冲调试式荧光仪测定叶圆片暗适应后的荧光参数初始荧光匕和最大荧光产量F m，并 绘制荧光动力学曲线； (4) 光照及温度适应范围的确定：利用公式Fv/Fm=也-匕)/Fm，在不同温度和光照条件 下，比较处理前至处理后F v/Fm的下降比值与处理后至恢复后Fv/Fm的上升比值，如果这两 个值之间存在显著的差异，则在上述的条件下植株遭受的光损伤不能在暗适应的条件下恢 复，则确定此温度和光强值超出植株的适应范围。
2. 根据权利要求1所述的一种快速判定植株光强和温度适应范围的方法，其特征是， 上述步骤（1)中，截取待测植株的叶圆片后，将叶原片放入避光盒4°C保存，待测。
3. 根据权利要求1所述的一种快速判定植株光强和温度适应范围的方法，其特征是， 上述步骤（2)中，胁迫处理和暗恢复的过程中，样品置于湿纱布上。
4. 根据权利要求1所述的一种快速判定植株光强和温度适应范围的方法，其特征是， 上述步骤（2)中，温度和光照胁迫时间是根据一天中强光和极端温度胁迫的时间来设定的， 暗恢复的时间是根据夜晚的时长设定的。
5. -种实现权利要求1-4中任意一项所述快速判定植株光强和温度适应范围的方法 的装置，包括水浴锅体，其特征是，所述水浴锅体的上方设有调节和固定光源的立柱，所述 立柱上设有沿立柱上、下移动的灯箱，所述灯箱的下方设有可更换的光源，所述光源与设置 在灯箱内部的光源电路相连接。
6. 根据权利要求5所述的一种实现快速判定植株光强和温度适应范围的方法的装置， 其特征是，所述水浴锅体的槽体内设有可拆卸的网格载物板，在所述网格载物板的水平面 上设有光强传感器，所述光强传感器与光强显示装置相连接。
7. 根据权利要求6所述的一种实现快速判定植株光强和温度适应范围的方法的装置， 其特征是，在所述网格载物板的水平面上还设有温度传感器，所述温度传感器与温度调控 显示装置相连接。
8. 根据权利要求5所述的一种实现快速判定植株光强和温度适应范围的方法的装置， 其特征是，所述立柱的水平截面与所述灯箱的水平截面相嵌合，所述立柱与所述灯箱的结 合面设有多个小孔，所述小孔内设有与小孔相配合的紧固件，所述紧固件为T型支架、螺钉 或螺栓。
9. 根据权利要求5所述的一种实现快速判定植株光强和温度适应范围的方法的装 置，其特征是，所述水浴锅体的外部设有实时显示样品处理温度及光强的数值的温度显示 屏和光强显示屏。
10. 根据权利要求5所述的一种实现快速判定植株光强和温度适应范围的方法的装 置，其特征是，所述光源为LED灯、钠灯或卤素灯。
【文档编号】G01N21/64GK104237191SQ201410528099
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年10月9日 优先权日:2014年10月9日
【发明者】曹福亮, 王欢利, 郁万文, 张往祥, 汪贵斌, 刘新亮 申请人:南京林业大学