使用10-去氧碳代荧光素二乙酰脂红色荧光检测细胞活性的方法
【专利摘要】本发明公开了一种使用10-去氧碳代荧光素二乙酰脂检测细胞活性的方法。它是将10-去氧碳代荧光素二乙酰脂的二甲基亚砜或乙醇溶液加杜氏磷酸缓冲液得到10-去氧碳代荧光素二乙酰脂工作溶液；向细胞样品中加入10-去氧碳代荧光素二乙酰脂工作溶液，在37oC,5%CO2细胞培养箱中培养30-60分钟；观测步骤所获得的细胞的红色荧光；与现存荧光素二乙酰脂荧光探针相比较，本发明使用具有更长的激发和发射波长的10-去氧碳代荧光素二乙酰脂荧光探针检测细胞活性，因此可以避免活细胞自身荧光干扰。本方法在细胞活性、细胞毒性检测中用途广泛。
【专利说明】使用?ο-去氧碳代荧光素二乙酰脂红色荧光检测细胞活性 的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物检测【技术领域】，具体涉及一种检测细胞活性的荧光分析方法。
【背景技术】
[0002] 药物、环境污染、温度、离子应激、放射污染或其他生物调节和潜在的不利因素都 会对细胞或机体组织产生损害。细胞活性、细胞毒性测定在评价细胞或组织因上述原因导 致的细胞改变时非常重要，细胞膜的完整性被广泛的用于细胞活性测定，保护细胞的细胞 膜的丢失导致细胞结构、胞浆物质、细胞离子梯度和膜电位等的丧失，细胞膜完整性的丢失 将不可避免的导致细胞死亡。
[0003] 在细胞膜完整性和细胞活性之间没有等价的量化关系，一般情况下把拥有完整细 胞膜的细胞归为"活细胞"，而把因有毒的细胞试剂导致的细胞膜不可逆损伤的细胞归为 "死细胞"。当然有些细胞在死去的过程中还拥有细胞膜，这些是"将死细胞"，"将死细胞"实 际上不是活细胞，它们不能继续被培养和传代，但是按照通常依赖于观测细胞膜的方法经 常把"将死细胞"计为活细胞。
[0004] 细胞膜失去完整性的一个共同特征是其允许极性小分子(分子量小于2000道尔 顿)进出细胞质。细胞膜通透性的改变是很多细胞活性、细胞毒性评价方法的基础。最常用 的用于检测细胞活性/细胞毒性的方法是放射性的铬 51 (51Cr)释放和非荧光的台盼蓝有色 染料排出。荧光染料比普通有色染料有更高的检测灵敏度，也不需要如放射性元素那样要 求有复杂的材料处理过程。可是，现存的荧光素二乙酰脂荧光探针激发和发射波长都很短， 容易受到细胞背景荧光干扰。例如，由于GFP (绿色荧光蛋白）的发射光谱与荧光素的发射 光谱完全重叠，现存的荧光素二乙酰脂荧光探针不可能被用于测定GFP细胞的活性。由于 它们具有长波长发射，本发明的10-去氧碳代荧光素二乙酰脂荧光探针可被用于检测 GFp 细胞的活性。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种简便快速检测细胞活性的方法。 本发明的技术方案概述如下。一种检测细胞活性的方法，包括如下步骤： a) 分别将10-去氧碳代荧光素二乙酰脂(结构式的二甲基亚砜或乙醇溶液 加入杜氏磷酸缓冲液得到10-去氧碳代荧光素二乙酰脂工作溶液（1_1〇 μΜ); b) 向细胞样品中加入10-印卜^的10-去氧碳代荧光素二乙酰脂工作溶液，在37Τ， 5%C0 2培养箱中培养30-60分钟； c) 观测步骤b)所获得的细胞的红色荧光； 所述10-去氧碳代荧光素二乙酰脂的结构式（1)为： Ri 和 R2 分别是 H、COOH 或 COOCH2OAc。
【权利要求】
1. 一种使用10-去氧碳代荧光素二乙酰脂检测细胞活性的方法，其特征包括如下步 骤： a) 将10-去氧碳代荧光素二乙酰脂的二甲基亚砜或乙醇溶液加杜氏磷酸缓冲液得到 10-去氧碳代荧光素二乙酰脂工作溶液（I); b) 向细胞样品中加入10-去氧碳代荧光素二乙酰脂工作溶液，在37°C，5%C02细胞培 养箱中培养30-60分钟； c) 观测步骤b)所获得的细胞的红色荧光； 所述10-去氧碳代荧光素二乙酰脂（I)的结构式为：
札和R2分别是H、COOH或COOCH2OAc。
2. 权利要求1所述使用10-去氧碳代荧光素二乙酰脂检测细胞活性的方法，其特征 是步骤a)所述细胞样品中细胞的浓度为100-50000个细胞/100uL，优选细胞的浓度为 30000-50000 个细胞/100uL。
3. 权利要求1所述使用10-去氧碳代荧光素二乙酰脂检测细胞活性的方法，其特征是 步骤a)所述细胞为哺乳动物细胞。
4. 权利要求1所述使用10-去氧碳代荧光素二乙酰脂检测细胞活性的方法，其特征是 所述?ο-去氧碳代荧光素二乙酰脂（I)工作溶液的浓度为ο. ι-ιοομΜ。
5. 权利要求1所述使用10-去氧碳代荧光素二乙酰脂检测细胞活性的方法，其特征是 所述杜氏磷酸缓冲液的ρΗ=7. 2。
6. 权利要求1所述使用10-去氧碳代荧光素二乙酰脂检测细胞活性的方法，其特征是 步骤c)所述观测的仪器为荧光显微镜。
7. 权利要求1所述使用10-去氧碳代荧光素二乙酰脂检测细胞活性的方法，其特征是 步骤c)所述观测的仪器为荧光酶标仪。
【文档编号】G01N21/64GK104297223SQ201410565804
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年10月22日 优先权日:2014年10月22日
【发明者】赵沁, 彭若谷, 第五晓东, 伍谊波, 第五振军, 廖劲芳 申请人:天津百萤生物科技有限公司