本发明涉及一种对仪器(具体地，用于对颗粒进行光学检测或分析的仪器)进行校准的方法，涉及一种通过该方法进行校准的仪器，并且涉及一种对在样品中的颗粒浓度(以每单位体积的颗粒数量为单位)进行估计的方法。
发明背景
本发明具体地与用于执行纳米颗粒跟踪分析(“NTA”)的设备和方法有关。
纳米颗粒跟踪分析是一种相对近期所研发出的用于对液体中纳米颗粒的直接和实时可视化及分析的方法(参见例如WO03/093801)。基于激光照射的显微镜技术，通过例如电荷耦合器件(CCD)照相机等对纳米颗粒的布朗运动进行实时分析，每个单独的颗粒同时地但单独地由专用颗粒跟踪图像分析程序进行可视化以及跟踪。NTA同时测量颗粒尺寸及颗粒散射亮度的能力允许能够分辨异质颗粒混合物，并且重要地是颗粒浓度能够被直接估计，NTA获得的颗粒尺寸分布曲线为直接数字/频率分布。
NTA已成为行内术语，被相关领域技术人员认可。有超过900篇提及使用NTA收集的数据的科学论文及演示文稿。此外，该术语还被例如ASTM国际组织(以前的美国材料试验协会)、环境保护局(EPA)、食品及药物管理局(FDA)及NIH使用。
NTA能够分析的颗粒尺寸范围取决于颗粒类型。考虑到每个颗粒必须散射足够的光以使其能够如上面所描述的被检测及跟踪，较低的尺寸限制由颗粒尺寸及颗粒折射率定义。对于具有非常高折射率的颗粒(诸如胶体金)，尺寸的精确确定可以实现在最大尺寸低至约10nm的颗粒上。对于较低折射率颗粒(诸如生物起源地的那些)，最小可检测尺寸可以在25-50nm的范围内。相应地，NTA受到其检测低于一定尺寸的粒子的能力的限制。
对于NTA，颗粒的存在及分析中的每一项都散射出足够单独检测到的光，即使面对包括例如非常小的颗粒总体(诸如蛋白质分子、低于10nm的无机物质、高分子溶液、纳米乳剂等)的‘背景’物质也仍然可以执行，每个颗粒都小到无法单独检测却以足够高的浓度存在以集体形成一种散射光的背景薄雾。NTA无法分析此背景但是NTA可以分析在此背景中作为嵌入其中的离散光散射实体的可见颗粒。当然，此背景的强度将确定就最小可检测尺寸而言NTA的灵敏度限制。此外，NTA能够标识、跟踪并分析适当尺寸的颗粒，即使是在它们存在于包含少数较大颗粒的异质样品中时。
通过使用适当的荧光激发光源及合适的荧光滤波器，NTA能够进一步在非荧光背景存在时检测并分析固有荧光或贴上荧光标签的纳米颗粒。NTA能够进一步使用多个滤波器或一个彩色照相机来在样品内测量多于一个荧光波长。
通过NTA来确定单独纳米颗粒的尺寸是基于对由悬浮在液体中的微米与亚微米颗粒在受到合适的光源(例如激光器)照亮时所展现的布朗运动的分析，从而使得引起部分由颗粒所散射的光由摄像机(通常是CCD、电子倍增CCD【EMCCD】、科学互补金属氧化物半导体【sCMOS】)进行成像的显微镜安排对颗粒散射的光进行检测。
由任何给定的颗粒以已知的时间间隔(例如照相机的帧速率的倒数，通常每秒30帧)移动的平均距离通过斯托克斯爱因斯坦方程而相关，其中如果周围液体的温度和粘度是已知的，则扩散系数可被外推至颗粒流体动力直径。
由照相机询问的激光束区域是由显微镜光具组捕获的图像的尺寸(在x维度和y维度上)的函数，合适的照相机装配到该显微镜光具组上。对于常见应用，使用x20长工作距离显微镜物镜。因为布朗运动实际上与颗粒质量无关，因此NTA(像动态光散射的相关技术)被视为绝对技术而无需校准。因为其在悬浮物内单独询问颗粒(尽管同时)，因此可以生成高分辨率颗粒尺寸分布曲线。
照相机的视场通常大约是100×80微米，并且光束深度先前已经被假设为大约10μm。
然而，在其中任何给定的颗粒对照相机(“有效散射体积”或观察体积)是可见的激光束的空间维度(包括“深度”)取决于各种因素，尤其是在给定所使用的激光源的频繁非均匀强度分布图的情况下。这些包括照相机的固有灵敏度(可通过改变增益和快门设置来调整)、激光束的功率和波长，并且更重要的是散射颗粒的尺寸与折射率的强函数。
照射激光束在分布上并不通常是顶帽型的(即贯穿x和y维度的均匀强度的)而是复杂的，范围从平滑高斯(或类似的)分布到非常复杂的分布，在这些非常复杂的分布中，横截面强度的不可预测的空间变化源于对通过玻璃壁以较低(接近于临界)角度将光束发射进入散射单元的光扰动。
相应地，在可以以某一置信度动态地确定由NTA成功跟踪的颗粒的颗粒尺寸分布时，对存在于激光束的路径中的任何给定尺寸或尺寸等级的颗粒的数量的准确估计更成问题。
简而言之，更小的和/或更低的折射率颗粒常常仅在光束的入射强度最高的区域(例如高斯光束的中心或例如条纹光束的更亮部分)中是可见的(对照相机)，并且在更低的强度区域中是不可见的。相反，在距高强度光束中心(或高强度条纹之间)较大距离处可看到更大的(或更高折射率)颗粒，因为他们散射更多的光。从而，对于两个这种颗粒类型，它们在其中可见的体积(“有效观察体积”)将会不同，并且因此，尽管它们可实际以同一数量浓度存在，但NTA将检测在同一系统中不同颗粒数量。
WO2012/004320披露了一种方法，借助于这种方法可通过测量在光束中在布朗运动下运动的颗粒的平均轨道长度来确定有效观察体积。了解到已知尺寸(或者更准确地说，已知的扩散系数)的颗粒正在其中移动的温度和粘度，这种颗粒的时长通常将会是存在的，并且因此，散射可检测并从而可跟踪的光量将取决于(所有其他事情都相等)询问区域的体积。更大的有效‘观察体积’导致对于任何给定尺寸颗粒的更长轨道长度。
换言之，光束越大(或颗粒作为散射器越有效)，光束中颗粒的可见寿命将越长。如果颗粒的尺寸是已知的(例如，因为使用校准颗粒)并且溶剂的温度和粘度是已知的，则可以根据确定已知尺寸的单分散的颗粒总体的轨道长度分布来计算光束的体积。使用通过其可以在空间上计算散射体积的这种“绝对”方法，可以确定在所计算的体积中所看到的颗粒数量，允许生成样品的数量浓度的绝对值。然而，这种技术的限制在于：其假设连续且均匀的观察体积，并且要求对轨道长度的准确测量，这在高颗粒浓度上可能受到高图像噪声或流动性样品的显著影响。
加德纳(Gardiner)等人披露了另一种用于校准NTA设备的技术(“通过纳米颗粒跟踪分析进行细胞外囊泡尺寸确定和枚举(Extracellularvesiclesizingandenumerationbynanoparticletrackinganalysis)”细胞外囊泡杂志(JournalofExtracellularVesicles)2013，21-11)。这涉及使用已知浓度的、具有与有待分析的颗粒总体相似的特性(就颗粒尺寸和折射率而言)的特定纳米颗粒总体的校准样品。
然而，该方法具有有限的实际用途，要求具有适当的性质(这可能并不总是可用的)的校准物颗粒，并且无论如何，如果该设备将要被用于分析具有不同性质的颗粒总体，则其每一次都要求进行重新校准。
本发明旨在减少或克服与现有技术相关联的一个或多个问题。
发明概述
在第一方面，本发明提供了一种对用于光学地表征小尺寸(即小于1000nm直径)颗粒的样品的设备进行校准的方法，该方法包括以下步骤：
(a)将校准颗粒总体的样品引入该设备，该样品(i)基本上是单分散(例如直径S.D.小于10％的平均直径)并且(ii)均匀的，并且(iii)具有以每单位体积的数量为单位的已知颗粒浓度；
(b)在适当的条件下分析该样品，以便针对设备条件或设置的特定组合来确定所检测到的颗粒的数量以及单独检测和测量的颗粒的平均亮度；
(c)将该设备调整为设备条件或设置的新特定组合，并且分析该同一个样品、或者与步骤(a)中相同的校准总体的另一个样品，并且重复步骤(b)的所述分析以便确定在设备条件或设置的该新组合下所检测到的颗粒的数量以及所检测到的颗粒的平均亮度；
(d)可选地以设备条件或设置的一个或多个进一步的新特定组合来重复步骤(c)；以及
(e)从这些分析得出所检测到的颗粒的亮度对颗粒的数量的校准曲线或查找表，该校准曲线或查找表用于针对未知浓度的颗粒总体的后续分析来校准该设备，以便确定对其浓度的估计。
为了当前目的，基本上单分散的颗粒总体被视为其中的直径S.D.小于10％的平均颗粒直径的颗粒总体。本领域技术人员将认识到，讨论中的颗粒无需是完美的球体，但是将优选地是至少基本上是球体。在校准总体中的颗粒浓度(以每单元体积的数量为单位)绝对是优选已知的，或者可以已知处于规定范围内(例如+/-20％、优选地+/-10％、更优选地+/-5％)。
该方法可以涉及确定所检测到的颗粒的总数、或者更优选地确定每单位时间所检测到的颗粒的数量。实际上，这通常是在每图像帧地完成的。
在第二方面，本发明提供了一种对小尺寸颗粒总体中的颗粒浓度进行估计的方法，该方法包括以下步骤：
(i)使用根据以上所限定的本发明第一方面的方法来校准合适的设备，或者使用如此校准的设备；
(ii)分析该总体的样品，并且确定所检测到的颗粒的平均数量；以及这些颗粒的平均亮度；
(iii)将来自(ii)的结果与预期来自该校准曲线或查找表的结果进行比较，以便得到对该样品中的实际颗粒浓度的估计。
将认识到，本发明的优选或期望等的有关本发明的第一方面的特征将通常同样适用于本发明的第二方面。
本发明关于被用于执行NTA的设备的校准以及使用执行NTA的设备来估计总体中的颗粒浓度是特别有用的，尽管原则上其他颗粒成像技术可受益于本发明。
本发明通常对于分析或表征其中颗粒具有通常在10nm-1000nm、更通常在20nm-750nm范围内的平均直径或尺寸的样品而言是有用的，尽管如前所述，NTA可检测的颗粒的最小尺寸至少部分地取决于颗粒的折射率，其中，更高折射率的颗粒更容易被检测到。
颗粒可以是具有适当尺寸和折射率的任何东西，并且在本质上可以是生物的或非生物的。样品可以是任何工程化的或自然发生的包括纳米颗粒的样品。可由NTA分析并且可能因此对本发明的方法有意义的纳米颗粒样品的特定示例包括但不限于以下各项：病毒(包括噬菌体)、包括减毒病毒或灭活病毒或病毒样颗粒等在内的疫苗制剂；蛋白质聚集体；外体；膜聚集体和脂质体；墨水和颜料；量子点；以及化学机械抛光/平坦化(“CMP”)浆料。
本发明的方法优选使用如上文所定义的单分散颗粒总体来执行。
另外，本发明的方法可以用于估计包含有待通过NTA可分辨的具有足够不同尺寸的两个或更多个不同的单分散颗粒总体的样品中的颗粒浓度。
本发明的方法的步骤(a)要求使用标准的校准颗粒样品的样品，其浓度是至少近似已知的(例如，至一个数量级内)。合适的样品可从赛默飞科技(例如3000系列纳米球尺寸标准)和BBI公司(例如金纳米颗粒)商购，并且这类颗粒可包括例如颗粒金纳米球或聚苯乙烯珠。可商购样品可能需要用稀释剂稀释以便提供具有在适用于分析的范围内的颗粒浓度的样品。稀释剂应该明显地不含有可影响分析的颗粒。水、缓冲液或其他水溶液视情况可被用作稀释剂。
该方法的步骤(b)需要使用待校准的设备来分析校准物样品。该设备将通常是被适配且配置成用于执行NTA的设备。因此，该设备一般将包括通常与计算机处理装置一起执行必要的成像和颗粒跟踪分析的光源(通常是激光器)、光学工作台或样品室等、以及诸如CCD等的光检测器，以及相关联的软件。
该设备的各个部件将具有可调整的设置，这些设置可被调整为允许该设备用于分析具有不同性质(主要诸如颗粒尺寸、颗粒折射率以及颗粒浓度)的样品。例如，(尤其是在被适配且配置成用于执行NTA的设备)，通常将可能或者手动或通过改变在相关联的软件中的值来调整各种设置，这些设置确定在其中可以检测并跟踪到颗粒的有效观察体积。这些设置包括，特别是(i)与检测器装置的灵敏度相关的那些设置以及(ii)与亮度检测阈值相关的那些设置。当光检测器是CCD或类似物时，这些可变设置包括例如照相机增益或快门速度。亮度检测阈值是由用户设置的可调整阈值，其确定有待被选择用于进行分析和跟踪的可观察颗粒的最小亮度。在被检测但未匹配或超过亮度检测阈值的有效观察体积内的光源被丢弃。
相应地，将NTA设备用作一个示例性实施例，可使用前述设置(以及同样可选地其他设置)的一个具体的特定组合来执行该方法的步骤(b)，以便对校准样品进行分析从而确定颗粒的数量及其平均亮度。
在步骤(c)中，使用或者与步骤(a)中相同的样品或者同一校准总体的复制样品来重复步骤(b)的过程。如果使用同一样品，可能需要确保颗粒在有效观察体积内保持均质化(例如通过偶然搅动)。然而，在步骤(c)中，确定有效观察体积的前述(例如照相机)设置之一相对于其在步骤(b)中的设置被改变，从而形成设置的新的特定组合(并且因此创建不同的有效观察体积)。再一次确定颗粒的数量及其平均亮度。
在步骤(d)中，使用确定有效观察体积的另外的设置特定组合来可选地(但优选地)重复上述过程。再次，可使用同一样品或同一校准总体的复制样品。此步骤优选地被迭代多次，每一次都使用不同的设置特定组合，从而使得可以利用所检测到的大量颗粒及其平均亮度在各种各样的不同有效观察体积上构建数据集，从而使得可以在各种各样的设置上对该设备进行校准，从而允许经校准的装置用于分析许多不同的关注样品，这些样品就尺寸、折射率等方面而言可能具有极为不同的性质。
通过分析所获取的数据集然后可被用于生成所检测到的颗粒亮度对颗粒数量的曲线图或者查找表。使用所用的颗粒总体的已知(或假设)浓度，可以从所检测到的颗粒数量中推断出观察体积，产生颗粒亮度对观察体积的曲线图。此曲线图或表或其信息等效物然后被方便地存储在与设备可操作地附接或相关联的数字存储器装置中，从而使得该设备可参考数据并且作出适当调整以便当未来用于分析具有未知观察体积以及因而未知的颗粒浓度的实际关注检测样品时得到颗粒浓度的校正的估计值。
在第三方面，本发明提供了适用于计算小尺寸颗粒的浓度(以每单位体积的数量为单位)的设备，该设备通过本发明的第一方面的方法进行校准并且具有数字存储器装置，该数字存储器装置以数字形式存储通过第一方面的校准方法产生的曲线图或查找表或其等效物。
优选地，该设备被适配并配置成用于执行NTA。该设备将因而优选地包括用在可商购NTA设备中的此类部件中的一个或多个或者全部，诸如CCD或EMCCD和/或显微镜；样品室；样品处置射流装置(管、泵等)；样品照射装置(例如激光器)；编程有纳米颗粒跟踪图像分析软件等的处理装置；以及数字存储器装置。
进一步优选的是，该设备包括计算机处理装置或者可操作地与计算机处理装置相关联，该计算机处理装置被编程为用于产生由该设备分析的样品的颗粒浓度的校正估计值，该校正估计值通过应用来自存储在数字存储器装置中的数据的校准因数来确定。
将通过说明性示例的方式并且参考附图进一步描述本发明，在附图中：
图1是平均颗粒亮度(任意单位)对观察体积(任意单位)的图表，示出了用在根据本发明的校准方法的一个示例中所用的100nm直径聚苯乙烯珠的单分散总体而获得的数据；
图2是经调整的logn观察值对亮度的图表，示出了一种线性关系；
图3示出了在进行根据本发明的校准之前(图3A)和之后(图3B)通过NTA分析的样品的log10(观察浓度/实际浓度)的箱形图；
图4示出了在执行根据执行本发明的校准方法之后两种不同颗粒总体(直径为100nm或200nm)的观察浓度/实际浓度的箱形图；并且
图5是对每单位时间(例如每图像帧)所看到的表观颗粒亮度对颗粒数量的广义、代表图。
示例
示例1
校准使用100nm聚苯乙烯标准
首先，该标准被稀释为适当的浓度，例如108颗粒/ml，并且被注入适当的测量设备(诸如英国，埃姆斯伯里的NanoSight公司的NanoSightNS500系统)。在具有不同照相机设置(快门和增益)和检测设置(检测阈值)的范围上进行若干次测量。对数据进行滤波，从而使得具有有限统计噪声或较高噪声的点被移除。使用剩余的数据，观察体积通过使用已知的浓度和统计的颗粒数量来计算，并且如在图1中所看到的，针对一定数量的检测阈值来相对平均亮度绘制此观察体积。
通过将平均亮度用作主解释变量来对数据进行线性回归。为了处理其他设置(诸如检测阈值)，可制作单独的模型并且可以将变量作为随机变量或者因数而整合到回归模型中(在这种情况下，检测阈值是附加的解释变量)。
在图2中示出了对数据的拟合，图2相对亮度(mlni_5)在AU比例上绘制了观察体积。
这种线性模型然后可被用于针对任何亮度(通过照相机设置、尺寸、折射率等等被修改)和浓度的测量来预测观察体积。
将该模型应用到用于校准的100nm范围的颗粒显著地减少了变化。图3中的箱形图示出了在校准前(图3a)、以及校准时、校准后(图3b：注意对数刻度)的变化。
该图展示了在应用该过程之前，存在～0.7logs＝(即大约500％倍数的)变化的观察四分差变化(主要由于照相机设置及检测阈值)，而在应用该过程之后，四分差变化为～30％。
进一步地，将该模型应用于100nm颗粒和200nm颗粒(用相似范围的设置所捕获)的附加集合给出了可比较的结果(参见图4：注意，不是以对数刻度)：
此示例说明了本发明在应用于进行纳米颗粒跟踪分析(“NTA”)的方法和设备时的原理。
诸位发明人已经认识到，与WO2012/004320中所描述的方式相比，可以通过测量由颗粒散射的光的强度并且相对具有已知数量浓度的总体进行校准来获得有效散射体积(由此可得到数量浓度的估计值)的想法。
因此，对于具有已知数量浓度(每单位体积颗粒的数量)的单散射(尺寸校准物)颗粒总体来说，以任何给定光学配置和设置(例如激光波长和功率、照相机灵敏度和设置等)所看到的颗粒的数量可通过校准调整至真实数量浓度。如果调整了负责所看到的颗粒亮度的参数中的一个或多个参数(例如，激光功率被增大或照相机灵敏度被增大[增益，快门长度])，则所看到的颗粒的数量将会增加。因此，对于校准颗粒样品，可以生成针对任何给定检测效率所看到和统计的颗粒的平均数量的“主”校准曲线图。改变系统的检测灵敏度(例如，通过增大照相机增益)从而改变“颗粒亮度”将导致在所看到的颗粒的数量上的相应改变。类似的，如果校准物样品被稀释，则所看到的数量上的改变(与预期来自校准曲线图的数量相比较)反映了目前实际数量的真正改变。
对于不同的样品(例如不同尺寸和/或折射率)，如果样品是单分散且均质化的，所看到的颗粒亮度(甚至在系统的灵敏度[例如照相机增益]改变之后)可与校准曲线图及所估计的每单位体积的实际颗粒数量(其浓度)相比较。从而，只要颗粒类型的平均亮度那种颗粒类型的有效散射体积进行上报并且因此能够可信地估计其数量浓度，则该主校准曲线图可应用于任何其他单散射及均匀样品类型。
使用荧光颗粒(固有荧光、或者贴上荧光标签的)所获得的测量结果而非使用由颗粒所散射的光所作出的测量结果可替代性地用于校准技术。
再次重申，在使用已知数量浓度的单散射和均匀样品相对颗粒数量校准散射体积之后，只要亮度被调整(通过例如，照相机增益或激光功率)为落入主数量校准曲线图范围内，则可以统计其他单散射和均匀样品(即使是由于不同尺寸和/或Ri而导致的不同散射性质)并且可以估计数量浓度。所看到的平均颗粒数量与预期来自主校准曲线图的平均颗粒数量的差异因此指示新样品的实际数量浓度的真实差异。
对于包括具有充分不同散射性质(通过尺寸和/或折射率)的两种不同颗粒类型的双模态样品，如果检测到足够数量的每一种颗粒总体，则这两种总体将自己分辨为两个数据集，使用主校准曲线图可以对这两个数据集中的每个数据集单独进行统计并且根据它们在校准曲线图上的位置对每一个数据集的浓度进行调整。
对于包含多种颗粒类型总体的混合体，可以用来对它们进行区分的分辨率随着不断增大的多分散度和/或任何其他可测量参数(诸如亮度、尺寸、偏振、荧光、形状、动力(诸如电、磁、重力等)或任何其他能够区分样品的测量)的变化而变得越来越成问题。然而，将数据分为(或者分离的或者重叠的)多个分箱或分组的增大的分辨率将有助于在此类复杂的样品中增大统计的准确性，假如所观察的每一个分箱或每一个分组中存在足够数量的颗粒。
当然，不像其他依赖于颗粒强度测量以用于尺寸确定和统计的光学技术，NTA能够测量颗粒的动态布朗运动，从该动态布朗运动可(单独地)估计颗粒尺寸。因为这一分析正在时间域中进行，因此其与颗粒的强度无关。这允许在以上所描述的亮度/浓度关系中利用附加的正交测量结果。
因此，对于不同颗粒总体(其中的每一个颗粒总体具有不同尺寸和/或Ri但其光散射性质是相似的并且将因此不能够单独在强度基础上相互区分)，可以通过针对校准的数量浓度绘制它们的亮度对大小来区分和统计(使用主校准曲线图)这类颗粒总体(只要正在同时对每个颗粒进行检测、布朗运动尺寸确定以及亮度检测)。
类似地，可以此方式利用由NTA所提供的其他测量结果。例如，贴上荧光标签的颗粒、在所施加的动力场(例如电、磁、重力等)中的行为、颗粒形状、偏振等中的每一个或以不同方式可被用于获得益处。
示例2
以下描述如应用于NTA设备的本发明的校准方法的一个示例。
方法
对系统进行数量校准所需的步骤，从这些步骤可以确定不同样品类型的数量。
数量较准
1.对于具有任意光束曲线和功率的NanoSight系统，添加单散射和均匀的校准质量颗粒的(例如具有在10-1000nm或更优选地50-300nm的范围内的尺寸)数量浓度准确已知的适当稀释样品(至每毫升107-109个颗粒之间的任何值)。
2.使用一系列快门和增益设置进行分析，以便充分地覆盖NTA分析可有效测量的强度范围。
3.进行以上分析，直至充分地由鲁棒统计通过分析获得在充足时间上的充分数量的已分析的颗粒轨道。作为最小值，这在正常情况下将是>200个轨道并且大于30秒，并且更优选地>1000个已分析的颗粒轨道并且大于150秒。
4.测量通过在所选照相机设置下所看到的颗粒显示的平均亮度，并且统计每单位时间(例如每帧)检测的颗粒的平均数量。
5.如在图5中示意性地图示的，使用所产生的数据来生成颗粒亮度差异的校准曲线图(通过增加增益)，从而导致每单位时间所看到的颗粒的相应增加。
6.假定校准样品的绝对数量浓度是已知的，则可从所看到的颗粒的平均数量中推断出散射体积，因此生成亮度和散射体积的校准曲线。
7.使用所产生的校准曲线图来找到平均表观颗粒亮度和散射体积之间的[线性的或其他方式的]关系。
在以上进行校准程序之后，然后可以使用如此得出的信息来确定对可使用NTA进行分析的任何颗粒样品的颗粒浓度的估计。
颗粒浓度的估计是这样执行的：
8.将适当稀释但是未知的样品添加至仪器(不改变配向或放大率)并且调整设置(例如照相机增益/快门或激光功率)直至所看到的颗粒的平均亮度处于由在以上校准曲线图中使用的颗粒所激发的强度范围内。
9.分析样品，记录所检测的颗粒的平均亮度(和尺寸)。
10.通过使用所获得的平均亮度数据，使用在步骤7中所发现的关系以便推断出在其中颗粒可见的散射体积。
11.一旦已知散射体积，所统计的颗粒的数量现在可以是与样品中的颗粒浓度相关的。
未知浓度、构成和尺寸的多模式样品的测量
12.针对包含具有不同样品类型/尺寸范围的两个或多个离散总体，执行以上步骤8和步骤9。
13.根据步骤10和11，对由于可识别地不同的亮度组而产生的两个或多个离散分组进行标识，为每一个离散组计算散射体积以及所产生的浓度。
14.针对尽可能多的可标识的不同子总体，应用不同的数量调整。
使用从NTA可获得的附加测量结果来从复杂的样品类型中提取进一步的信息
对于包含可通过添加关于每一个颗粒的进一步信息(例如，如通过布朗运动确定的尺寸、在所施加的电场下的电泳迁移率、由特定标签(例如调解的抗体)生成的荧光)来进行区分的多个子总体的样品，在三维(亮度v.浓度v.尺寸/荧光信号/迁移率等)中重新绘制图表并且从校准曲线图中恢复校正的数量估计)。