多成分样品的成分相关特性的确定的制作方法

本发明涉及一种用于确定多成分样品的成分相关特性的方法和监测器，并且具体地，涉及这个确定在电磁辐射与样品相互作用之后使用对电磁辐射的化学计量分析。

例如，在食品工业，顾客和生产商都越来越对获得更多关于产品的一种或更多种成分相关特性的详细信息感兴趣，例如，从肉和乳制品总脂肪含量到脂肪酸分析；从总蛋白质含量到蛋白质组分(如从牛奶蛋白质到酪蛋白和乳清组分)；从牛奶、酒和果汁产品中的总碳水化合物到糖分析；或者识别低浓度成分，如酒和果汁产品中的苹果酸或牛奶中的丙酮；或者确定食品的物理或功能特性。

在本语境中，短语‘成分相关特性(constituentrelatedproperty)’指多成分样品的组成、物理或功能特性，受该样品的成分中的一种或更多种的影响。类似的短语将具有类似的意义。

因此，期望可以从对成分本身进行的测量获得关于成分相关特性的信息。

熟知的是，多成分产品的不同成分与光学辐射差别地相互作用，尤其是在电磁光谱的红外线区域内，从而产生更多或更少的特有的‘光谱指纹’。样品成分的化学键的伸缩和弯曲振动例如能够提供电磁光谱内的特征吸收带，尤其是光谱的近红外和中红外部分。不同的粒子尺寸(对于地面谷物而言，粒子尺寸与硬度有关)可能致使样品展现不同的光散射和/或吸收特征，能够再通过光学辐射与样品之间的相互作用监测到这些特征，从而提供关于样品内的感兴趣的特性的信息。对光学光谱的化学计量分析现在一般被用作得到关于样品特性的定量或定性信息的手段，所述对光学光谱的化学计量分析是在电磁辐射与样品相互作用之后对从电磁光谱(在此称为‘光学辐射’)的紫外线到红外线部分内的一个或更多个波长区域中的电磁波辐射的检测得到的。化学计量分析还是所谓的‘间接’技术，意思是组分相关信息不是从所记录的光谱数据直接可获得的。相反，必须通过使参考样品的光谱特征与关于这些样品的感兴趣的特性的信息相关来建立校准，该信息是针对每个参考样品使用其他(一般是直接)分析技术获得的。然而，有利的是，化学计量分析提供了通过开发随后能够用于对新样品的定量特性估计以及用于未考虑在校准样品中的偏离样品的检测的模型算术地提取关于样品的感兴趣的特性的相关信息的能力。

不幸的是，具有相似化学键的成分通常产生相似或严重重叠的光谱指纹。这将使得难以采用对常规光学光谱的化学计量分析从而确定样品的与这些成分相关的特性。

根据本发明的第一方面，提供了一种确定多成分样品的样品特性的方法，包括：使该样品经受微扰，该微扰被选定用于诱导测量数据的与时间有关的改变，该测量数据与有待确定的样本特性的相关联；在使该样品经受该微扰之后记录该测量数据的时序；并且从使该样品特性与测量数据的时序相关的校准在所记录的该测量数据的时序的应用，确定该样品特性，所述校准是从在使每个参考样品经受该微扰之后针对多个参考样品中的每一个所记录的时序测量数据的多变量化学计量建模凭经验得到的，每个参考样品具有样品特性的不同已知值。

借助通过诱导仅影响与有待确定的样品特性相关的成分的样品微扰(硬件微扰或者样品中微扰)将已知的静态测量情形改成动态测量情形，则可以采取时间演化数据来提供特征时间发展曲线以及其仅与感兴趣的成分相关联的内容改变。由于这是现在正采用的测量数据的特定改变，甚至现在处于低(即使之前不可检测)浓度的成分都可以生成相对大的改变，这允许其检测和特性确定，如成分浓度或与成分有关的物理或功能特性。

而且，通过采取动态时间分辨型测量数据，能够使本发明的方法对干扰更加健壮，并且通过使用先进的化学计量动态时序建模可以减少所需的校准参考样品的数量。

在测量过程中，通过例如温度改变、添加化学品、添加一种或更多种酶、盐或ph改变，直接在样品中诱导物理或化学微扰。在每种情况下，所采用的样品中微扰将被选定用于诱导样品的物理或化学改变，该物理或化学改变显现为与感兴趣的成分相关信息相关联的测量数据的改变。硬件微扰是应用在样品外部以在样品中产生微扰的微扰，例如，由于向液体样品施加电流或磁场而诱导保存在样品展示单元(包括例如透明小容器)中的液体样品中的分散粒子(如分子)的移动。

根据本发明的第二方面，提供了一种样品特性监测器(2)，包括用于输出电磁波的输出单元(4)，该电磁波用于与多成分样品相互作用；检测单元(6)，用于在该电磁波与该多成分样品相互作用之后检测该电磁波的特性，并且输出所检测的该电磁波的特性作为测量数据；微扰单元(14)被适配成用于在该多成分样品中生成微扰，该微扰被选定用于诱导与待确定的样品特性相关联的改变，所述改变显现为被该检测单元(6)检测到的该电磁波的该特性的改变；以及确定单元(8)，用于从该输出测量数据确定该样品特性；其中，该检测单元(6)被适配成与该微扰单元(14)的运行以定时关系运行，从而在生成该微扰之后多次检测电磁辐射的特性并输出测量数据的时序；并且其中，该确定单元(8)被适配成用于处理测量数据的该时序，从而通过将有关该样品特性的校准应用在测量数据的该时序来确定成分相关的样品特性，该校准是从在每个样品中生成微扰之后针对多个参考样品中的每一个所记录的时序测量数据的多变量化学计量建模凭经验得到的，每个参考样品具有该样品特性的不同已知值。

下面参照附图对发明进一步进行解释和例证，在附图中：

图1展示了牛奶的典型中红外光谱；

图2根据本发明示意性地展示了代表性样品特性监测器；

图3示出了使用图2的分析器获得的示例性时间演化曲线；

图4示出了从如图3中所展示的曲线检索的平行因子(parafac)活跃模式；

图5示出了通过对图3中例证的时间演变曲线的parafac建模获得的对牛奶中k酪蛋白的校准；以及

图6根据本发明示意性地示出了用于基于电泳的确定的图1的监测器中所采用的采样单元。

现在将仅举例描述本方法的实施例。根据本示例性实施例，进行牛奶中k酪蛋白(‘κ-casein’)量的确定作为成分相关的样品特性。这个确定是在波与牛奶相互作用之后通过分析电磁波特性(在此为电磁波的波长分量的强度)的与微扰诱导的时间有关的改变而进行的。

现在考虑图1，展示了在波数区域1000cm^-1至1600cm^-1(对应于波长区域10,000nm至6250nm)中牛奶的代表性中红外吸收光谱。对牛奶样品光谱指纹的蛋白质(p)相关特征进行标识。酪蛋白已知代表约80％的全蛋白质含量。由于根据比尔定律(beer’slaw)，电磁能量(在此为中红外能量)的吸收与吸收分量的量成比例，则使用对常规静态光学光谱的化学计量分析的酪蛋白的检测应当是可能的。然而，如从图1中可见，蛋白质光谱特征(p)未显示明显可区别结构。与k酪蛋白相关的光谱特征与牛奶中的其他蛋白质本质上是不能区分的。如本领域技术人员将理解的，被开发用于从此类测量数据推测k酪蛋白含量的常规化学计量模型在这些情况下将是不准确的。

熟知的是，添加凝乳酶酪使酪蛋白胶束的凝胶化是制造奶酪的第一步。该酶具体将k酪蛋白的羧基端除去，造成酪蛋白胶束的失稳和随后结块，所述结块造成牛奶样品的光学光谱指纹的改变。仅举例来说，使用这种酶作为对牛奶样品的化学微扰，能够为每个样品记录光谱数据的时序作为对k酪蛋白结块的时间演化的监测。在本示例性实施例中使用了两种酶制剂(凝乳酶制剂)，即chymaxplus^tm和chymaxm1000^tm，均从丹麦霍斯霍尔姆自治市的科汉森公司(chr.hansen,allé10-12,dk-2970denmark)获得。chymaxm1000对k酪蛋白显示最高特殊性并且因此如下所述用于建立时间校准，该时间校准使样品特性(在此为k酪蛋白浓度)与时序光谱数据(在此为代表光谱吸收的时间演化)相关。两种酶制剂都显示出不相上下的光谱演化，并且关于牛奶中k酪蛋白的结块以类似的方式反应。

根据本实施例，并仅举例来说，使用如图2中示意性展示的样品特性监测器2记录了所有的电磁光谱测量数据，并运行以记录1000cm^-1至1600cm^-1之间的波数区域中的光谱数据。根据图2，示例性样品特性监测器2包括输出单元4；检测单元6；确定单元8；控制单元10；以及采样单元12，该采样单元12包括微扰单元14和样品展示单元16。

输出单元4被适配成用于向样品展示单元16中的多成分液体样品(在此为牛奶)输出电磁波。在本实施例中，电磁波是具有至少在6250nm(1600cm^-1)和10000nm(1000cm^-1)之间的区域延伸的波长分量的中红外电磁波。将理解的是，一般而言，输出单元4所发出的电磁能量的波长是取决于样品内引起正在监测的成分相关样品特性的(一种或更多种)成分而选择的。

在波与样品展示单元16中的液体样品相互作用之后，检测单元6检测从输出单元4输出的电磁波的特性。在本实施例中，检测单元6被示为被配置成用于监测输出电磁波的由其与液体样品的相互作用诱导的与能量(波长或波数)有关的强度变化，并且用于提供这个电磁吸收光谱数据作为输出测量数据。在此，并仅举例而言，检测单元6被配置成用于检测传输通过样品的电磁能量，并且可以如在本示例中包括傅里叶变换红外线(ftir)光谱仪，尽管可以替代其他被适配成用于提供根据能量(波长或波数)而被索引的强度的输出的已知光谱光度测量设备(如单色仪或检测器二极管阵列(dda))。

确定单元8包括数据处理器，该数据处理器被配置成用于基于由检测单元6提供给它的测量数据确定样品内的成分(样品特性)的浓度(如下面将更详细描述的)，并且用于输出相同的浓度(conc.)，例如在视频显示器上以人类可辨识的格式或以数码格式用于传输、存储在存储器设备中或用于其他电子系统。

控制单元10可操作地连接至微扰单元14从而触发微扰单元14来在液体样品中诱导微扰，这造成输出电磁能量与液体样品之间的交互程度的与时间有关的变化，这些变化与该液体样品的与正在被监测的样品特性有关的成分相关联。在本示例中，控制单元10还可操作地连接至检测单元6用于触发检测单元6在由微扰单元14触发微扰之后进行多次检测。从而生成的时序电磁光谱数据是被确定单元8采用以确定液体样品内感兴趣的成分浓度作为样品的成分相关特性的测量数据。

采样单元12包括微扰单元14，该微扰单元在本实施例中可操作以在液体样品中(例如，直接在样品展示单元16中保存的样品中)自动地诱导合适的微扰。在此，微扰单元14运行以向液体样品中引入化学品(比如酶)从而引起反应，在液体样品与从输出单元4输出的电磁波相互作用时该反应本身作为可检测的改变显现。该化学品/酶被选定以用于诱导改变，该改变特定于与有待确定的样品的特性(在本示例中为成分浓度)相关的成分。取决于成分，其他微扰可以替换为化学微扰。此类其他微扰可能具有热学、电学或磁性本质。在替代性实施例中，微扰单元14可以是可人工操作的并且可以例如是包含合适化学品的移液管或注射器，并且可以运行以在其进入样品展示单元16之前将这种化学品引入样品。

采样单元12的样品展示单元16是根据检测单元16所检测的电磁波的特性配置的。在本实施例中，样品展示单元16则包括相对的壁截面，这些壁截面对输出单元16所输出的电磁波是可穿透的，并且可以被形成为可移除的透明小容器，可以将样品(附加或不附加微扰化学品)人工地引入该透明小容器。可替代地，样品展示单元16可以被形成为流入式透明小容器，其具有入口和出口，该入口连接至液体流系统，外部样品可以通过该入口流进该透明小容器以便分析，经分析的样品可以经该出口从该透明小容器移除。在本实施例中，液体流系统的从外部可接近的移液管的一端可以浸入待分析的液体，例如，可以保存在烧杯或试管中，并且流系统被操作以向样品展示单元16自动地引入液体样品。微扰单元14可以液体地连接至流系统用于将微扰化学品/酶引入朝样品展示单元16流动的液体中。

根据本实施例，为了建立对k酪蛋白浓度的经验性校准，使用不同的源于消费者牛奶纸盒的牛奶稀释物制备参考样品。根据稀释物，通过总蛋白质含量(在此从牛奶包装营养信息获得，但可以使用标准分析技术(如采用基耶达(kjeldahl)化学法的分析技术)获得)乘以因数0.8简单计算k酪蛋白浓度。在本领域普遍接受k酪蛋白代表牛奶中约80％的总蛋白质，例如课本(mejeri-作者e瓦格纳尼耳森(e.waagnernielsen)和延斯a尤姆(jensa.ullum)，isdn87-7510-536-5，第62页)中证明的。

在建立校准时所采用的稀释的牛奶参考样品在表1中列出，并且被选定为使得k酪蛋白浓度延伸至覆盖未知k酪蛋白浓度的样品中期待的浓度范围，校准将最终应用于该浓度范围。

表1

图3(a)和图3(b)中分别展示了针对样品号5和11所标识的参考样品记录的输出电磁波的与能量有关的吸收的时间演化曲线。由于每个光谱的采集时间是已知的，则图3中所展示的扫描号代表所收集的光谱数据的时标。能够清楚地观察到，6250nm(1600cm^-1)和10000nm(1000cm^-1)之间的波长区域中，电磁波能量的光谱演化的强度随着k酪蛋白浓度而增大(即，从图3(b)到图3(a)增大)并且在引入微扰/光谱号之后随着时间增大(见图3(a))。通过引入20μl的chymaxm1000酶溶液，已经诱导了所有的微扰。

为了建立k酪蛋白校准，采取了多变量化学计量(优选地，多路)分析方法，比如像parafac、tucker3或npls。替代性多变量化学计量方法是展开pls、展开pcr、展开岭回归(ridgeregression)等，以及与这些方法相联系的变量选择技术(包括多变量线性回归(‘mlr’))。对于这些真实的多路方法，原理上，只有一个校准样品足以校准系统，这与双路方法相反，在双路方法中需要若干样品以跨越期望的变化。在本实施例中，parafac应用于时间演化曲线，从而在没有参考数据(参考数据是无监督的并且因此无偏置)的情况下提取潜在光谱图案。应用parafac以将张量分解成样品模式、动力学模式和光谱指纹模式。图4中展示了检索的parafac动力学模式，图4示出了平行因子分量1上的负荷随扫描号(等价于微扰后的时间)变化的曲线并且展示了分量1上的负荷随着时间(扫描号增大)而增大。

之后，通过使分量1的经parafac检索的分数与表1中的k酪蛋白浓度相联系建立最终校准。使用不同的光谱数量(＝不同观察次数)针对不同模型计算校准准确度和精度。如图5中所示，k酪蛋白浓度与通过parafac检索到的分量1分数良好地联系，图5是针对表1中列出的参考样品的parafac分量1分数随牛奶中k酪蛋白浓度(g/100ml)变化的曲线。通过测量一个k酪蛋白浓度的九次重复实验，确定精度。

针对本示例，就准确度和精度而言，良好校准的最佳观察时间相当短。对于1.9分钟的观察时间(7个光谱；每个光谱具有16.6秒采集时间)，parafac模式展现最佳性能。

为了确定未知浓度的测试样品中的k酪蛋白浓度，针对这个测试样品本质上以与针对参考样品获得时序相同的方式记录了6250nm(1600cm^-1)和10000nm(1000cm^-1)之间的波长区域中的电磁光谱的时序。一般而言，然后，将酶添加至测试样品中，并且由等效于用于生成该模型并在图2中展示的监测器2的样品特性监测器记录包括6250nm(1600cm^-1)和10000nm(1000cm^-1)之间的波长区域的电磁光谱。术语‘等效’，将被理解为指将从样品生成光谱数据的样品特性监测器，该样品与使用校准生成中所采用的监测器生成的光谱数据是可检测地不可检测区分的。这些光谱是在与系统中所存储的校准模型的衍生中所采取的相同观察时间和采集时间上获得的。在本示例性实施例中，记录的时序数据经受parafac分解从而获得分量1的分数，然后将存储的校准模型应用至浓度确定单元8中的获得的分数，并且获得测试样品中的k酪蛋白的浓度(量)。

在其他实施例中，需要不只一个分量，并且然后采取多变量化学计量回归法(如mlr)将这些分量与感兴趣的样品特性相联系。

在根据本示例的方法的进一步实施例中，在多成分食物样品中检测蛋白质，如牛奶或乳化固态食物产品。在此，采用蛋白质变性技术作为微扰。蛋白质变性是不伴随主要结构中涉及的肽键破裂的任何结构变化，并且根据本发明，监测的是结构变化的时间演化。热、酸、碱、浓缩盐溶液、溶剂和电磁辐射均是造成变性的已知微扰。已知通过测量蛋白质沉淀、黏度、通过电泳的蛋白质迁移、旋光色散、二色性、与波长有关的强度变化或电磁波的其他特性改变来监测蛋白质变性。从而，根据本发明，在测试样品中诱导了合适的微扰，并且记录了测量数据的时序。在数据处理器中将使成分(蛋白质)相关样品特性与测量数据的时序变化相联系的适当导出的经验校准应用于记录的测量数据的时序，从而为测试样品确定样品的成分相关特性，如浓度。可以用类似于上文关于k酪蛋白校准所描述的方式生成这种经验校准。因而，使用与获得测试样品的时序测量数据时采用的相同的方法针对多个具有已知量的感兴趣蛋白质的参考样品获得时序测量数据。多变量化学计量建模(如上文所描述的多路建模)应用于对每个参考样品的时序测量数据，从而生成校准。

将理解的是，使时间演化测量数据与其他感兴趣的样品特性相关的校准能够通过使用具有该样品特性的已知值的参考样品并使这些参考样品的时间演化曲线经受多变量化学计量建模来生成。

根据样品特性监测器的第二实施例，根据本发明，图8中展示了采样单元812，该采样单元替代图2的采样单元12，以便适配图2的成分分析器2运行以使用电泳微扰来确定多成分液体样品中感兴趣的成分的浓度(conc.)。该采样单元812包括微扰单元814和样品展示单元816。

该微扰单元814是直流(d.c.)发电机，其可操作地连接至样品展示单元从而在样品展示单元816中保存的多成分液体样品内生成电场。

样品展示单元816(在本实施例中并仅举例说明)被配置成流入式透明小容器，其配备有与样品特性监测器的液体流系统(未示出)处于液体连接的液体入口818和液体出口820。流入式透明小容器816具有相对的窗口部822和824(虚线)，这些窗口部是由对从输出单元4输出的电磁能量可透射的材料形成的并且尺寸被设定以在透明小容器816内提供观察区域(阴影区域)，该观察区域小于透明小容器的液体保存区域。

在使用中，微扰单元814在液体保存区域(该液体保存区域是样品展示单元816的整个液体保存体积)中的液体样品内生成直流电场，该直流电场导致液体样品的带电荷成分经过观察区域826以取决于其电荷的方向向透明小容器816的或者负极(-)或者正极(+)移动。在由微扰单元814施加电场之后在不同时间记录了多个电磁光谱，并且在确定单元8采取电磁光谱数据的这个时序来确定多成分液体样品的成分的浓度(量)或存在/不存在并同样地输出(conc.)。从多变量化学计量建模到时序参考样品数据的应用，凭经验获得校准。使这个校准可供使用，例如存储在可存取的电子存储器或其他存储设备中(为此目的，确定单元8内)，该校准因而将有待确定的样品特性与电磁光谱数据的时序的特性相联系。这个校准是以与对上文所描述的k酪蛋白基本上相同的方式获得的。然而在本实施例中并且技术人员将理解的，针对具有已知成分浓度的参考样品记录时间演化曲线，并不是跟着添加酶而发生的，而是跟着应用直流电场而发生的。而且，本实施例的输出单元4将被适配成用于输出处于电磁光谱的合适区域中的电磁波，该电磁波对成分的电学微扰诱导的改变敏感。如上文所述，样品特性监测器的本实施例可以(不限制其其他用途)应用于通过监测时间相关变化来确定蛋白质相关信息作为感兴趣的样品特性，这些时间相关变化是感兴趣的蛋白质的变性的显现。