一种芪苓温肾消囊制剂的有效成分分析方法与流程

技术领域：

本发明涉及一种药物的有效成分分析方法，，特别涉及一种芪苓温肾消囊制剂的有效成分分析方法。

背景技术：
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多囊卵巢综合征(polycysticovarysyndrome，pcos)是青春期及育龄期女性常见的妇科疾病，在育龄期妇女中的发病率大约是6％～10％。中医学认为pcos的病机为“天癸失序、痰壅胞宫”，与脾肾功能失常有关。现代医学研究发现pcos是由于下丘脑-垂体-卵巢轴调节功能异常，从而导致内分泌紊乱，出现以高雄激素血症、胰岛素抵抗及排卵障碍为主要特征，临床表现为闭经、不孕、肥胖、多毛的四联症。

芪苓温肾消囊方(原名补肾化痰方)是治疗pcos的多年临床经验方，由黄芪astragaliradix、淫羊藿epimediiherba、苍术atractylodisrhizoma、茯苓poria、丹参salviaemiltiorrhizaeradix5味药材组成，具有补肾化痰、健脾祛湿、调经止痛等功效，临床随症加减使用，疗效显著。具体的处方为：黄芪30-50份、淫羊藿10-30份、苍术10-30份、茯苓30-50份、丹参10-30份。制备方法为按重量配比称取各原料药，各原料药用水煎煮，合并煎煮液，过滤，滤液浓缩成55-60℃热测时相对密度为1.20-1.35的清膏，加入制剂成型的辅料或赋形剂，制剂成型，即得。

尹倩等(尹倩,侯丽辉,刘颖华,等.补肾化痰方对多囊卵巢综合征患者高雄激素血症影响的临床观察[j].上海中医药杂志,2015,49(8):53-55.)利用补肾化痰方对患者进行治疗，比较内分泌指标，结果显示，治疗组疗效显著，可明显改善高雄激素血症，促进排卵。常惠等(常惠,匡洪影,丛晶,等.补肾化痰复方颗粒对孕期高雄激素血症大鼠雌性子代生殖内分泌的影响[j].中华中医药杂志,2011,26(12):2872-2875.)利用补肾化痰方对孕期高雄激素血症大鼠进行治疗，发现其能降低雄激素水平，逆转卵巢的多囊改变，改善排卵功能。梁晨等(梁晨,丛晶,常惠,等.补肾化痰复方对多囊卵巢综合征模型大鼠卵巢内胰岛素信号传导分子的调控[j].中国中西医结合杂志,2011,31(12):1639-1644.)通过实验发现补肾化痰方能改善胰岛素抵抗及糖脂代谢功能，可能与胰岛素信号传导分子蛋白表达的调控有关。

目前针对芪苓温肾消囊方的物质基础研究鲜有报道。本发明采用uplc-esi-it-tof/ms分析方法对其化学成分进行全面的研究，并对部分特征成分来源进行了指认，为其物质基础及质量标准研究提供指导。

技术实现要素：

为了解决上述技术问题，本发明提供一种芪苓温肾消囊制剂有效成分的分析方法，该方法能够快速检测出芪苓温肾消囊制剂的有效成分。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种芪苓温肾消囊制剂有效成分的分析方法，包括如下步骤：

(1)对照溶液的制备：

(2)供试品溶液的制备：

(3)有效成分的解析方法：包括黄酮类化合物、酚酸类化合物、三萜皂苷类化合物、倍半萜苷类化合物、生物碱类化合物。

所述步骤(1)对照溶液的制备：称取适量的绿原酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、金丝桃苷、迷迭香酸、紫草酸、芒柄花苷、丹酚酸a、淫羊藿苷、芒柄花素、黄芪甲苷、宝霍苷i、箭霍苷b、苍术苷a、朝霍定a、朝霍定b、朝霍定c对照品于同一量瓶里，加入适量甲醇超声溶解，冷却至室温，定容至刻度，即得混合对照品溶液。

所述步骤(2)中供试品溶液制备包括样品供试品溶液和单味药材供试品溶液。优选，步骤(2)供试品溶液制备，称取芪苓温肾消囊制剂，30-50％甲醇超声提取20-60min，冷却至室温，取上清液过0.22μm滤膜，即得样品供试品溶液；称取单味药材或提取物，分别用0-50％甲醇超声提取20-60min，冷却至室温，取上清液过0.22μm滤膜，即得黄芪药材供试品溶液、苍术药材供试品溶液、茯苓药材供试品溶液、丹参药材供试品溶液、淫羊藿药材供试品溶液。

所述步骤(3)中黄酮类化合物包括金丝桃苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、温哥华苷e、淫羊藿苷a、脱水淫羊藿素-3-o-鼠李糖(1-2)-呋喃酸-7-o-葡萄糖、芒柄花素、芒柄花苷、宝霍苷ⅱ、毛蕊异黄酮、温哥华苷f、朝霍定a、朝霍定b、朝霍定c、淫羊藿苷、脱水淫羊藿素-3-o-鼠李糖(1-2)-呋喃酸-7-o-葡萄糖、大花淫羊藿苷f、淫羊藿次苷、淫羊藿次苷ⅰ、箭霍苷b、2”-鼠李糖淫羊藿次苷ⅱ；所述酚酸类化合物包括丹参素、丹酚酸h或i、丹酚酸d、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸b、异丹酚酸b或丹酚酸e、丹酚酸a、绿原酸、异绿原酸、新绿原酸；所述三萜皂苷类化合物包括黄芪皂苷i、黄芪皂苷ⅱ、异黄芪皂苷ⅰ、黄芪甲苷；所述倍半萜苷类化合物包括苍术苷、生物碱类化合物包括木兰碱。

所述步骤(3)中所述的有效成分解析方法包括超高效液相色谱法、质谱法、峰归属分析法。

所述超高效液相色谱法色谱条件：

采用pda检测器、c18或t3或hilic色谱柱，流动相：采用0-0.5％甲酸水溶液-乙腈，体积流量0.1-0.6ml/min。优选采用c18色谱柱，流动相：采用0.1％甲酸水溶液-乙腈，梯度洗脱，体积流量0.4ml/min；柱温30℃；梯度洗脱条件为

所述质谱条件：采用电喷雾电离离子源(esi)，正负离子分别检测，扫描范围m/z100～1200，离子源温度220-350℃，毛细管电压负离子模式3.0-4.0kv，正离子模式3.5-5.0kv，雾化气体积流量1.2-2.0l/min。优选以三氟醋酸钠作校正液，雾化气为高纯氮气，碰撞气为氩气，离子源温度250℃，毛细管电压负离子模式3.5kv，正离子模式4.5kv，雾化气体积流量1.5l/min；

所述峰化合物归属法采用uplc-esi-it-tof/ms方法，通过对照品比对、图谱、质谱数据以及参考文献的分子量及碎片信息得出化合物结构，共指认出来源于黄芪、淫羊藿、苍术、丹参4味药材共36个化学成分。

本发明所述的芪苓温肾消囊方属于现有技术，其由黄芪30-50份、淫羊藿10-30份、苍术10-30份、茯苓30-50份、丹参10-30份作为原料药经过提取加工制备而成的中药复方制剂。

其方法：取各原料药，各原料药用水煎煮，合并煎煮液，过滤，滤液浓缩成55-60℃热测时相对密度为1.20-1.35的清膏，干燥即可；所述各药材提取物是各原料药分别用水煎煮，过滤，滤液浓缩成55-60℃热测时相对密度为1.20-1.35的清膏，干燥即得单味药材提取物。

以上组成中，药物的重量是按重量份作为配比的，在生产时可按照相应比例增大或减少，如大规模生产可以以公斤为单位，或以吨为单位，小规模生产也可以以毫克为单位，重量可以增大或者减小，但各组成之间的生药材重量配比的比例不变。

以上重量配比的比例是经过科学筛选得到的，对于特殊病人，如重症或轻症，肥胖或瘦小的病人，可以相应调整组成的量的配比，增加或减少不超过100％，药效不变。

以上组成中的单味中药，尤其是臣药和佐药，也可以被适当的具有相同药性的中药替换，替换后的中药制剂其药物作用不变。

本发明的制剂可以是任何可药用的剂型，这些剂型包括：片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂、贴剂。本发明的制剂，优选的是口服剂型，如：胶囊剂、片剂、口服液、颗粒剂、丸剂、散剂、丹剂、膏剂等。

本发明的中药制剂，其口服给药的制剂可含有常用的赋形剂，诸如粘合剂、填充剂、稀释剂、压片剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂和湿润剂，

本发明的制剂在使用时根据病人的情况确定用法用量，可每日服三次，每次1-20剂，如：1-20袋或粒或片。

本发明的检测方法是经过筛选获得的，筛选过程如下：

1仪器与试药

1.1仪器

超高效液相-离子阱-飞行时间串联质谱仪(日本岛津公司，包括自动进样器、二元梯度泵、柱温箱、在线脱气机、pda检测器、lc-solution3.6色谱工作站)；电子天平(xs205，瑞士mettlertoledo公司)，milli-q超纯水系统(美国millipore公司)，超声波清洗器(kq-500dv，昆山市超声仪器有限公司)。

1.2药品与试剂

对照品：绿原酸(批号110753-200413)、毛蕊异黄酮葡萄糖苷(批号111920-201505)、金丝桃苷(批号111521-201205)、迷迭香酸(批号111871-201203)、淫羊藿苷(批号110737-200415)、芒柄花素(批号111703-200602)、黄芪甲苷(批号110781-201314)均购自中国食品药品检定研究院；毛蕊异黄酮(批号201304)、紫草酸(批号201309)、芒柄花苷(批号201306)、丹酚酸a(批号201307)、宝霍苷i(批号201102)、箭霍苷b(批号aw412s)、苍术苷a(批号aw413a)、朝霍定a(批号am774e)、朝霍定b(批号am775e)、朝霍定c(批号am776e)购自天津一方科技有限公司；所有对照品质量分数均≥98.0％。芪苓温肾消囊方提取物(批号20150701，天士力研究院现代中药开发中心提供)。黄芪[批号20140425-01，豆科(leguminosae)植物蒙古黄芪astragalusmembranaceus(fisch.)bge.var.mongholicus(bge.)hsiao的干燥根]、淫羊藿[批号20150324，小檗科(berberidaceae)植物淫羊藿epimediumbrevicornumaxim.的干燥叶]、苍术[批号20140430-01，菊科(compositae)植物茅苍术atractylodeslancea(thunb.)dc.的干燥根茎]、茯苓[批号20141250，多孔菌科(polyporaceae)真菌茯苓poriacocos(schw.)wolf的干燥菌核]、丹参[批号20141201，唇形科(labiatae)植物丹参salviamiltiorrhizabge.的干燥根和根茎]均由天士力现代中药资源有限公司提供，药材均经过中国药科大学李萍教授鉴定。

甲醇、乙腈(色谱纯，德国merck公司)，甲酸(色谱纯，上海润捷公司)。

2方法

2.1对照品溶液的制备

称取适量的绿原酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、金丝桃苷、迷迭香酸、紫草酸、芒柄花苷、丹酚酸a、淫羊藿苷、芒柄花素、黄芪甲苷、宝霍苷i、箭霍苷b、苍术苷a、朝霍定a、朝霍定b、朝霍定c对照品于同一量瓶里，加入适量甲醇超声溶解，冷却至室温，定容至刻度，即得混合对照品溶液。

2.2提取物供试品溶液的制备

精密称取芪苓温肾消囊方提取物0.5g，置于具塞锥形瓶内，精密加入30-50％(优优选40％)甲醇10ml，称定质量，超声(功率100w，频率40khz)20-60min(优选40min)，冷却至室温，补足减失质量，摇匀，离心，取上清液过0.22μm滤膜，即得。

2.3单味药材供试品溶液制备

称取芪苓温肾消囊方中各单味药材，按照制备工艺对各药材进行单独提取，根据处方中药材的配比及出膏率，称取适量各药材浸膏干粉，按“2.2”项方法制备，得各药材的供试品溶液。

2.4色谱条件

采用c18色谱柱，流动相：采用0-0.5％(优选0.1％)甲酸水溶液(a)-乙腈(b)，梯度洗脱条件为0～2min，2％b；2～10min，2％～16％b；10～12min，16％b；12～13min，16％～18％b；13～35min，18％～40％b；35～38min，40％～60％b；38～40min，60％～99％b。体积流量0.1-0.6(优选0.4)ml/min；柱温30℃；进样量2μl。

2.5质谱条件

采用电喷雾电离离子源(esi)，正负离子分别检测，扫描范围m/z100～1200，以三氟醋酸钠作校正液，雾化气为高纯氮气，碰撞气为氩气，正负离子分别检测，扫描范围m/z100～1200，离子源温度220-350℃，毛细管电压负离子模式3.0-4.0kv，正离子模式3.5-5.0kv，雾化气体积流量1.2-2.0l/min；优选离子源温度250℃，毛细管电压负离子模式3.5kv，正离子模式4.5kv，雾化气体积流量1.5l/min。

3条件摸索

3.1提取物供试品溶液提取溶剂的考察

考察不同浓度的甲醇和水的提取效果，精密称取芪苓温肾消囊方提取物0.5g，分别用10ml的水、30％甲醇-水(v/v)、40％甲醇-水(v/v)、50％甲醇-水(v/v)、70％甲醇-水(v/v)、100％甲醇作为提取溶剂。结果表明，30-50％甲醇-水(v/v)作为提取溶剂时色谱峰峰形好且峰数多，因此选择30-50％甲醇-水(v/v)作为提取溶剂，40％甲醇-水(v/v)效果最好。结果见图1。

3.2色谱柱的考察

分别考察了acquityuplcbehc18柱、acquityuplchsst3柱、acquityuplchsshilic柱、zorboxrrhdc18柱、zorboxrrhtc18柱、kinetexc18柱、lunac18柱，结果表明，各色谱柱分离出的色谱峰数目多且分离效果均明显，均可应用于本发明。结果见图2

3.3流动相的考察

3.3.1不同洗脱条件

筛选uplc梯度洗脱条件对图谱分离效果的影响。用乙腈-水溶液不同比例，不同洗脱程序进行筛选，不同方案如下，代表色谱图见图3。由结果可知，方案四分离出的色谱峰数目多且分离效果最明显，故选择方案三的洗脱条件。

方案一：

方案二：

方案三：

方案四

3.3.2流动相是否加甲酸：

流动相中加入甲酸之后，峰数明显增多，且峰形和分离度改善。见图4uplc-esi-it-tof/ms分析结果

采用uplc-esi-it-tof/ms技术对芪苓温肾消囊方提取物样品溶液及各个药材溶液进行分析，混合对照品溶液负离子模式下总离子流图见图5，芪苓温肾消囊方的正负离子模式下总离子流图见图6。对处方中5味药材进行了归属研究，色谱图见图7。根据化合物精确相对分子质量、碎片信息、对照品及参考相关文献，共指认36个化合物，具体结果见表1和表2。指认的化合物来源于黄芪、淫羊藿、苍术、丹参4味药材，包括19个黄酮类成分、11个酚酸类成分、4个三萜皂苷类成分、1个倍半萜苷类及1个生物碱类成分。对各类成分的化合物进行了特征解析。

表1芪苓温肾消囊方提取物的uplc-esi--it-tof/ms负离子模式下的数据及化合物归属

^*经过对照品确证；a-黄芪b-淫羊藿c-苍术d-茯苓e-丹参，下表同

表2芪苓温肾消囊方提取物的uplc-esi⁺-it-tof/ms正离子模式下的数据及化合物归属

4.1黄酮类化合物解析

7号峰(tr14.695min)的一级正负离子分别给出m/z447[m+h]⁺和m/z491[m+hcoo]^-的峰，确定化合物相对分子质量446，且此峰归属于黄芪药材。与对照品比对，确定7号峰是毛蕊异黄酮葡萄糖苷。

16号峰(tr20.267min)的一级正负离子分别给出m/z663[m+h]⁺和m/z661[m－h]^-的峰，确定化合物相对分子质量662，且此峰归属于淫羊藿药材。二级质谱以m/z663为母离子失去鼠李糖基产生m/z517[m+h－rha]⁺的碎片；进一步失去葡萄糖基产生m/z355[m+h－rha－glc]⁺的碎片，即苷元；苷元失去c4h8得到m/z299的碎片离子。以m/z661为母离子失去鼠李糖基和葡萄糖基产生m/z353[m－h－rha－glc]^-的碎片离子，确定16号峰是淫羊藿苷a。

4.2酚酸类化合物解析

17号峰(tr20.932min)的一级负离子给出m/z717[m－h]^-的峰，且归属于丹参药材，推测17号峰是丹酚酸b。以m/z717为母离子断裂失去1分子丹参素产生m/z519，继续失去1分子丹参素形成m/z321^[13]的碎片离子。

4.3三萜皂苷类化合物解析

37号峰(tr37.568min)和38号峰(tr38.043min)的2个峰归属于黄芪药材，且都有m/z891[m+na]⁺峰，m/z867[m－h]^-峰和m/z913[m+hcoo]^-峰，确定相对分子质量为868，二者属于同分异构体，根据二者极性，推测37号峰为黄芪皂苷i，38号峰为异黄芪皂苷i。

4.4倍半萜苷类化合物解析

3号峰(tr9.465min)的一级正负离子分别给出m/z471[m+na]⁺峰和m/z493[m+hcoo]^-峰，计算分子式为c21h36o10，对照各个药材紫外色谱图的保留时间，此峰归属于苍术药材。与对照品比对，确定3号峰为苍术苷a。

4.5生物碱类化合物解析

6号峰(tr11.909min)的一级正离子给出m/z342[m+h]⁺峰，它的二级碎片离子有m/z297[m－(ch3)2nh]⁺和m/z265[m－(ch3)2nh－ch3oh]⁺，且此峰归属于淫羊藿药材，推测6号峰为木兰碱。

本发明分别针对不同的提取溶剂和不同的流动相进行了考察，最终确定30-50％甲醇超声提取效果最好，以0～0.5％甲酸水溶液-乙腈为流动相各色谱峰峰形及分离度最好。本方中的黄酮类成分在正离子模式下响应好，丹参药材中的酚酸类成分在负离子模式下响应较好，因此采用正负离子模式同时对芪苓温肾消囊方提取物进行检测，从而获得化学成分全面的质谱信息。

中药复方一般由多味药材组成，化学成分复杂，加上对照品价格昂贵，很难实现对复方提取物的定性定量研究。本研究采用uplc-esi-it-tof/ms方法可以获得化学成分的多级质谱碎片，从而推测其化学组成，为中药复方的化学成分分析提供了一种快速有效的方法。该方法已被广泛应用于中药复方研究的各个方面。

本研究对芪苓温肾消囊方提取物的化学成分进行全面解析，发现其所含有的主要成分与文献中报道的多囊卵巢综合征相关药理活性成分具有良好的一致性，从而在一定程度上体现潜在的药效物质基础和组方的合理性。

附图说明：

图1不同提取溶剂的uplc色谱图，其中从下到上依次为水、30％甲醇-水、40％甲醇-水、50％甲醇-水、70％甲醇-水、100％甲醇

图2不同色谱柱的uplc色谱图，其中从下到上依次为acquityuplcbehc18柱、acquityuplchsst3柱、acquityuplchsshilic柱、zorboxrrhdc18柱、zorboxrrhtc18柱、kinetexc18柱、lunac18柱

图3不同洗脱系统的uplc色谱图。

图3从下到上依次为方案一、二、三、四

图4流动相筛选uplc色谱图其中从上到下依次为0.5％甲酸、0.2％甲酸、0.1％甲酸、未加甲酸

3-苍术苷a4-绿原酸7-毛蕊异黄酮葡萄糖苷8-金丝桃苷12-迷迭香酸14-紫草酸15-芒柄花苷19-毛蕊异黄酮20-丹酚酸a22-朝霍定a23-朝霍定b24-朝霍定c25-淫羊藿苷28-芒柄花素31-黄芪甲苷34-箭霍苷b36-宝霍苷i

图5混合对照品溶液负离子模式下总离子流图

图6芪苓温肾消囊方提取物uplc-esi-it-tof/ms的负(a)、正(b)离子流图

图7芪苓温肾消囊方提取物及各个药材uplc色谱图(254nm)

a-芪苓温肾消囊方提取物b-黄芪提取物c-淫羊藿提取物d-苍术提取物e-茯苓提取物f-丹参提取物

具体实施方式：

以下通过实施例进一步说明本发明。

实施例1

对照品溶液的制备

称取适量的绿原酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、金丝桃苷、迷迭香酸、紫草酸、芒柄花苷、丹酚酸a、淫羊藿苷、芒柄花素、黄芪甲苷、宝霍苷i、箭霍苷b、苍术苷a、朝霍定a、朝霍定b、朝霍定c对照品于同一量瓶里，加入适量甲醇超声溶解，冷却至室温，定容至刻度，即得混合对照品溶液。

供试品溶液的制备

精密称取芪苓温肾消囊方提取物0.5g，置于具塞锥形瓶内，精密加入30-50％甲醇10ml，称定质量，超声(功率100w，频率40khz)20-60min，冷却至室温，补足减失质量，摇匀，离心，取上清液过0.22μm滤膜，即得。

步骤3，将对照品溶液和供试品溶液注入超高效液相色谱仪，得到色谱图，

步骤4，根据色谱图计算供试品中有效成分的含量。

色谱条件

采用c18色谱柱，流动相：采用0-0.5％甲酸水溶液(a)-乙腈(b)，梯度洗脱条件为0～2min，2％b；2～10min，2％～16％b；10～12min，16％b；12～13min，16％～18％b；13～35min，18％～40％b；35～38min，40％～60％b；38～40min，60％～99％b。体积流量0.1-0.6ml/min；柱温30℃；进样量2μl。

实施例2

步骤如下：

(1)对照溶液的制备：称取适量的绿原酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、金丝桃苷、迷迭香酸、紫草酸、芒柄花苷、丹酚酸a、淫羊藿苷、芒柄花素、黄芪甲苷、宝霍苷i、箭霍苷b、苍术苷a、朝霍定a、朝霍定b、朝霍定c对照品于同一量瓶里，加入40％甲醇超声溶解，冷却至室温，定容至刻度，即得混合对照品溶液。所得溶液中，各种成分的浓度依次为：0.062、0.057、0.0106、0.047、0.063、0.0195、0.02、0.059、0.038、0.0201、0.0238、0.0164、0.0354、0.0182、0.075、0.09、0.084mg/ml

(2)供试品溶液的制备：

精密称取芪苓温肾消囊制剂0.5028g，粉碎后加入40％甲醇，超声20-60min，冷却至室温，摇匀，离心，取上清液过0.22μm滤膜，用40％甲醇定容到25ml，即得样品供试品溶液20.11mg/ml

步骤3，将对照品溶液和供试品溶液注入超高效液相色谱仪，得到色谱图，

步骤4，根据色谱图计算供试品中有效成分的含量。

其中超高液相色谱条件如下：采用c18色谱柱，流动相：采用0.1％甲酸水溶液-乙腈，梯度洗脱，体积流量0.4ml/min；柱温30℃；