一种基于光谱分辨原理的电致化学发光多组分免疫检测方法与流程

本发明涉及一种电致化学发光(electrogenerated chemiluminescence,ECL)多组分免疫检测方法，尤其涉及一种以巯基丙酸和六偏磷酸钠包被的CdSe量子点和CdTe量子点为标记物的多组分免疫检测方法。

背景技术：

电致化学发光(electrogenerated chemiluminescence,ECL)是一种已在生化分析和临床诊断领域获得广泛应用的分析技术。例如，罗氏公司开发的基于钌联吡啶/正三丙胺ECL体系的试剂盒已经可以用于肿瘤标志物、激素等80余种项目的临床诊断。研究显示，量子点具有优异的光电特性，开发新型ECL生化分析和临床诊断技术提供了可能(参见：Analyst,2013，138，43-61)。例如，中国专利文件CN102749452A(ZL 201210262285.7)公开了一种以近红外CdTe量子点为标记物的近红外电致化学发光免疫检测方法，该方法基于电位扫描驱动和检测ECL总强度的工作原理，可以通过夹心免疫反应实现对甲胎蛋白的ECL免疫检测。Liu等人以双稳定剂包被CdSe量子点修饰玻碳电极为载体构建一种新型单色量子点ECL传感策略，并实现对多巴胺的灵敏检测(参见：Anal.Chem.2014,86,2784-2788)。

由于单组分分析容易造成假阳性或假阴性结果，医疗工作者通常采用多指标联合检测的方式提高诊断准确度。然而，常规ECL分析以光电倍增管为检测器，采用检测ECL辐射总强度的工作方式，无法区分来自不同ECL物质的辐射信号，不能开展多组分分析。因此，在实际工程中，医疗工作人员只能采用多次平行执行单组分ECL分析的模式获得所需的多指标信息。该分析模式耗时长，试剂和样品消耗量大，并非理想的分析模式。

基于光谱分辨原理的ECL多组分免疫检测研究尚处于空白状态，与之相关的ECL分析技术仍处于待开发状态。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明以巯基丙酸和六偏磷酸钠包被的量子点尤其是以ECL辐射波长为550nm的CdSe量子点和ECL辐射波长分别为660和780nm的CdTe量子点为标记物，基于光谱分辨原理同时采集和识别不同标记物的ECL信号，发展了一种ECL多组分分析方法。本发明所构建的ECL检测方法具有ECL辐射强、灵敏度高、选择性好，可同时进行多指标检测的特点。

术语说明：

巯基丙酸和六偏磷酸钠包被的CdSe量子点：根据已公开专利文献CN102766463A中描述的方法得到，该专利文献的专利号为(ZL 201210275877.2)。

巯基丙酸和六偏磷酸钠包被的CdTe量子点：根据已公开专利文献CN101870459A中描 述的方法得到，该专利文献的专利号为(ZL201010197865.3)。

抗原：本发明所述的抗原指：甲胎蛋白抗原，癌胚抗原，糖类抗原125，糖类抗原15-3，糖类抗原72-4，糖类抗原19-9，前列腺特异性抗原，游离前列腺特异抗原，爱滋病抗原，乙肝表面抗原，乙肝e抗原，甲状腺球蛋白，肌钙蛋白T抗原，肌红蛋白抗原等常规的抗原。

一抗：本发明所述的一抗指：对上述抗原对应产生的抗体，本发明对于上述抗原对应的单克隆抗体效果更好。

二抗：本发明所述的二抗指：对上述抗原和一抗对应产生的二抗。

本发明的技术方案如下：

一种基于光谱分辨原理的电致化学发光多组分免疫检测方法，包括步骤如下：

(1)多种量子点标记相应二抗的制备

向含有巯基丙酸和六偏磷酸钠包被的多种量子点水溶液中加入含有1-乙基-3,3-二甲基氨丙基碳化二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺的缓冲溶液进行活化，离心纯化并分散在磷酸盐缓冲溶液中；然后加入相应二抗和小牛血清白蛋白，室温孵育2-3h后离心纯化，所得沉淀物分散在磷酸盐缓冲溶液中，得多种量子点标记的相应二抗；

(2)以多种量子点为标记物的多组分ECL免疫传感器的制备

a、将玻碳电极抛光处理后，置于含对氨基苯甲酸的磷酸盐缓冲溶液中，在0.4～1.2V的电位范围内进行循环伏安扫描，制得对氨基苯甲酸修饰的玻碳电极，再用含有1-乙基-3,3-二甲基氨丙基碳化二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺的缓冲溶液进行活化，得修饰并活化后的玻碳电极；

b、向修饰并活化后的玻碳电极表面滴加含一抗的缓冲溶液，室温下孵育1-4h后用pH＝7.4的磷酸盐缓冲溶液清洗，再用小牛血清蛋白封闭未反应的活性位点并用磷酸盐缓冲溶液清洗；

c、将抗原滴加到步骤b处理后的电极表面，室温下孵育1-4h，清洗电极；再将多种量子点标记的二抗滴加到步骤b处理后的电极表面，室温下孵育1-4h，清洗电极；制得以多种量子点为标记物的多组分ECL免疫传感器；

(3)多组分ECL免疫检测

i、以步骤(2)制得的多种量子点为标记物的多组分ECL免疫传感器为工作电极，铂电极为对电极、Ag/AgCl电极为参比电极，在含0.01-0.1mol/L过硫酸铵的磷酸盐缓冲溶液中，对一系列标准浓度的多种抗原溶液进行电致化学发光光谱测试，绘制每种抗原的工作曲线；

ii、将待测样品溶液按照步骤i中的方法进行电致化学发光光谱测试，根据所得电致化学发光光谱的信号对应工作曲线，得到待测样品溶液中多种抗原的浓度。

根据本发明，优选的，步骤(1)中巯基丙酸和六偏磷酸钠包被的多种量子点的数目为两种以上；进一步优选的，巯基丙酸和六偏磷酸钠包被量子点为巯基丙酸和六偏磷酸钠包被 的CdSe量子点、巯基丙酸和六偏磷酸钠包被的CdTe量子点。本发明中巯基丙酸和六偏磷酸钠包被的量子点制备过程不同，得到的量子点也不同。例如：同样是巯基丙酸和六偏磷酸钠包被的CdTe量子点，其合成时回流时间不同，得到的巯基丙酸和六偏磷酸钠包被的CdTe量子点ECL波长不同，从而具有不同的ECL光谱信号。

根据本发明，进一步优选的，步骤(1)中所述的巯基丙酸和六偏磷酸钠包被的CdSe量子点的水溶液按如下方法制备得到：

室温下，搅拌条件下，向0.1-0.3mol/L CdCl₂溶液中依次加入六偏磷酸钠和巯基丙酸，用NaOH调节溶液pH至8.0，加入Na₂SeO₃，加热回流5-15min后，加入N₂H₄·H₂O，加热回流反应8-12h，即得巯基丙酸和六偏磷酸钠包被的CdSe量子点的水溶液；

制备过程中Cd：MPA：HMP：Se：N₂H₄·H₂O的摩尔比为1：(0.05-0.2)：(0.3-0.7)：(2-3)：400。

根据本发明，进一步优选的，步骤(1)中所述的巯基丙酸和六偏磷酸钠包被的CdTe量子点的水溶液按如下方法制备得到：

室温下，搅拌条件下，向0.1-0.3mol/L CdCl₂溶液中依次加入六偏磷酸钠和巯基丙酸，用NaOH调节溶液pH至8.0，加入Na₂TeO₃，加热回流5-15min后，加入N₂H₄·H₂O，分别加热回流反应4h、25h，即得不同回流反应时间的巯基丙酸和六偏磷酸钠包被的CdTe量子点的水溶液；

制备过程中Cd：MPA：HMP：Te：N₂H₄·H₂O的摩尔比为1：2.5：2.1：0.15：260。

根据本发明，优选的，步骤(1)中所述的巯基丙酸和六偏磷酸钠包被的CdSe量子点的荧光辐射范围为540nm-560nm，更优选550nm。

根据本发明，优选的，步骤(1)中所述的回流反应4h的巯基丙酸和六偏磷酸钠包被的CdTe量子点的荧光辐射范围为640nm-660nm，更优选650nm。

根据本发明，优选的，步骤(1)中所述的回流反应25h的巯基丙酸和六偏磷酸钠包被的CdTe量子点的荧光辐射范围为770nm-790nm，更优选780nm。

根据本发明，优选的，步骤(1)中所述的小牛血清白蛋白的体积分数为1-5％。

根据本发明，优选的，步骤(2)的b中，所述的小牛血清白蛋白的体积分数为1-3％；

优选的，步骤(2)的c中，所述的抗原为甲胎蛋白抗原、癌胚抗原、糖类抗原125、糖类抗原15-3、糖类抗原72-4、糖类抗原19-9、前列腺特异性抗原、游离前列腺特异抗原、爱滋病抗原、乙肝表面抗原、乙肝e抗原、甲状腺球蛋白、肌钙蛋白T抗原或肌红蛋白抗原。

根据本发明，优选的，步骤(1)、(2)、(3)中所述的缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液、Tris～HCl缓冲溶液或B～R缓冲溶液中的一种；所述的磷酸盐缓冲溶液为K₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲溶液。

本发明用多种量子点标记相应二抗，就可以检测多种抗原组分，例如：用三种不同的量 子点标记相应二抗，就可以同时检测三种抗原组分。本发明最后的电致化学发光检测是基于光谱分辨原理的电致化学发光检测，这样才能在一个电极中同时实现多种组分的检测；如果采用一种基于电位扫描驱动和检测辐射总强度原理的近红外电致化学发光免疫检测方法，即使使用多种量子点标记相应二抗也无法在一个电极上实现多组分的检测。其每个分析流程只测定其中一种组分含量，多次平行执行该流程，最后得到所有所需组分含量。该分析模式所需时间长，试剂消耗多，且工作量过大，并非理想的分析模式。

本发明中电致化学发光光谱测试可参考使用CN201610224510.6公开的设备进行。

本发明的原理：

本发明采用巯基丙酸和六偏磷酸钠包被的多种量子点为标记物，其ECL辐射单色性良好。

本发明采用的巯基丙酸和六偏磷酸钠包被的多种量子点表面均带有羧基，采用1-乙基-3,3-二甲基氨丙基碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺活化量子点表面的羧基后，与二抗的氨基反应，将量子点标记到二抗上，采用小牛血清蛋白对量子点表面未反应的活性位点进行封闭。

本发明通过电聚合的方法使玻碳电极与对氨基苯甲酸形成碳氮键将对氨基苯甲酸修饰在玻碳电极上，得到表面具有羧基修饰的玻碳电极，与一抗中氨基反应得到表面有一抗修饰的玻碳电极，通过抗原抗体的特异性结合将抗原和量子点修饰的二抗修饰到电极表面。

本发明的有益效果：

1、本发明利用多种量子点作为标记物，可同时检测多种抗原。较传统分析模式所需时间短，试剂、样品消耗少且工作量小。

2、本发明方法的选择性高。本发明构建的电化学发光免疫传感器是基于抗原和抗体之间的特异性识别和结合构建的，因此待测液中的干扰蛋白并不能与抗原第一抗体和第二抗体结合，对本发明检测体系无干扰。

3、本发明方法操作简单，重复性好。对临床早期诊断癌症具有重要的科学意义和应用价值。

4、本发明方法采用巯基丙酸和六偏磷酸钠包被的量子点为标记物，此类量子点ECL辐射信号强，单色性好，有利于获得较高的检测灵敏度和不同ECL标记物之间的信号识别。本发明方法的癌胚抗原检测限达到1.0pg/mL，前列腺特异抗原检测限达到10.0pg/mL，甲胎蛋白抗原检测限达到10.0fg/mL。

附图说明

图1为本发明实施例中所制得巯基丙酸和六偏磷酸钠包被的CdSe量子点的荧光光谱图(a)和紫外-可见吸收光谱图(b)。

图2为本发明实施例中所制得巯基丙酸和六偏磷酸钠包被的CdSe量子点的ECL光谱图。

图3为本发明实施例中所制得巯基丙酸和六偏磷酸钠包被的回流时间为4h的CdTe量子点的荧光光谱图(a)和紫外-可见吸收光谱图(b)。

图4为本发明实施例中所制得巯基丙酸和六偏磷酸钠包被的回流时间为4h的CdTe量子点的ECL光谱图。

图5为本发明实施例中所制得巯基丙酸和六偏磷酸钠包被的回流时间为25h的CdTe量子点的荧光光谱图(a)和紫外-可见吸收光谱图(b)。

图6为本发明实施例中所制得巯基丙酸和六偏磷酸钠包被的回流时间为25h的CdTe量子点的ECL光谱图。

图7为本发明实施例1中制得的癌胚抗原浓度为10.0ng/mL时以CdSe量子点为标记物,前列腺特异抗原浓度为100.0ng/mL时以回流时间4h CdTe量子点为标记物,甲胎蛋白抗原浓度为100.0pg/mL时以回流时间25h CdTe量子点为标记物的光谱型多组分免疫传感器的ECL光谱图。

图8为本发明实施例1中制得的癌胚抗原浓度为1.0ng/mL时以CdSe量子点为标记物,前列腺特异抗原浓度为10.0ng/mL时以回流时间4h CdTe量子点为标记物,甲胎蛋白抗原浓度为10.0pg/mL时以回流时间25h CdTe量子点为标记物的光谱型多组分免疫传感器的ECL光谱图。

图9为本发明实施例1中制得的癌胚抗原浓度为100.0pg/mL时以CdSe量子点为标记物,前列腺特异抗原浓度为1.0ng/mL时以回流时间4h CdTe量子点为标记物,甲胎蛋白抗原浓度为1.0pg/mL时以回流时间25h CdTe量子点为标记物的光谱型多组分免疫传感器的ECL光谱图。

图10为本发明实施例1中制得的癌胚抗原浓度为20.0pg/mL时以CdSe量子点为标记物,前列腺特异抗原浓度为200.0pg/mL时以回流时间4h CdTe量子点为标记物,甲胎蛋白抗原浓度为200.0fg/mL时以回流时间25h CdTe量子点为标记物的光谱型多组分免疫传感器的ECL光谱图。

图11为本发明实施例1中制得的癌胚抗原浓度为10.0pg/mL时以CdSe量子点为标记物,前列腺特异抗原浓度为100.0pg/mL时以回流时间4h CdTe量子点为标记物,甲胎蛋白抗原浓度为100.0fg/mL时以回流时间25h CdTe量子点为标记物的光谱型多组分免疫传感器的ECL光谱图。

图12为本发明实施例1中制得的癌胚抗原浓度为2.0pg/mL时以CdSe量子点为标记物,前列腺特异抗原浓度为20.0pg/mL时以回流时间4h CdTe量子点为标记物,甲胎蛋白抗原浓度为20.0fg/mL时以回流时间25h CdTe量子点为标记物的光谱型多组分免疫传感器的ECL光谱图。

图13为本发明实施例1中制得的癌胚抗原浓度为1.0pg/mL时以CdSe量子点为标记物,前列腺特异抗原浓度为10.0pg/mL时以回流时间4h CdTe量子点为标记物,甲胎蛋白抗原浓 度为10.0fg/mL时以回流时间25h CdTe量子点为标记物的光谱型多组分免疫传感器的ECL光谱图。

图14为本发明实施例1中癌胚抗原的工作曲线。

图15为本发明实施例1中前列腺特异抗原的工作曲线。

图16为本发明实施例1中甲胎蛋白抗原的工作曲线。

具体实施方式

以下结合具体实施例和附图对本发明做进一步说明，但不限于此。

实施例中所用的原料均为常规原料，所用设备均为常规设备，市购产品。

其中：紫外-可见吸收光谱由北京普析通用仪器有限公司生产的TU-1901双光束紫外可见分光光度计采集，荧光光谱由天津港东科技发展股份有限公司生产的F-320荧光分光光度计采集。

实施例中所采用的癌胚抗原单克隆抗体、抗原及二抗，前列腺特异抗原单克隆抗体、抗原及二抗，甲胎蛋白抗原单克隆抗体、抗原及二抗均购自北京科跃中楷生物科技有限公司。

实施例中的ECL光谱测试采用将VersaSTAT 3型电化学分析仪与Acton SP-2300型CCD光栅光谱仪联用的方式实现，所采用的电势窗口为0～-1.6V，扫描速度为50mV/s，初扫向负；可参见：中国专利文件CN201610224510.6公开的设备。

实施例中所用的缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液(K₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲溶液)，pH＝7.4，0.01mol/L。

实施例中所用的巯基丙酸和六偏磷酸钠包被的CdSe量子点的水溶液按如下方法制备得到：

室温下，搅拌条件下，向0.2mol/L CdCl₂溶液中依次加入六偏磷酸钠和巯基丙酸，用NaOH调节溶液pH至8.0，加入Na₂SeO₃，加热回流10min后，加入N₂H₄·H₂O，加热回流反应10h，即得巯基丙酸和六偏磷酸钠包被的CdSe量子点的水溶液；制备过程中Cd：MPA：HMP：Se：N₂H₄·H₂O的摩尔比为1：0.1：0.5：2：400。巯基丙酸和六偏磷酸钠包被的CdSe量子点的荧光光谱图和紫外-可见吸收光谱图如图1所示，ECL光谱图如图2所示。

实施例中所用的巯基丙酸和六偏磷酸钠包被的CdTe量子点的水溶液按如下方法制备得到：

室温下，搅拌条件下，向0.2mol/L CdCl₂溶液中依次加入六偏磷酸钠和巯基丙酸，用NaOH调节溶液pH至8.0，加入Na₂TeO₃，加热回流10min后，加入N₂H₄·H₂O，分别加热回流反应4h、25h，即得不同回流反应时间的巯基丙酸和六偏磷酸钠包被的CdTe量子点的水溶液；制备过程中Cd：MPA：HMP：Te：N₂H₄·H₂O的摩尔比为1：2.5：2.1：0.15：260。巯基丙酸和六偏磷酸钠包被的回流时间为4h的CdTe量子点的荧光光谱图和紫外-可见吸收光谱图如图3所示，ECL光谱图如图4所示。巯基丙酸和六偏磷酸钠包被的回流时间为25h的CdTe量子点的荧光光谱图和紫外-可见吸收光谱图如图5所示，ECL光谱图如图6所示。

实施例1、

一种基于光谱分辨原理的电致化学发光多组分免疫检测方法，包括步骤如下：

(1)三种量子点标记相应二抗的制备

向100μL巯基丙酸和六偏磷酸钠包被的CdSe量子点水溶液中加入10μL含100mg/mL1-乙基-3,3-二甲基氨丙基碳化二亚胺的磷酸盐缓冲溶液和10μL含100mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺的磷酸盐缓冲溶液，室温下反应30min；12000rpm离心纯化后，取沉淀物加100μL磷酸盐缓冲溶液超声分散，取15μL上述活化好的CdSe量子点溶液加入150μL 100μg/mL的癌胚抗原二抗，室温下振荡3h；再加入20μL 1％体积浓度的小牛血清白蛋白，室温孵育1h，12000rpm离心纯化后，取沉淀物加100μL磷酸盐缓冲溶液分散，得CdSe量子点标记的癌胚抗原二抗，于4℃冰箱中储存备用；

向1mL巯基丙酸和六偏磷酸钠包被的回流时间4h CdTe量子点的水溶液中加入10μL含100mg/mL 1-乙基-3,3-二甲基氨丙基碳化二亚胺的磷酸盐缓冲溶液和10μL含100mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺的磷酸盐缓冲溶液，室温下反应30min；12000rpm离心纯化后，取沉淀物加100μL磷酸盐缓冲溶液超声分散，取上述溶液加入175μL 1000μg/mL的前列腺特异抗原二抗，室温下振荡2h；再加入20μL 1％体积浓度的小牛血清白蛋白，室温孵育1h，12000rpm离心纯化后，取沉淀物加100μL磷酸盐缓冲溶液分散，得回流反应时间为4h的CdTe量子点标记的前列腺特异抗原二抗，于4℃冰箱中储存备用；

向100μL巯基丙酸和六偏磷酸钠包被的回流时间25h CdTe量子点水溶液中加入10μL含100mg/mL 1-乙基-3,3-二甲基氨丙基碳化二亚胺的磷酸盐缓冲溶液和10μL含100mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺的磷酸盐缓冲溶液，室温下反应30min；12000rpm离心纯化后，取沉淀物加100μL磷酸盐缓冲溶液超声分散，取5μL上述活化好的CdTe量子点溶液加入150μL100μg/mL的甲胎蛋白抗原二抗，室温下振荡3h；再加入20μL 1％体积浓度的小牛血清白蛋白，室温孵育1h，12000rpm离心纯化后，取沉淀物加100μL磷酸盐缓冲溶液分散，得回流反应时间为25h的CdTe量子点标记的甲胎蛋白抗原二抗，于4℃冰箱中储存备用；

(2)以三种量子点为标记物的多组分ECL免疫传感器的制备

a、将直径为5mm的玻碳电极用0.3μm的三氧化二铝抛光处理，超纯水冲洗干净后，置于含1mmol/L对氨基苯甲酸的磷酸盐缓冲溶液中，在0.4～1.2V的电位范围内进行循环伏安扫描，扫速为10mV/s，扫描段为4，制得对氨基苯甲酸修饰的玻碳电极，将上述所得的电极用无水乙醇和超纯水依次冲洗干净后，在电极上滴加含有100mg/mL的1-乙基-3,3-二甲基氨丙基碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的磷酸盐缓冲溶液各10μL，室温下反应30min，将所得电极用磷酸盐缓冲溶液冲洗干净，得修饰并活化后的玻碳电极；

b、向修饰并活化后的玻碳电极表面滴加含癌胚抗原一抗、前列腺特异抗原一抗和甲胎蛋白抗原一抗的磷酸盐缓冲溶液，室温下孵育1h后用磷酸盐缓冲溶液清洗，再用20μL 1％体积浓度的小牛血清白蛋白封闭未反应的活性位点并用磷酸盐缓冲溶液清洗；

c、将抗原滴加到步骤b处理后的电极表面，室温下孵育1-4h，清洗电极；将三种量子点分别标记的癌胚抗原二抗、前列腺特异抗原二抗、甲胎蛋白抗原二抗滴加到步骤b处理后的电极表面，室温下孵育1.5h，清洗电极；制得以三种量子点为标记物的多组分ECL免疫传感器；

(3)进行多组分ECL免疫检测

i、以步骤(2)制得的三种量子点为标记物的多组分ECL免疫传感器为工作电极，铂电极为对电极、Ag/AgCl电极为参比电极，在含0.1mol/L过硫酸铵的磷酸盐缓冲溶液中，对一系列标准浓度的癌胚抗原(10.0ng/mL、1.0ng/mL、100.0pg/mL、20.0pg/mL、10.0pg/mL、2.0pg/mL、1.0pg/mL)、前列腺特异抗原(100.0ng/mL、10.0ng/mL、1.0ng/mL、200.0pg/mL、100.0pg/mL、20.0pg/mL、10.0pg/mL)、甲胎蛋白抗原(100.0pg/mL、10.0pg/mL、1.0pg/mL、200.0fg/mL、100.0fg/mL、20.0fg/mL、10.0fg/mL)三种抗原溶液分别进行电致化学光谱测试，测得的电化学发光光谱图如图7-13所示；然后绘制每种抗原的工作曲线，如图14、图15、图16所示；

ii、将含有多种抗原的待测样品溶液按照步骤i中的方法进行电致化学发光光谱测试，根据所得电致化学发光光谱的信号强度对应工作曲线，得到待测样品溶液中多种抗原的浓度。

实施例2、

一种基于电致化学发光多组分免疫检测方法，步骤同实施例1，不同的是：

将癌胚抗原、前列腺特异抗原、甲胎蛋白抗原分别用糖类抗原125、糖类抗原15-3、糖类抗原72-4代替。

实施例3、

一种基于电致化学发光多组分免疫检测方法，步骤同实施例1，不同的是：

将癌胚抗原、前列腺特异抗原、甲胎蛋白抗原分别用糖类抗原19-9、游离前列腺特异抗原、爱滋病抗原代替。

实施例4、

一种基于电致化学发光多组分免疫检测方法，步骤同实施例1，不同的是：

将癌胚抗原、前列腺特异抗原、甲胎蛋白抗原分别用乙肝表面抗原、乙肝e抗原、甲状腺球蛋白抗原代替。

实施例5、

一种基于电致化学发光多组分免疫检测方法，步骤同实施例1，不同的是：

将癌胚抗原、前列腺特异抗原分别用肌钙蛋白T抗原、肌红蛋白抗原代替。

实施例6、

一种基于电致化学发光多组分免疫检测方法，步骤同实施例1，不同的是：

所用的小牛血清白蛋白的体积分数均为2％。