本发明属于农业领域，专利代码为A99；具体涉及土壤中易被植物根系吸收，并能进入农业生产收获品中，影响农产品质量的土壤活性态砷、铋、锑的分析检测方法。
背景技术：
土壤重金属主要包括镉（Cd）、汞（Hg）、砷（As）、铅（Pb）、铬（Cr）、铜（Cu）、锌（Zn）、镍（Ni）、硒（Se）、锑（Sb）、铋（Bi）等重金属元素；重金属在土壤中的存在形态可分为五类，第一是存在于硅酸盐、原生和次生矿物等土壤晶格中，是自然地质风化过程的结果，在自然界正常条件下不易释放，能长期稳定在沉积物中，不易为植物吸收；其次是铁锰氧化物结合态重金属，是以矿物的外囊物和细粉散颗粒存在，活性的铁锰氧化物比表面积大,吸附或共沉淀阴离子而成；第三是碳酸盐结合态重金属，是土壤中重金属元素在碳酸盐矿物上形成的共沉淀结合态；固定在土壤晶体中，或与土壤中其它物质结合成难溶状态的重金属不具备生物有效活性，不能被植物吸收而进入食物链；第四是有机结合态重金属，它是土壤中各种有机物及矿物颗粒的包裹层等与土壤中重金属螯合物，螯合程度决定了该重金属是否能被植物吸收；第五种形态是土壤中可交换态重金属，它是吸附在粘土表面、腐殖质及其它成分上的金属，它对环境变化敏感,易于迁移转化，能被植物吸收，最能反映土壤生物毒性。
土壤中可交换态重金属及有机结合态重金属具有相当强的活动性和生物可利用性，重金属能够对植物产生毒害作用，引起株高度、主根长度、叶面积等一系列生理特征的改变，从而影响到植物生理生态过程、产量和品质；它们可以在生物体内积蓄，导致农作物中毒、减产、直至死亡，影响生态系统的安全性；最后通过食物链进入人体，直接对人体健康造成威胁；人体中过量的砷会干扰细胞的正常代谢，影响呼吸和氧化过程，使细胞发生病变，砷还会直接损伤小动脉和毛细血管壁，并作用于血管舒缩中枢，导致血管渗透性增加，引起血容量降低，加重脏器损害；铋可累积在人体的肾脏，而引起慢性中毒；锑对人体及环境生物具有毒性作用，甚至被怀疑为致癌物，锑及其化合物已经被许多国家列为重点污染物，急性锑中毒可以造成皮肤黏膜、心脏、肝脏、肺及神经系统等多个组织器官的损害。
在土壤中砷主要有三价和五价的无机砷；锑的化学形态有无机和有机的形式，无机形态化合价为为+3和+5，有机形态主要是化合价为+5的三甲基锑化合物；GB5749-2006生活饮用水卫生标准规定，砷浓度不得超过0.01mg/L，锑浓度不得超过0.005 mg/L；GB3838-2002地面水环境质量标准砷全量Ⅰ类～Ⅲ类≤0.05mg/L、Ⅳ～Ⅴ类水0.05～0.10mg/L；GB15618-2008土壤环境质量标准农田总砷二级标准值为20～45mg/kg，总锑二级标准值为10mg/kg。
现用土壤重金属砷、铋、锑分析检测方法是测定土壤中重金属的全量，按照国家标准，土样经硝酸-盐酸-高氯酸消解后，在酸性介质中，试样中砷、铋、锑被硼氢化钾（KBH4）或硼氢化钠（NaBH4）还原成原子态砷、铋、锑，由载气（氩气）带入原子化器中，在特制砷、铋、锑空心阴极灯照射下，基态砷、铋、锑原子被激发至高能态，在去活化回到基态时，发射出特征波长的荧光，其荧光强度与砷、铋、锑含量成正比，与标准系列比较定量；但是目前测定方法的土壤全砷、全铋、全锑含量只有一部分能通过植物根系进入植物体内，其余部分是固定在土壤晶体中、或与土壤中其它物质结合成难溶状态，不具备生物有效活性，因此测定结果不能代表土壤活性态砷、铋、锑对植物吸收的影响状态。
本专利是在对秦岭巴山区域土壤重金属砷、铋、锑全量、土壤活性态砷、铋、锑与农产品重金属砷、铋、锑全量进行分析的基础上，研究土壤重金属全量、活性态含量与农业产出品中重金属砷、铋、锑全量的相关性，创建了“一种土壤活性态砷、铋、锑的检测方法”，该分析方法检出的土壤活性态砷、铋、锑含量能最大限度反映出土壤重金属砷、铋、锑与植物吸收之间的关系，表征土壤重金属污染状态；经检索国内外相关文献，未发现有与“一种土壤活性态砷、铋、锑的检测方法”相同内容的报道。
技术实现要素：
土壤活性态砷、铋、锑的检测分析采用二乙三胺五乙酸浸提—原子荧光光谱仪检测法；采用二乙三胺五乙酸-氯化钙-三乙醇胺缓冲溶液作为浸提剂，螯合浸提出土壤活性态砷、铋、锑，用原子荧光光谱仪法测定；其中适量的二乙三胺五乙酸为螯合剂，适量的氯化钙中钙离子为螯合浸提平衡剂，氯离子防止石灰性土壤中游离碳酸钙的溶解，避免因碳酸钙所包蔽的砷、铋、锑元素释放而产生的影响；适量的三乙醇胺作为缓冲剂，能使溶液pH保持7.3左右，同时三乙醇胺对碳酸钙溶解也有抑止作用。
在2：1的水土比前提下，尽可能增加土壤样品数量以保证土壤中含量很低的土壤活性态砷、铋、锑的检出；称取通过2mm孔径尼龙筛的风干试样20.00g于200mL塑料瓶中，加入25℃±2℃的二乙三胺五乙酸-氯化钙-三乙醇胺浸提剂40mL，盖好瓶盖，摇匀，在25℃±2℃的条件下，以180r•min-1±20r•min-1的频率振荡2h，振荡液用离心机离心5分钟后立即过滤，保留滤液并在48h内完成测定，同时做空白试验。
采用超低质量浓度标准曲线，尽可能发挥原子荧光光谱仪超微量元素检测功能，以保证土壤中含量很低的土壤活性态砷、铋、锑的检出；具体方法是使用常规测量中100.0μg/L砷、铋、锑标准使用液浓度的1/10作为本发明中的砷、铋、锑标准液使用浓度，即10.0μg/L；标准曲线采用超低质量浓度标准曲线，砷、铋、锑标准曲线最大上限取2.0μg/L，零点之上第一个浓度值采用常规标准测量中砷、铋、锑标准溶液浓度1.0μg/L的1/5，即0.2μg/L砷、铋、锑作为本发明中零点之上第一个标准曲线浓度值。
土壤活性态砷、铋、锑含量的表示单位是每千克土壤中活性态砷、铋、锑的微克数或毫克数，表示单位为：μg/kg或A×10-3mg/kg；土壤活性态砷、铋、锑含量很低，大约在0.0001mg/kg～0.01mg/kg，即0.1μg/kg～10μg/kg之间，以正常国际标准mg/kg表示单位时存在表述单位缺陷，为读取和记录方便，以μg/kg或A×10-3mg/kg表示土壤活性态砷、铋、锑单位更加切合实际。
具体实施方式
土壤活性态砷、铋、锑一种检测方法：螯合浸提—原子荧光光谱仪法；采用二乙三胺五乙酸-氯化钙-三乙醇胺缓冲溶液作为浸提剂，其中二乙三胺五乙酸为螯合剂，氯化钙为螯合浸提平衡剂，三乙醇胺为缓冲剂，能使溶液pH保持7.3左右，螯合浸提出土壤活性态砷、铋、锑，用原子荧光光谱仪法，采用超低质量浓度标准曲线，测定土壤活性态砷、铋、锑。
主要仪器设备：1、分析天平：精度为0.0001g；2、原子荧光光度计；3、砷、铋、锑元素空心阴极灯；4、酸度计；5、恒温（控温25℃±2℃）往复式或旋转式振荡机，或放置在恒温室内的普通振荡机，满足180r·min-1±20r·min-1的振荡频率或达到相同效果；6、恒温水浴装置；7、离心机；8、200mL带盖塑料瓶或250mL三角瓶。
试剂与试剂配制：
13.1、试剂：1、二乙三胺五乙酸：优级纯；2、三乙醇胺：优级纯；3、氯化钙（CaCl2·2H2O）：优级纯；4、盐酸（HCl）：优级纯，ρ=1.19 g/mL；5、氢氧化钾（KOH）：优级纯；6、硼氢化钾（KBH4）：优级纯；7、硫脲(CH4N2S)：分析纯；8、抗坏血酸(C6H8O6)：分析纯；9、三氧化二砷（As2O3）优级纯；10、高纯金属铋；11、三氧化二锑（Sb2O3）；12、氨水；
13.2、50%盐酸溶液：移取500mL盐酸，用实验用水稀释至1000mL；
13.3、50%氨水溶液：移取500mL氨水，用实验用水稀释至1000mL；
13.4、螯合浸提剂配制：称取1.967g二乙三胺五乙酸，溶于14.92g(约13.3mL)三乙醇胺和少量水中；再将1.47g氯化钙（CaCl2·2H2O）溶于水后，一并转入1L容量瓶中，加水至约950mL；在酸度计用50%盐酸溶液或50%氨水调节pH至7.3，用水定容，贮于塑料瓶中待用；
13.5、还原剂配制：1.0%硼氢化钾+0.5%氢氧化钾溶液；称取5.0g氢氧化钾放入盛有100mL实验用水的烧杯中，玻璃棒搅拌待完全溶解后再加入2.5g硼氢化钾，搅拌溶解，定容至500mL；此溶液当日配制；
13.6、载流配制：5%盐酸溶液：移取25mL盐酸用实验用水稀释至500mL；
13.8、5.0%氢氧化钾溶液：称取25g氢氧化钾溶解后用实验用水稀释至500mL；
13.7、5.0%硫脲和抗坏血酸混合溶液：称取硫脲、抗坏血酸各50g，用实验用水溶解，定容于1000mL容量瓶中；混匀，使用当日配制。
砷（As）、铋（Bi）、锑（Sb）标准溶液：
14、1、砷（As）标准溶液
14.1.1、砷标准贮备液：ρ=100.0mg/L；购买市售有证标准物质/有证标准样品，或称取0.1320g经过105℃干燥2h的优级纯三氧化二砷（As2O3）溶解于5mL5.0%氢氧化钾溶液中，用5.0%的盐酸溶液中和至酚酞红色褪去，实验用水定容至1000ml，混匀；
14.1.2砷标准中间液：ρ=1.00mg/L；移取砷标准贮备液5.00ml，置于500mL的容量瓶中，加入200mL50%盐酸溶液，用实验用水定容至标线，混匀；
14.2、铋（Bi）标准溶液
14.2.1、铋标准贮备液：ρ=100.0mg/L；购买市售有证标准物质/有证标准样品，或称取高纯金属铋0.1000g，置于100mL烧杯中，加20mL硝酸，低温加热至溶解完全，冷却，移入1000mL容量瓶中，用实验用水定容至标线，混匀；
14.2.2、铋标准中间液：ρ=1.00mg/L；移取铋标准贮备液5.00ml，置于500mL的容量瓶中，加入200mL50%盐酸溶液，用实验用水定容至标线，混匀；
14.3、锑（Sb）标准溶液
14.3.1、锑标准贮备液：ρ=100.0mg/L；购买市售有证标准物质/有证标准样品，或称取0.1197g经过105℃干燥2h的三氧化二锑（Sb2O3）溶解于80mL盐酸中，转入1000mL容量瓶中，补加120mL盐酸，用实验用水定容至标线，混匀；
14.3.2、锑标准中间液：ρ=1.00mg/L；移取锑标准贮备液5.00ml，置于500mL的容量瓶中，加入200mL50%盐酸溶液，用实验用水定容至标线，混匀；
14.4、砷、铋、锑混合标准使用液：砷、铋、锑ρ=10.0μg/L；移取砷、铋、锑标准中间液各5.00ml，置于500mL容量中，用螯合浸提剂定容至标线，混匀。用时现配。
浸提待测液制备：
称取通过2mm孔径尼龙筛的风干试样20.00g于200mL塑料瓶中，加入25℃±2℃的二乙三胺五乙酸-氯化钙-三乙醇胺浸提剂40mL，盖好瓶盖，摇匀，在25℃±2℃的条件下，以180r•min-1±20r•min-1的频率振荡2h，振荡液用离心机离心5分钟后立即过滤；保留滤液，分取25.0mL滤液置于50mL容量瓶中，加入浓盐酸10mL50%盐酸溶液，5.0%硫脲和抗坏血酸混合溶液10mL，用二乙三胺五乙酸-氯化钙-三乙醇胺浸提剂定容至标线混匀，室温放置30min；室温低于15℃时，置于30℃水浴中保温20min；在48h内完成测定，同时做空白试验。
分析测定：
16.1、原子荧光光度计的调试：原子荧光光度计开机预热，按照仪器使用说明书设定灯电流、负高压、载气流量、屏蔽气流量等工作参数，预热准备检测的砷或铋元素空心阴极灯20分钟；参考条件见表1；
表 1 原子荧光光度计的工作参数
16.2、校准系列的制备：砷（As）、铋（Bi）、锑（Sb）的校准系列；
移取ρ= 10.0μg/L砷（As）、铋（Bi）、锑（Sb）标准混合液0.00、1.00、2.00、3.00、5.00、7.00、10.00mL于50mL容量瓶中，加入50%盐酸溶液10mL，5.0%硫脲和抗坏血酸混合溶液10mL，用用二乙三胺五乙酸-氯化钙-三乙醇胺浸提剂定容至标线，混匀；室温放置30min；室温低于15℃时，置于30℃水浴中保温20min。砷、铋、锑的校准系列溶液浓度见表2；
表2 砷（As）、铋（Bi）、锑（Sb）元素校准系列溶液浓度 单位：µg/L
16.3、绘制校准曲线：以硼氢化钾溶液为还原剂、5%盐酸溶液为载流，由低浓度到高浓度顺次测定校准系列标准溶液的原子荧光强度。用扣除零浓度空白的校准系列原子荧光强度为纵坐标，溶液中相对应的元素浓度（μg/L）为横坐标，绘制校准曲线；并按照相同的试剂和步骤进行空白试验；
16.4、测定：将制备好的试料导入原子荧光光度计中，按照与绘制校准曲线相同仪器工作条件进行测定；如果被测元素浓度超过校准曲线浓度范围，应稀释后重新进行测定；同时将制备好的空白试料导入原子荧光光度计中，按照与绘制校准曲线相同仪器工作条件进行测定。
结果计算与表示：
17.1、结果计算：土壤活性态砷、铋、锑；
式中：ω——土壤中活性态砷、铋、锑元素的含量，10-3mg/kg；
ρ ——由校准曲线查得测定试液中元素的浓度，µg/L；
ρ0——空白溶液中元素的测定浓度，µg/L；
V0——加入二乙三胺五乙酸-氯化钙-三乙醇胺浸提剂体积；
V1——分取浸提剂试液的体积，mL；
V2——分取后测定试液的定容体积，mL；
m——称取样品的质量，g；
17.2、结果表示：土壤活性态砷、铋、锑含量表示单位是：10-3mg/kg； 当测定结果小于1×10-3mg/kg时，小数点后数字最多保留至三位；当测定结果大于1×10-3mg/kg时，保留三位有效数字。