马兜铃酸的快速检测方法与流程

本发明涉及一种马兜铃酸的快速检测方法。

背景技术：

马兜铃酸(Aristolochic acids)为马兜铃属以及细辛等马兜铃科植物的主要活性成分。马兜铃酸为硝基菲类化合物，自然界中常见的马兜铃酸有马兜铃酸A(AA-I)和马兜铃酸B(AA-II)，其结构式如下，其中，马兜铃酸A中R＝OCH₃，马兜铃酸B中R＝H，

马兜铃类传统中药自其药用效果发现以来，在医学上的运用就很广泛。马兜铃除马兜铃果实风干后用作药用外，其根、茎也都有药用价值。马兜铃主要功效为治疗肺热咳喘、止咳化痰且有助于改善高血压病人的症状，帮助降低血压。马兜铃的茎在中医中又叫做天仙藤，其根叫做青木香。从果实到茎再到根，马兜铃植株几乎整株都能入药，可见该类植物在中医中的地位。

上个世纪50-60年代，一些地区出现一种罕见肾病。据资料记载，1956年在克罗地亚、波斯尼亚、黑塞哥维纳、保加利亚等地区都有报道出现一种慢性 肾炎，能导致肾功能衰竭，但病因无从知晓。之后在世界各地陆续发现有各种不明原因的肾病案例。上个世纪90年代，这类肾衰竭病症在一些区域集中出现。在比利时，100多例服用过一种含有马兜铃酸的减肥药物的女性检查出肾脏病变，其中40多例严重至需要肾移植或透析治疗。太多不明原因的肾脏疾病出现后引起了科学家注意，通过研究分析最终找到了接连发生的肾病的致病元凶：马兜铃酸。

虽然马兜铃酸在医学上被发现有各种药用功能，但同时其具有很强的肾毒性。临床报道中出现的病例多以长期微量摄入含马兜铃酸的药物或者短期摄入大剂量含马兜铃酸的药材引起了肾脏的损伤，更严重的发展为肾衰竭。此外还发现马兜铃酸除了具有肾毒性，还有明显的致癌性，尤其是对泌尿系统致癌性尤为显著，被认为是最强的致癌物之一。如果马兜铃酸在日常摄入过程中聚集在体内，则很有可能在由于肾脏病变在泌尿系统中产生恶性肿瘤。虽然马兜铃酸具有不可否认的药理价值，但其具有的肾毒性以及致癌性更应该加以重视。

由于马兜铃酸被发现具有很强的深毒性和致癌性，不断增多的临床病例让许多国家和地区开始禁止含有马兜铃酸药材的使用和销售。包括英国、德国、加拿大和澳大利亚都宣布了禁止含有该成分的药材的进口、出售和使用。2001年，美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration)发布了含有该类成分的中药材对人体有害的警告，禁止了包括马兜铃、关木通、天仙藤、青木香、广防等中药材和中成药的进口和销售。

直到2003年，我国国家药品食品监督管理局才发布了有关禁止含有马兜铃酸药材使用的文件，陆续禁止了几种含有马兜铃酸的中药材。至此我国已禁止了关木通、广防己、青木香三种药材的使用，但是仍有大量含有马兜铃酸的中药材在市场上流通使用。在2010年版《中国药典》中，马兜铃、天仙藤、蜜 马兜铃和细辛等中药仍列于其中，这几类药材中含有的马兜铃酸对药品安全造成了很大的隐患。因此，需要一种能够快速、高效测定马兜铃酸的方法，以此来降低该类药物在使用过程中的风险。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种马兜铃酸的快速检测方法，能克服现有技术的不足，达到快速、高效测定马兜铃酸的目的，以降低马兜铃酸在使用过程中的风险。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：马兜铃酸的快速检测方法，包括以下步骤：

S1：样品预处理，包含以下子步骤：

S101、将干燥马兜铃酸样品研磨成粉末，称量0.1-0.3g粉末样品加入到3.0-6.0mL甲醇溶液中；

S102、溶解：将保样品粉末充分地溶解在甲醇溶液中，将溶液在室温下超声20-40min；

S103、过滤：用滤纸将溶液中多余的杂质过滤掉；

S104、离心：将过滤后的溶液在转速2000-3500rpm下离心3-7min，静置，之后取上层清液待用；

S2、马兜铃酸还原处理，包含以下子步骤：

S201、在清液样本中取0.5-2mL加入到8-9.5mL的浓度为8-12mM的HCL溶液中，再向混合溶液中加入15-25mg的Zn粉；

S202、再将混合后的溶液用磁搅拌器在室温下搅拌30-50min直至溶液无色，还原反应完成；

S3、荧光颜色判断：取1-2mL还原后的溶液置于紫外灯下照射，若溶液荧 光颜色为非黄绿色，则样品中不含马兜铃酸，若溶液荧光颜色为黄绿色，则进行下一步；

S4、光谱图检测判断：根据S3步骤中溶液荧光颜色确定荧光光谱仪，所述荧光光谱仪的激发波长为492-597nm，利用所述荧光光谱仪对样品进行激发光谱和发射光谱的检测，根据激发光谱和发射光谱确定样品的最大激发波长和最大发射波长，若样品的最大激发波长超过405nm或其最大发射波长超过490nm时，则样品中不含马兜铃酸，否则进行下一步；

S5、CE分析，包含以下子步骤：

S501、预处理：将S4步骤留下的溶液用浓度为0.8-1.5mol/L的NaOH溶液冲洗20-40min，然后用0.8-1.5mol/L的HCL溶液冲洗20-40min，再清水冲洗5-10min，最后用10-50mmol/L的硼砂缓冲溶液冲洗；

S502、打开LED诱导的荧光检测系统，将S4步骤留下的溶液进行CE分析，得到电泳分离图，在4-5min内没有出现电泳峰，则样品中不含有马兜铃酸，反之样品中含有马兜铃酸。

所述的S102溶解步骤是在超声清洗器中在室温的环境下超声30min。

所述的S103过滤步骤中滤纸的直径为7.0cm。

所述的紫外灯的波长为365nm。

所述的硼砂缓冲溶液的PH值为9.0。

CE称作毛细管电泳(cpillary electrophoresis)，又称作高效毛细管电泳(HPCE)，是一种以高压直流电场为驱动力、以毛细管为分离通道的新型分离技术，问世于20世纪80年代初,在药物或者中药的检测中运用已经很广泛。CE技术一出现就以其高效、简单、快速、微量、清洁、经济、环境污染小和易于自动化等特点迅速发展，现如今已经成为与常用的气相色谱及高效液相色谱 技术相媲美的一种主流技术。从其诞生以来，迅速成为一种主流的分离技术，并且在多种物质的分离检测中得到了应用。

CE技术的基本原理是通过在毛细管两端施加10～30kV电压，通过毛细管内缓冲溶液形成通路，毛细管中各组分由于带电性质、分子质量等差别在电压作用下产生定向运动过程中产生速度差，从而对所检测的离子、分子或者带电粒子进行快速、高效分离。CE系统基本结构包括进样、填灌/清洗、毛细管、检测/数据处理等部分。其中毛细管为主要工作部分，一般由石英材料制成，内径采用采用25μm-100μm之间。

CE利用毛细管得到了很好的分离效果，但因为毛细管尺寸的限制，导致在电泳过程中光程和进样量受到限制，因此CE检测效果的提高需要配合高灵敏度的检测器。目前CE检测器主要有有以下几类：1、紫外可见光吸收(UV-Vis)；2、化学发光(CL)；3、激光诱导荧光(LIF)；4、质谱(MS)；5、电化学；6、核磁共振(NMR)；7、发光二极管诱导荧光(LEDLIF)。

其中应用最广泛的紫外检测器已经运用到了多种商品化仪器上，因其具有通用性的检测能力所以运用很广泛。紫外检测方式分为柱后和柱上检测，通常采用在检测部位将毛细管的不透明图层除去，激发光线从毛细管一侧进入，检测器则位于另一侧。激光诱导荧光检测器则为了避免由激光引起的毛细管壁反射干扰，和过滤掉激光器的强背景干扰，需要对光路系统采用一定特殊结构，及入射光、毛细管和荧光采集方向三者的位置关系。在正交型的激光诱导荧光检测系统中荧光采集透镜垂直于毛细管和激发光所构成的平面，共线型结构中三者则位于同一平面。

激光诱导荧光检测器因为单色性和相干性好，且作为激发光强度很高，能够有效地提高信噪比，因此在各类检测器中是效果最好的。所以由激光诱导荧 光检测器构建的CE系统已普遍用于对蛋白质、单细胞以及DNA的检测。对基于荧光检测的CE系统，需要被检测物有内在荧光或者能经过荧光标记带上荧光，从而选择与之光谱性质匹配的的激光器。而以LIF检测器的检测限较高表现在其能激发的波长范围内，对于超过LIF检测器激发范围的样品LIF就会表现得力不从心。除了这个缺点外LIF检测器表现出了寿命短的问题，而且此类检测器价格昂贵，因此大大限制了其在毛细管电泳方面的应用。

所述的LED诱导的荧光检测系统包含LED光源、光导纤维、显微镜、高压电源、石英毛细管、滤光片、光电倍增管以及色谱工作站，其中，LED光源的中心波长为405nm、半峰宽为20nm，滤光片为450nm前截止后通过的滤光片，LED光源和光导纤维安装在和显微镜调整板同一高度的平台上，光导纤维的一端对准LED光源，滤光片安装在显微镜的物镜上，光电倍增管安装在显微镜的目镜上，光电倍增管的输入端与色谱工作站相连，高压电源的正极通过导线接入待测溶液中，石英毛细管布置在显微镜调整板上且石英毛细管的一端插入待测溶液中，高压电源的负极通过导线与石英毛细管中的缓冲液电联，光导纤维另一端穿过石英毛细管且其光纤头位于显微镜的物镜的正中位置。

LED是近年来新兴的一种光源，具有稳定的发光性质。且LED可选波长范围较广，覆盖了380-950nm之间的波长范围。传统LEDIF检测中，多采用在毛细管外部激发样品产生荧光，因LED本身光强度有限，在激发光穿过毛线管时也会损失一部分能量，所以其激发效果相对于激光诱导荧光检测器较弱，导致其检测灵敏度较低，相比之下检测限在10^-7mol/L左右。在已有的基于LEDLF检测的CE设备中，已经可以达到与LIF检测器灵敏度相当的水平，该检测系统是通过LED发出激发光线，然后通过光线将激发光引导至检测窗口，即为LED诱导的荧光检测系统。相比在毛细管外激发样品，这种方法减少了激发光强的损失，直接在缓冲溶液中激发样品发出荧光，检测效率得到了很大提高。采用这种方法后使得检测限达到10^-8～10^-9mol/L，指标上已经与LIF 检测器接近。并且相对于LIF检测器LED的寿命更长，即使需要更换光源其价格也更便宜，更换也更方便。由于基于LED的CE检测器具有诸多优点，因此本文中以此建立一种新的方法检测马兜铃酸。

马兜铃酸本身不带荧光，或者荧光微弱，其原因是结构式中存在抑制荧光的荧光减色基团硝基。因此若要让马兜铃酸能够在毛细管中检测，需要将马兜铃酸衍生化，即改变其荧光性质。通常LED诱导荧光毛细管电泳的衍生化是将本身不带荧光的样品用荧光染料染色，常用的染料有异硫氰酸荧光素(FITC)、萘二甲醛(NDA)等。但本发明中马兜铃酸的荧光因硝基的存在受到抑制，所以可以对硝基进行处理激发出样品自身的荧光，相对于用染料染色后检测更加直接。

马兜铃酸的分子结构中有一个位于苯环上的硝基，此类型的硝基为芳香硝基。芳香硝基的还原方法主要根据还原剂的不同有通过氢气还原的催化加氢法；采用金属还原剂如Fe、Zn、Sn等的金属还原法；还原性极强的水合肼还原法等。其中金属还原法在几种方法中适用最广，其技术已经非常成熟，本发明即采用金属还原法还原马兜铃酸分子结构上的芳香硝基。其基本原理如下，在所有含氮的有机物中马兜铃酸分子中的N原子氧化数为+3是最高的，所以如果要通过硝基改变马兜铃酸的荧光性质可以通过还原硝基的方式。传统的金属还原法为在酸性条件下，使用还原性较强的金属如Fe、Zn、Sn等失去电子和酸性环境中的质子氢的作用，生成中间产物亚硝基苯和苯基羟胺，之后再通过还原剂失电子和质子氢作用继续还原成氨基。其还原过程如下：

其具体反应机理如下：

马兜铃酸中硝基也位于苯环上，如果采用金属还原法进行还原则可以得到生成氨基的还原产物：

荧光物质发射荧光需要外界能量的激发，激发荧光的方式有电致发光、光致发光、X射线发光、阴极射线发光和高能粒子发光等。本文检测的发光原理为光致发光，当由光纤诱导的激发光线照射样品上时，处于基态的样品分子吸收能量发生跃迁，达到激发态。在激发态回到低能状态的过程中，会以光子的 形式释放能量，从而产生了荧光。

物质分子在结构上的不同对自身荧光性质有很大的决定作用。如果物质结构中存在如-NH₂、-CN、-NHR、-OR等这些能够扩大分子共轭度的给电子基团，即荧光助色基团，这些基团能够增加电子在荧光物质激发态与基态之间跃迁的几率，从而使物质荧光强度增加。而如-NO₂、-COOH、-CHO、-CO等得电子基团，其n电子的电子云与π轨道不平行，所以引起荧光减弱，即为荧光减色基团。本文实验中的马兜铃酸分子结构中就存在荧光减色基团-NO₂抑制了马兜铃酸分子产生荧光，因此采用了还原法将-NO₂还原成能够增强荧光的荧光助色基团-NH₂。

物质的激发光谱和发射光谱是表征其发光性能的一个重要指标。激发光谱是指材料在经过不同波长的激发扫描，得出该材料的在一个确定发射波长下发射光谱的强度与激发波长的关系。根据材料的激发光谱可以得到能激发荧光材料发光强度达到最大的波长，即最大激发波长。同理发射光谱是在一个固定的发射波长下，物质发出的光强度与波长的关系。根据发射光谱则可以得到物质的最大发射波长。本文中由激发和发射光谱相结合，确定了还原产物的最大激发和发射波长，以此为基础为完成在毛细管电泳中的检测选择合适波长的激发光源和滤光片。

本发明通过还原法，将马兜铃酸上抑制荧光的硝基还原成氨基，得到了荧光增强的还原产物。通过测定激发和发射光谱，得到马兜铃酸还原产物的最大激发波长为400nm，最大发射波长为490nm，激发波长在以LED为激发光源的范围内(380-950nm)且激发和发射波长之间具有适当的波长差。因此得出了马兜铃酸可以用LED光纤诱导荧光毛细管电泳来检测的结论。并且在毛细管中对比进样，通过样品还原前和还原后的毛细管分离图的对比，验证了用LED 诱导荧光毛细管电泳检测马兜铃酸的可行性。至此建立了一种基于LED诱导荧光毛细管电泳来检测马兜铃酸的新方法。

本发明的有益效果是：1、前处理简单，直接由药材样品溶解萃取所得的溶液用于分析，免去了一系列提纯等处理过程；2、样品衍生化过程快捷，还原硝基反应在40min内完成，相比于通常的荧光染料衍生需要14-16h极大提高了效率；3、需要的样品微量，最后进入的毛细管检测的样品进样20s，进样量小于1μl，微量的同时也达到了环保的目的。

附图说明

图1为本发明实施例1中样品发射光谱图；

图2为本发明实施例1中样品激发光谱图；

图3为本发明LED诱导的荧光检测系统结构示意图；

图4为本发明实施例1中样品还原前电泳图；

图5为发明实施例1中样品还原后电泳图。

其中，1-LED光源，2-光导纤维，3-显微镜、4-高压电源、5-石英毛细管、6-滤光片、7-光电倍增管，8-色谱工作站。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图进一步详细描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下所述。

实施例1

马兜铃酸的快速检测方法，包括以下步骤：

S1：样品预处理，包含以下子步骤：

S101、将干燥马兜铃酸样品研磨成粉末，称量0.2g粉末样品加入到5mL 甲醇溶液中；

S102、溶解：将保样品粉末充分地溶解在甲醇溶液中，将溶液在室温下超声30min；

S103、过滤：用滤纸将溶液中多余的杂质过滤掉；

S104、离心：将过滤后的溶液在转速3000rpm下离心5min，静置，之后取上层清液待用；

S2、马兜铃酸还原处理，包含以下子步骤：

S201、在清液样本中取1mL加入到9mL的浓度为10mM的HCL溶液中，再向混合溶液中加入20mg的Zn粉；

S202、再将混合后的溶液用磁搅拌器在室温下搅拌40min直至溶液无色，还原反应完成；

S3、荧光颜色判断：取1mL还原后的溶液置于紫外灯下照射，若溶液荧光颜色为非黄绿色，则样品中不含马兜铃酸，若溶液荧光颜色为黄绿色，则进行下一步；

同时取1mL还原前后的溶液置于紫外灯下照射，可以见到还原前后样品荧光强度的对比。同时根据荧光颜色初步判断样品的发射波长范围。荧光颜色与波长的大致对应关系为：紫色(350-455nm)、蓝靛色(455-492nm)、绿色(492-577nm)、黄色(577-597nm)、橙色(597-622nm)、红色(622-670nm)。试验结果得到样品还原后荧光呈黄绿色，所以其最大发射波长为500左右，为后续检测发射波谱提供参考；

S4、光谱图检测判断：根据S3步骤中溶液荧光颜色确定荧光光谱仪，所述荧光光谱仪的激发波长为492-597nm，利用所述荧光光谱仪对样品进行激发光谱和发射光谱的检测，根据激发光谱和发射光谱确定样品的最大激发波长和最大 发射波长，若样品的最大激发波长超过405nm或其最大发射波长超过490nm时，则样品中不含马兜铃酸，否则进行下一步；

荧光光谱仪即荧光分光光度计，用于定性和定量检测物质的激发光谱、发射光谱和荧光强度等性质。其原理是通过切光器将光源发射的光变成断续的光，激发被检测的样品发射出荧光，再由光电倍增管，在计算机中以图表和数字方式展示出来。

荧光光谱仪的具体检测步骤如下：

(1)、开启计算机，按POWER键启动仪器，主机面板Xe LANP和RUN指示灯亮起则仪器启动正常。启动FL Solution 2.1 for F-7000运行软件，进入扫描界面预热15-20min；(2)、选择检测模式为波长扫描，点击“Method”，进入参数设置。在“Instrument”项中设置初始扫描参数，将蒸馏水加入到比色皿中并扫描，以查看基线；(3)、首先样品的激发和发射波长都是未知，扫描模式选择“Excitation”，输入激发波长值为：350nm，光谱范围设置为：350×2-20＝680nm，设置完后点击“Measure”进行测量，得到一个样品的发射光谱；(4)、将得到发射光谱中的最大发射波长输入到光谱设置中，设置光谱范围为490/2+20＝275nm，然后点击“Measure”进行测量，得到一个激发光谱；(5)、由于样品直接从中药粉末中萃取，为混合物，含有其它发射荧光的物质，所以在检测时有多个激发波长。按照上一步将几个发射波长都输入，将得到几个激发波长；因此按照第一步的设置，输入之前得到的激发波长。重复多次扫描避免偶然性，确定最终的发射光谱。

激发光谱和发射光谱是每种物质的固有特性。在毛细管电泳检测中，为了提高检测的灵敏度，应该尽可能地收集样品发射的荧光，以及过滤掉光源发射出的激发光。因此，LED激发光源和滤光片的选择，是决定检测灵敏度的一个 重要步骤。本发明使用荧光光谱仪测定了样品的最大激发波长和最大发射波长分别为405nm和490nm，详细的激发和发射光谱如图1和2。该样品的波长差为490-405＝85nm，因此采用中心波长为405nm、半峰宽为20nm的LED光源作为激发光源，样品的发射光谱与LED光源的重叠较小。

LED与激光光源比为非单色光源，这一点直接影响了检测灵敏度。为消除其影响，需在检测窗口前设置滤光片。在450nm波长处，光源的发射光强度几乎为零，因此选择450nm波长前截止后通过的JB450型滤光片，可以将由LED发出的干扰光全部过滤，又可以收集到大部分样品的发射光。

S5、CE分析，包含以下子步骤：

S501、预处理：将S4步骤留下的溶液用浓度为1mol/L的NaOH溶液冲洗30min，然后用1mol/L的HCL溶液冲洗30min，再清水冲洗5min，最后用10mmol/L的硼砂缓冲溶液冲洗；

S502、打开LED诱导的荧光检测系统，将S4步骤留下的溶液进行CE分析，得到电泳分离图，在4-5min内没有出现电泳峰，则样品中不含有马兜铃酸，反之样品中含有马兜铃酸。

所述的S102溶解步骤是在超声清洗器中在室温的环境下超声30min。

所述的S103过滤步骤中滤纸的直径为7.0cm。

所述的紫外灯的波长为365nm。

所述的硼砂缓冲溶液的PH值为9.0。

如图3，所述的LED诱导的荧光检测系统包含LED光源1、光导纤维2、显微镜3、高压电源4、石英毛细管5、滤光片6、光电倍增管7以及色谱工作站8，其中，LED光源1的中心波长为405nm、半峰宽为20nm，滤光片6为450nm前截止后通过的滤光片，LED光源1和光导纤维2安装在和显微镜3调 整板同一高度的平台上，光导纤维2的一端对准LED光源1，滤光片6安装在显微镜3的物镜上，光电倍增管7安装在显微镜3的目镜上，光电倍增管7的输入端与色谱工作站8相连，高压电源4的正极通过导线接入待测溶液中，石英毛细管5布置在显微镜3调整板上且石英毛细管5的一端插入待测溶液中，高压电源4的负极通过导线与石英毛细管5中的缓冲液电联，光导纤维2的另一端穿过石英毛细管5且其光纤头位于显微镜3的物镜的正中位置。

所述的LED诱导的荧光检测系统的操作方法包含以下步骤：

(1)、启动色谱工作站online，设置测量的电压和时间；

(2)、打开LED光源，调整检测板位置，使光纤头在显微镜中位于正中位置，然后调整电压，让光源亮度增强至目镜观测清晰位置；

(3)、采用重力进样20s，打开光电倍增管，设置电压15kv，接通电源同时在色谱工作站online站界面选择采集数据；

(4)、待出峰完成后，选择停止采集，保存数据，然后关闭高压电源，关闭光电倍增管；

(5)、打开色谱工作站offline，进行试验数据的处理与分析。

由于样品溶液是直接从中药材中萃取所得，中草药中的成分含有各种芳香环、杂环。这些结构都能在激发光作用下激发荧光，因此为排除原溶液中这些物质的干扰，采取还原前和还原后检测结果进行对比。还原前和还原后的电泳图分别为图4和图5，由电泳分离图可见，在样品还原后的电泳图中，4.3min附近出现了一个峰，而样品还原前的电泳图中此时间附近没有明显的电泳峰。因此通过对比确定了在4.3min的电泳峰为样品峰。通过样品还原前和还原后的毛细管分离图的对比，进一步验证了用LED诱导荧光毛细管电泳检测马兜铃酸的可行性。

实施例2

马兜铃酸的快速检测方法，包括以下步骤：

S1：样品预处理，包含以下子步骤：

S101、将干燥马兜铃酸样品研磨成粉末，称量0.1g粉末样品加入到4.0mL甲醇溶液中；

S102、溶解：将保样品粉末充分地溶解在甲醇溶液中，将溶液在室温下超声20min；

S103、过滤：用滤纸将溶液中多余的杂质过滤掉；

S104、离心：将过滤后的溶液在转速2000rpm下离心3min，静置，之后取上层清液待用；

S2、马兜铃酸还原处理，包含以下子步骤：

S201、在清液样本中取0.5mL加入到9.5mL的浓度为8mM的HCL溶液中，再向混合溶液中加入15mg的Zn粉；

S202、再将混合后的溶液用磁搅拌器在室温下搅拌50min直至溶液无色，还原反应完成；

S3、荧光颜色判断：取2mL还原后的溶液置于紫外灯下照射，溶液荧光颜色为非黄绿色，则样品中不含马兜铃酸；

S4、光谱图检测判断：根据S3步骤中溶液荧光颜色确定荧光光谱仪，所述荧光光谱仪的激发波长为492-597nm，利用所述荧光光谱仪对样品进行激发光谱和发射光谱的检测，根据激发光谱和发射光谱确定样品的最大激发波长和最大发射波长，样品的最大激发波长超过405nm，样品中不含马兜铃酸，验证了S3的结论；

S5、CE分析，包含以下子步骤：

S501、预处理：将S4步骤留下的溶液用浓度为0.8mol/L的NaOH溶液冲洗20min，然后用0.8mol/L的HCL溶液冲洗20min，再清水冲洗10min，最后用30mmol/L的硼砂缓冲溶液冲洗；

S502、打开LED诱导的荧光检测系统，将S4步骤留下的溶液进行CE分析，得到电泳分离图，在4-5min内没有出现电泳峰，进一步验证了S3结论。

实施例3

马兜铃酸的快速检测方法，包括以下步骤：

S1：样品预处理，包含以下子步骤：

S101、将干燥马兜铃酸样品研磨成粉末，称量0.3g粉末样品加入到6.0mL甲醇溶液中；

S102、溶解：将保样品粉末充分地溶解在甲醇溶液中，将溶液在室温下超声40min；

S103、过滤：用滤纸将溶液中多余的杂质过滤掉；

S104、离心：将过滤后的溶液在转速3500rpm下离心7min，静置，之后取上层清液待用；

S2、马兜铃酸还原处理，包含以下子步骤：

S201、在清液样本中取2mL加入到8的浓度为12mM的HCL溶液中，再向混合溶液中加入25mg的Zn粉；

S202、再将混合后的溶液用磁搅拌器在室温下搅拌50min直至溶液无色，还原反应完成；

S3、荧光颜色判断：取1mL还原后的溶液置于紫外灯下照射，溶液荧光颜色为黄绿色，则进行下一步；

S4、光谱图检测判断：根据S3步骤中溶液荧光颜色确定荧光光谱仪，所述 荧光光谱仪的激发波长为492-597nm，利用所述荧光光谱仪对样品进行激发光谱和发射光谱的检测，根据激发光谱和发射光谱确定样品的最大激发波长和最大发射波长，样品的其最大发射波长超过490nm，则样品中不含马兜铃酸；

S5、CE分析，包含以下子步骤：

S501、预处理：将S4步骤留下的溶液用浓度为1.5mol/L的NaOH溶液冲洗40min，然后用1.5mol/L的HCL溶液冲洗40min，再清水冲洗8min，最后用50mmol/L的硼砂缓冲溶液冲洗；

S502、打开LED诱导的荧光检测系统，将S4步骤留下的溶液进行CE分析，得到电泳分离图，在4-5min内没有出现电泳峰，则样品中不含有马兜铃酸，验证了S4的结论。

实施例4

马兜铃酸的快速检测方法，包括以下步骤：

S1：样品预处理，包含以下子步骤：

S101、将干燥马兜铃酸样品研磨成粉末，称量0.2g粉末样品加入到3.0mL甲醇溶液中；

S102、溶解：将保样品粉末充分地溶解在甲醇溶液中，将溶液在室温下超声35min；

S103、过滤：用滤纸将溶液中多余的杂质过滤掉；

S104、离心：将过滤后的溶液在转速2500rpm下离心4min，静置，之后取上层清液待用；

S2、马兜铃酸还原处理，包含以下子步骤：

S201、在清液样本中取1.5mL加入到8.5mL的浓度为10mM的HCL溶液中，再向混合溶液中加入22mg的Zn粉；

S202、再将混合后的溶液用磁搅拌器在室温下搅拌35min直至溶液无色，还原反应完成；

S3、荧光颜色判断：取1mL还原后的溶液置于紫外灯下照射，溶液荧光颜色为黄绿色，则进行下一步；

S4、光谱图检测判断：根据S3步骤中溶液荧光颜色确定荧光光谱仪，所述荧光光谱仪的激发波长为492-597nm，利用所述荧光光谱仪对样品进行激发光谱和发射光谱的检测，根据激发光谱和发射光谱确定样品的最大激发波长和最大发射波长，样品的最大激发波长没有超过405nm，同时其最大发射波长也没有超过490nm时，进行下一步；

S5、CE分析，包含以下子步骤：

S501、预处理：将S4步骤留下的溶液用浓度为1.2mol/L的NaOH溶液冲洗30min，然后用1.2mol/L的HCL溶液冲洗30min，再清水冲洗6min，最后用15mmol/L的硼砂缓冲溶液冲洗；

S502、打开LED诱导的荧光检测系统，将S4步骤留下的溶液进行CE分析，得到电泳分离图，在4-5min内没有出现电泳峰，则样品中不含有马兜铃酸。

实施例5

马兜铃酸的快速检测方法，包括以下步骤：

S1：样品预处理，包含以下子步骤：

S101、将干燥马兜铃酸样品研磨成粉末，称量0.3g粉末样品加入到5.0mL甲醇溶液中；

S102、溶解：将保样品粉末充分地溶解在甲醇溶液中，将溶液在室温下超声25min；

S103、过滤：用滤纸将溶液中多余的杂质过滤掉；

S104、离心：将过滤后的溶液在转速3000rpm下离心6min，静置，之后取上层清液待用；

S2、马兜铃酸还原处理，包含以下子步骤：

S201、在清液样本中取1mL加入到6mL的浓度为12mM的HCL溶液中，再向混合溶液中加入15mg的Zn粉；

S202、再将混合后的溶液用磁搅拌器在室温下搅拌45min直至溶液无色，还原反应完成；

S3、荧光颜色判断：取1.5mL还原后的溶液置于紫外灯下照射，溶液荧光颜色为黄绿色，则进行下一步；

S4、光谱图检测判断：根据S3步骤中溶液荧光颜色确定荧光光谱仪，所述荧光光谱仪的激发波长为492-597nm，利用所述荧光光谱仪对样品进行激发光谱和发射光谱的检测，根据激发光谱和发射光谱确定样品的最大激发波长和最大发射波长，样品的最大激发波长没有超过405nm，同时最大发射波长没有超过490nm，进行下一步；

S5、CE分析，包含以下子步骤：

S501、预处理：将S4步骤留下的溶液用浓度为1.4mol/L的NaOH溶液冲洗40min，然后用1.4mol/L的HCL溶液冲洗40min，再清水冲洗5min，最后用25mmol/L的硼砂缓冲溶液冲洗；

S502、打开LED诱导的荧光检测系统，将S4步骤留下的溶液进行CE分析，得到电泳分离图，在4-5min内出现电泳峰，样品中含有马兜铃酸。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知 识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。