本发明涉及一种新的CMV、PVY快速检测方法。
背景技术：
：目前，基于免疫学原理的酶联免疫（ELISA）和基于分子生物学原理的聚合酶链式扩增（PCR）是对植物病毒病原的检测和诊断主要方法。最近几年，环式等温扩增技术（LAMP）发展迅速，成为的植物病原检测新的检测手段。但是，不可否认的是，LAMP虽然可以不依靠于复杂设备实现对病原物的高灵敏检测，然而核酸提取步骤使得LAMP操作与常规分子生物学的PCR检测相比，没有明显的简化。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是：提供一种型的CMV、PVY快速检测方法，以解决现有检测手段中依靠复杂设备和步骤复杂的问题。本发明的技术方案是：一种新的CMV、PVY快速检测方法，包含以下步骤：（1）抗体包被：PCR管使用2%-5%戊二醛和HCl处理，之后分别使用ddH2O和碳酸包被缓冲液冲洗，使用包被缓冲液以1:200的比例稀释抗体，取稀释后的抗体加入处理好的PCR管，2-8℃孵育过夜，之后以PBST清洗备用；（2）CMV和PVY免疫捕获环式等温扩增引物的设计；（3）免疫捕获-环式等温扩增检测，样品匀浆：取0.1-0.2g发病样品，以1:10的比例加入抽提缓冲液，然后研磨匀浆，离心取上清液；（4）免疫捕获-环式等温扩增反应过程：将烟草叶片匀浆液加入抗体包被的PCR管中，37℃孵育1-3h，孵育结束后倒掉匀浆液，然后用无菌水冲洗，在PCR管中加入无菌水，在金属浴中变性5-10min，然后迅速转移至冰上，然后按照反转录酶产品说明书加入包括反转录酶的反转录试剂和CMV和PVY特异反转录引物，定容体积至100μl，转录反应45min至1h，然后吸出5-20μl反转录产物作为等温扩增反应底物，补充等温扩增试剂和无菌水至25μl体系，个反应在60-65℃条件下进行60-90min。步骤（1）中所述的引物为：引物名称靶标引物序列F3outerprimerCMVTGATTCTACCGTGTGGGTGB3outerprimerCMVCGGCGTACTTTCTCATGTCFIPinnerprimerCMVGCGAACATAGCAGAGATGGCG_GACAGTCCGCAAAGTTCCTGBIPinnerprimerCMVCAGTATGCAGCATCCGGAGTC_CCGCATCGCCGAAAGATCAF3outerprimerPVYCGAAATCTGCGGGATGTGGB3outerprimerPVYAGACATCCTCGGTGGTGTFIPinnerprimerPVYTCCCTAGCCCTCACTGGTGTTC_TTAGCGCGTTATGCCTTTGABIPinnerprimerPVYGCAGCATTGAAATCAGCCCAA_GCCTCTCTGTGTTCTCCTCT所述的抽提缓冲液为2%polyvinylpyrrolidone、0.2%powderedeggalbumin和phosphate-bufferedsaline,pH7.4。所述的CMV反转录引物TGTGGGAATGCGTTGGTG；PVY反转录引物TTTATCTAAGACTTAATAATGCG。步骤（4）中所述的试剂，其终浓度分别为Tris-HCl20mM，KCl10mM，(NH4)2SO410mM，甜菜碱1.0M，外侧正向引物和外侧反向引物各0.2μM，内侧正向引物和内侧反向引物各1.6μM，Mg2+8mM，dNTPmix0.6mM，BstDNA聚合酶8U。本发明的有益效果：本发明通过将免疫学技术和分子生物学技术相结合，发挥单克隆抗体高特异性和LAMP技术高灵敏性的优点，开发的免疫捕获-环式等温扩增技术不仅可以在不依赖与核酸提取的步骤和复杂实验设备情况下对病原微生物进行高灵敏检测，还可以大大增加检测的特异性。附图说明图1为马铃薯Y病毒提纯病毒粒子的电镜照片；图2为CMV病毒提纯病毒粒子的电镜照片；图3为2PVY单抗的Westernblot分析，M：蛋白Maker，1和2：2个感染PVY的普通烟病叶组织；3和4：分别为健康的马铃薯和普通烟叶片组织；图4为CMV单抗的Westernblot分析，M：蛋白Maker；1：感染CMV的马铃薯植株；2：健康的马铃薯植株；图5为免疫捕获环式等温扩增体系建立验证试验结果；图6为灵敏性试验结果。具体实施方式一、CMV和PVY单抗的制备材料与方法病毒材料、培养基和抗体、膜、生化试剂PVY和CMV毒源由贵州省烟草科学研究院提供，经RT-PCR和核酸测序鉴定后繁殖于植物培养箱中生长的普通烟植物。RPMI-1640培养基、HAT、HT、抗体类型及亚类鉴定试剂盒、碱性磷酸酶(AP)标记的羊抗鼠IgG二抗购自Sigma公司。硝酸纤维素膜购自AmershamPharmacia公司。NBT/BCIP底物及TMB显色底物购自Promege公司，其他试剂为国产分析纯产品。PVY和CMV病毒粒子的提纯将PVY和CMV贵州分离物接种于三生烟上，两周后采集微量病叶进行RT-PCR检测，收集RT-PCR检测的呈阳性的三生烟组织200g，提纯PVY和CMV病毒粒子。杂交瘤细胞的制备以提纯的PVY和CMV病毒粒子作为免疫原，免疫8周龄的BALB/c小鼠，前三次均用50µg/只的病毒量免疫，第四次加强免疫的病毒量为100µg/只。腹水制备和抗体纯化用饱和硫酸铵盐析法纯化腹水单克隆抗体，步骤如下：1)取适量腹水单抗与3倍体积的生理盐水混匀后，边搅拌边向其缓慢滴加等体积的饱和硫酸铵溶液，搅拌混匀后放置4℃3h，待其充分沉淀后12000rpm离心15min；2)弃上清，用生理盐水悬浮沉淀，然后移入预先处理好的透析袋中，放入0.01MPBS缓冲液中4℃下缓慢搅拌透析，每隔2h换一次PBS缓冲液；3)将透析好的纯化抗体，取1µL用NanoDrop紫外分光仪测定其IgG的含量，分装于离心管中后于-80℃超低温冰箱冻存待用。抗体腹水效价的测定和类型及亚类鉴定以提纯的病毒(1µg/mL)或植物组织研磨液1:30倍稀释（w/v，g/mL）后作为抗原包被酶标板，倍比稀释的单抗腹水为一抗，AP标记的羊抗鼠IgG作为二抗，用间接ELISA方法测定腹水效价。采用美国Sigma公司的抗体类型和亚类鉴定试剂盒分析单克隆抗体的抗体类型及亚类。实验结果病毒粒子的提纯提纯的CMV和PVY经紫外分光仪测得其浓度别为5.6mg/mL和7.46mg/mL，经3%磷钨酸负染色后在电镜下观察，发现病毒提纯液中有较高浓度病毒粒子，其具有CMV和PVY粒子的典型形态和大小(图1和图2)。细胞的融合、杂交瘤的筛选和克隆经过四次免疫后取小鼠的脾细胞与SP2/0鼠骨髓瘤细胞在PEG下融合，用HAT培养基筛选培养12d后，倒置显微镜观察发现22块96孔细胞板的融合率为96%。当杂交瘤细胞生长至覆盖孔底20-30%时，用间接ELISA方法检测培养上清中的抗体。检测结果发现，共有298个孔呈阳性反应，阳性率为14%。经特异性分析以及3次细胞有限稀释法克隆，最终获得4株能稳定分泌PVY单克隆抗体的杂交瘤细胞株，5株能稳定分泌CMV单克隆抗体的杂交瘤细胞株。Westernblot分析PVY和CMV单抗的特异性Westernblot分析PVY单抗特异性的结果表明，有3株单抗均能与感染PVY的普通烟病叶中一条约30kDa大小的蛋白亚基特异性反应，而与健康的普通烟和马铃薯叶片组织没有任何反应信号(图3)，根据反应的蛋白分子量推测这3个单抗能特异性地识别PVY的外壳蛋白亚基。其中一支单抗的Westernblot结果分析发现，在感染PVY普通烟病叶组织中杂到有一条约55kDa大小的条带，而在健康的普通烟和马铃薯叶片组织中没有任何反应信号(2)，根据分子量推测此株单抗针对的抗原可能是NIb蛋白。利用Westernblot分析CMV单抗对CMV感染烟草植株组织的反应，结果表明，5个单克隆抗体均能与CMV感染的烟草植株中一条约34kDa蛋白亚基特异性反应，而与健康的烟草植株(CK-)没有任何反应。二、CMV和PVY免疫捕获环式等温扩增（IC-RT-LAMP）体系的建立２.１方法和材料阳性带毒样品的收集PVY、CMV毒源保存在三生烟上，植株在防虫网内生长。RT-PCR反应体系RNA的提取采用Trizol试剂提取法，反转录和PCR使用Promega公司的反转录试剂盒和GoTaq酶，具体方法参考试剂说明书。ELISA反应体系使用Agdia公司的CMV和PVY检测试剂盒作为ELISA检测对照，具体方法参考产品说明书。PCR管的抗体包被PCR管使用2.5%戊二醛和0.1MHCl处理，之后分别使用ddH2O和碳酸包被缓冲液（0.05M碳酸缓冲液，pH9.6）洗三次。使用包被缓冲液以1:200的比例稀释抗体，取50ul加入处理好的PCR管，4℃孵育过夜。之后以PBST清洗3遍备用。CMV和PVY免疫捕获环式等温扩增（IC-RT-LAMP）引物的设计引物名称靶标引物序列F3outerprimerCMVTGATTCTACCGTGTGGGTGB3outerprimerCMVCGGCGTACTTTCTCATGTCFIPinnerprimerCMVGCGAACATAGCAGAGATGGCG_GACAGTCCGCAAAGTTCCTGBIPinnerprimerCMVCAGTATGCAGCATCCGGAGTC_CCGCATCGCCGAAAGATCAF3outerprimerPVYCGAAATCTGCGGGATGTGGB3outerprimerPVYAGACATCCTCGGTGGTGTFIPinnerprimerPVYTCCCTAGCCCTCACTGGTGTTC_TTAGCGCGTTATGCCTTTGABIPinnerprimerPVYGCAGCATTGAAATCAGCCCAA_GCCTCTCTGTGTTCTCCTCT样品匀浆：免疫捕获-环式等温扩增检测样品匀浆：取0.1-0.2g发病样品，以1:10的比例加入抽提缓冲液（2%polyvinylpyrrolidone,0.2%powderedeggalbumin,phosphate-bufferedsaline,pH7.4），然后研磨匀浆，离心取上清100μl。反应过程：将烟草叶片匀浆液加入抗体包被的PCR管中，37℃孵育1-3h。孵育结束后倒掉匀浆液，然后用无菌水冲洗3遍。为了更好的释放病毒粒子，在PCR管中加入50μl无菌水，放在80℃金属浴中孵育10min，然后迅速转移至冰上。然后按照产品说明书加入GoScriptTMreactionmix和CMV和PVY特异反转录引物（CMV反转录引物TGTGGGAATGCGTTGGTG；PVY反转录引物TTTATCTAAGACTTAATAATGCG），最后加入GoScriptTM反转录酶，补充体积至100μl，反转录反应在42℃下进行60min。然后吸出10μl反转录产物作为LAMP反应底物，补充试剂和无菌水至25μl体系，试剂终浓度分别为Tris-HCl(pH8.8)20mM,KCl10mM,(NH4)2SO410mM,Betaine(Sigma-Aldrich,Okville,MA,U.S.A)1.0M，ofouterforwardprimerandouterreverseprimer引物0.2μM,ofprimerFIPandBIP引物1.6μM,Mg2+8mM，dNTPmix0.6mM，BstDNApolymerase(NewEnglandBiolabs,Beverly,MA,U.S.A)8U，整个反应在65℃下进行90min。2.2结果反应体系验证：分别采集PVY和CMV样品，以建立的免疫捕获环式等温扩增（IC-RT-LAMP）体系进行检测，同时见同样的样品提取RNA，采用RT-PCR的方法进行验证。结果显示（如图5），免疫捕获环式等温扩增（IC-RT-LAMP）可以与RT-PCR获得一致的检测结果。灵敏度比较：将提纯的病毒粒子按照10倍的梯度制备成一系列的浓度梯度（100-10-5），分别以ELISA、RT-PCR和免疫捕获环式等温扩增（IC-RT-LAMP）的方法进行检测，检测结果（如图6）显示，免疫捕获环式等温扩增（IC-RT-LAMP）灵敏度明显高于ELISA，接近RT-PCR。当前第1页1 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