一种基于导光毛细管的生化荧光分析仪及其检测方法与流程

本发明涉及一种生化分析仪及其检测方法，特别涉及一种基于导光毛细管的生化荧光分析仪及其检测方法，可用于液体和气体样品的分析检测。

背景技术：

对液体(或气体)样品的光学特性进行分析检测，是生化分析的一个重要领域(Scientific Reports，5，10476(2015))。例如，分光光度计可以对样品的吸光度进行检测，荧光分析仪(或激光诱导型荧光分析仪)可以对待测物(如生物基团等有机物)的受激发光进行检测。分光光度计与荧光分析仪属于不同的两种分析器件。

目前，无论是光度检测还是荧光检测，通常都是将样品置于比色皿中进行检测，激发光通过比色皿中的样品时，样品会吸收部分激发光(甚至会辐射出荧光)(Sensors andActuators B，191，561-566(2014))。因此，为了增加检测灵敏度，通常需要增加光与物质的相互作用，即增加激发光在样品中的传输距离(简称“光程”)。对于比色皿，增大尺寸可以增加光程、增加灵敏度，但是样品需求量也会增加。

利用导光毛细管(专利CN201210105716.9)可以大幅增加光程(如采用长的毛细管)，并且可以从一定程度上减少样品需求量。但是，长的毛细管会增加气泡在毛细管内的产生和堆积的几率，影响探测光束和样品在毛细管内的传输。

荧光检测的原理是待测物吸收激发光，会辐射出荧光，从而对辐射出的荧光进行分析检测。为了提高检测灵敏度，现有的荧光分析仪的设备相对来说体积较大，需要较多的试验样品，限制了荧光仪在便携检测领域和微样品领域的使用。因此设计研发新的荧光分析仪，缩短毛细管长度以减小设备体积的同时，可以提高检测灵敏度、并能减少样品需求量，是本发明的创研动机。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种结构简单、样品需求量少、高灵敏度的基于导光毛细管的生化荧光分析仪及其检测方法。

本发明提供的一种基于导光毛细管的生化荧光分析仪，其技术方案是：

一种基于导光毛细管的生化荧光分析仪，包括光源、荧光探测器和导光毛细管，导光毛细管的侧壁能够反射光源发射的激发光和待测样品吸收激发光后辐射出的荧光，导光毛细管的样品出口端设置有能够反射激发光的第一反射镜，荧光探测器能够接收从第一反射镜上射出的荧光。第一反射镜位于毛细管端面，可以将激发光反射回毛细管内，使得激发光在毛细管两端之间来回反射传输，从而在不增加毛细管长度的情况下大幅增加光程，从而提高了传感器的灵敏度。此时，在毛细管的侧壁和端面反射镜的共同约束下，可以阻止激发光泄露出毛细管。

其中，导光毛细管的样品入口端设置有能够反射激发光和荧光的第二反射镜。

其中，第二反射镜是金属膜反射镜或者介质膜反射镜，金属膜反射镜或者介质膜反射镜上具有小于导光毛细管内径的透光孔(即在反射镜的透光孔区域，未镀介质膜或金属膜，因此光束可以自由通过透光孔)。透光孔用以把激发光耦合进入毛细管内，金属膜反射镜或者介质膜反射镜可以是将金属膜或者介质膜镀在透光盖板上形成的反射镜。透光孔面积小于导光毛细管端面的面积，激发光初次通过透光孔进入导光毛细管之后，经过导光毛细管侧壁(及另一端的反射镜)的反射后，返回的激发光会偏离透光孔的位置，因此部分激发光无法再次通过反射镜，从而实现将激发光约束在导光毛细管内传输的目的。随着透光孔的减小，返回的激发光通过透光孔泄露出毛细管的比例会降低，因此，减小透光孔，更有利于约束激发光。

其中，第二反射镜是布拉格反射镜或者是具有Fabry-Perot滤波腔结构的反射镜(简称FP腔反射镜)，用于反射特定波段的光束。FP腔反射镜，当激发光的波长满足FP腔的谐振条件时，激发光可以初次通过FP腔、并进入导光毛细管内；之后，经过毛细管侧壁(及另一端的反射镜)的反射，返回的激发光再次入射到FP腔时，由于入射角会发生偏离(与初次通过FP腔的入射角相比)，返回的部分激发光无法再次通过FP腔；因此部分激发光无法重新通过反射镜，从而实现将激发光约束在毛细管内传输的目的。对于更高品质因子的FP腔，更小的入射角偏离，就可以阻碍激发光的通过，从而更有效的将激发光约束在导光毛细管内。

其中，第二反射镜是金属膜反射镜或者介质膜反射镜，光源发射的激发光耦合到光纤中，并经过光纤传输进入毛细管内，光纤的引入可以更好的把激发光和荧光约束在导光毛细管中传输。金属膜反射镜或者介质膜反射镜可以是将金属膜或者介质膜镀在透光盖板上形成的反射镜。

其中，导光毛细管的内径为0.02微米至9毫米，采用小孔径的毛细管有助于减小样品需求量、缩短样品切换时间，从而降低噪声响、提高测试精度。导光毛细管是石英管、镀金属膜的石英管、涂覆聚合物的石英管、聚合物管、或金属管。其中，优选内壁抛光的金属管。

其中，导光毛细管的形状可以是弯曲的、直的或弯曲的与直的结合的任一种；本发明的导光毛细管，无论是直的还是弯曲的毛细管，其均可以约束激发光。因此毛细管可以弯曲，以减小分析仪的长度和体积。弯曲的毛细管的形状可以是环形、弧形、螺旋形中的一种或者任意形状的毛细管。

其中，导光毛细管的内表面存在光滑的波纹起伏，可以使激发光的入射角发生改变，从而增加光程、提高检测精度。同时，光滑的毛细管内壁，可以减少光学散射损耗，从而降低激发光的传输损耗。

其中，光源是激光二极管、发光二极管或经过分光的宽光谱光源(如钨灯、氘灯、氙灯等)。分析不同物质选用不同波长的光源和激发光可以提高检测精度。

本发明还提供了一种基于导光毛细管的生化荧光分析仪的检测方法，包括以下步骤：

第一步，将标准样品导入导光毛细管中，把光源发射出的激发光耦合进入导光毛细管一端的内孔中；激发光经导光毛细管侧壁、第一反射镜和第二反射镜的反射在导光毛细管中传输，标准样品吸收激发光后辐射出荧光，辐射出的荧光透过第一反射镜被荧光探测器接收；记录此时荧光探测器接收到的光强度或光谱；

第二步，切换样品，将待测样品导入导光毛细管中，把光源发射出的激发光耦合进入导光毛细管一端的内孔中；激发光经导光毛细管侧壁、第一反射镜和第二反射镜的反射在导光毛细管中传输，待测样品吸收激发光后辐射出荧光，辐射出的荧光透过第一反射镜被荧光探测器接收；记录此时荧光探测器接收到的光强度或光谱；

第三步，对比荧光探测器探测到的待测样品与标准样品之间的光强度或光谱变化，从而获知待测样品与标准样品之间的荧光差异，并得到待测样品的组分与含量。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

本发明在导光毛细管的端面设置反射镜，可以增强对激发光的约束作用，从而提高光与物质的相互作用、提高检测灵敏度。并且，利用不同反射镜的组合，使得激发光可以高效的耦合进入毛细管，并能有效的阻止激发光泄露出毛细管。

附图说明

图1.本发明的一种基于导光毛细管的生化荧光分析仪实施例1的结构示意图。

图2.本发明的一种基于导光毛细管的生化荧光分析仪实施例2的结构示意图。

图3.本发明的一种基于导光毛细管的生化荧光分析仪实施例2的结构的反射原理示意图。

图4.本发明的一种基于导光毛细管的生化荧光分析仪实施例3的结构示意图。图5.本发明的一种基于导光毛细管的生化荧光分析仪实施例4的结构示意图。

具体实施方式

下面将结合实施例以及附图对本发明加以详细说明，需要指出的是，所描述的实施例仅旨在便于对本发明的理解，而对其不起任何限定作用。

实施例1

如图1所示，本实施例的一种基于导光毛细管的生化分析仪，包括激光二极管1，荧光探测器6，侧壁可以反射激发光和荧光的导光毛细管9。生化分析仪还具有以下特征：导光毛细管9的形状是直的；两端设有密封盖3；入口端设有样品入口4(位于密封盖内)和透光盖板11；出口端设有样品出口5(位于密封盖内)和第一反射镜10。激光二极管1发射的激发光2具有以下特征：激发光2经透光盖板11耦合进入导光毛细管9的入口端；经导光毛细管9内壁反射，激发光2在导光毛细管9内传输；在导光毛细管9的出口端，激发光2经第一反射镜10反射后，返回毛细管的入口端。

当待测样品通过样品入口4和样品出口5流经导光毛细管9时，待测样品吸收激发光2的能量、并发出荧光。由于该荧光的波长与激发光2的波长不同，该荧光可以通过第一反射镜10、并被荧光探测器6探测接收。通过测量该荧光的波长和能量，可以获知待测样品的组分与含量。

本实施例的第一反射镜10对激发光2具有高的反射率，同时对荧光具有高的透射率。因此，第一反射镜10可以将激发光2反射回去，从而增加毛细管内的光程、增加探测灵敏度；并且可以有效的将激发光2与荧光分开，从而避免激发光2干扰荧光探测器6对荧光的检测。因此，第一反射镜10的引入，即增加了检测灵敏度，又降低了荧光检测干扰。

实施例2

如图2所示，本实施例的一种基于导光毛细管的生化分析仪，包括激光二极管1，荧光探测器6，侧壁可以反射激发光和荧光的导光毛细管9。生化分析仪还具有以下特征：样品入口4端设有透光盖板11；样品出口5端设有第一反射镜10，第一反射镜10优选介质膜反射镜。透光盖板11的表面镀了金属膜或介质膜12作为第二反射镜，用于反射激发光2，并且金属膜或介质膜12的中心具有透光孔13。该透光孔13的直径小于导光毛细管9的内径。参见图2和图3所示，导光毛细管内径8为0.02微米-9毫米，优选0.09微米-0.9毫米，采用小孔径的毛细管有助于减小样品需求量、缩短样品切换时间，从而降低噪声响、提高测试精度。采用本实施例的带有反射镜的导光毛细管，因为激发光可以在导光毛细管内来回传输，导光毛细管长度L可以变短，从而减小传感器的体积。

激光二极管1发射的激发光具有以下特征(反射原理如图3所示)：初次入射的激发光21经透光孔13耦合进入导光毛细管9的入口端、并在导光毛细管9内传输；在导光毛细管9的出口端，激发光经第一反射镜10反射后，返回毛细管的入口端，反射回的激发光22入射到金属膜或介质膜12上；由于经过多次反射，返回的激发光会偏离透光孔的位置，此时部分激发光则入射在金属膜或介质膜12上(未入射到透光孔13内)并被反射回导光毛细管内。

当待测样品流经导光毛细管9时，待测样品在激发光2的激发下，发出荧光。由于该荧光的波长与激发光2的波长不同，该荧光可以通过第一反射镜10、并被荧光探测器6接收。通过测量该荧光的能量，可以获知待测样品的组分与含量。

由于第一反射镜10和金属膜或介质膜12对激发光2具有高的反射率，因此，利用金属膜或介质膜12和第一反射镜10，可以将激发光2约束在导光毛细管9内部来回传输，从而提高光程、提高检测灵敏度。当透光孔13的直径减小时，激发光2通过透光孔13泄露出毛细管的比例降低，从而增强金属膜或介质膜12对激发光2的约束效果。

实施例3

如图4所示，本实施例的一种基于导光毛细管的生化分析仪，包括钨灯1，荧光探测器6，侧壁可以反射激发光和荧光的导光毛细管9。生化分析仪还具有以下特征：样品入口4端设有透光盖板11；样品出口5端设有镀有介质膜的第一反射镜10。透光盖板上镀膜形成第二反射镜，本实施例中第二反射镜是布拉格反射镜或者是具有F曲ry-Perot滤波腔结构的反射镜14。

钨灯1发射的宽光谱光束，经过布拉格反射镜或者是具有Fabry-Perot滤波腔结构的反射镜14滤波后，只有特定波长λ₀的光束(该光束作为“激发光2”)可以初次通过布拉格反射镜或者是具有Fabry-Perot滤波腔结构的反射镜14，并进入导光毛细管9内传输；然后，在导光毛细管9的样品出口端，激发光2经第一反射镜10反射后，返回导光毛细管的样品入口端，并再次入射到布拉格反射镜或者是具有Fabry-Perot滤波腔结构的反射镜14上；此时，由于经过多次反射，与初次通过布拉格反射镜或者是具有Fabry-Perot滤波腔结构的反射镜14的入射角相比，激发光2的入射角会发生偏离，部分激发光2无法再次通过布拉格反射镜或者是具有Fabry-Perot滤波腔结构的反射镜14(因为入射角的改变，会使得FP腔的谐振波长发生变化)。因此，部分激发光无法重新通过布拉格反射镜或者是具有Fabry-Perot滤波腔结构的反射镜14，从而实现将激发光约束在毛细管内传输的目的。对于高品质因子的FP腔，小的入射角偏离，就可以阻碍激发光的通过，从而更有效的将激发光约束在导光毛细管内。

实施例4

如图5所示，本实施例的一种基于导光毛细管的生化分析仪，包括发光二极管(LED)1，荧光探测器6，侧壁可以反射激发光和荧光的金属导光毛细管9，金属导光毛细管9的内壁经过抛光处理。生化分析仪还具有以下特征：样品入口4端设有透光盖板11；样品出口5端设有镀有介质膜或者金属膜的第一反射镜10。透光盖板11的表面镀了金属膜或介质膜12作为第二反射镜。其中，金属膜或介质膜12对激发光2和荧光都具有高反射率，第一反射镜10对激发光有高的反射率、对荧光具有低的反射率。

发光二极管1发射的激发光2耦合到光纤16中，并经过光纤16传输进入金属导光毛细管9内；然后，经过第一反射镜10和金属膜或介质膜12反射，激发光2被约束在金属导光毛细管9内来回传输。本实施例的光纤的端面直径为4微米～100微米，远小于金属导光毛细管9的内径；并且激发光2经过多次的反射传输后，光束直径(束斑)会变得远大于光纤直径；因此，激发光2返回光纤内(即泄露出毛细管)的比例很低，大部分的激发光2被约束在金属导光毛细管9内来回反射传输，从而提高检测灵敏度。

本实施例的一种基于导光毛细管的生化荧光分析仪的检测方法，包括以下步骤：

第一步，将标准样品导入金属导光毛细管中，把光源1发射出的激发光2通过光纤16耦合进入金属导光毛细管一端的内孔中；激发光经金属导光毛细管侧壁、第一反射镜10和第二反射镜的反射在金属导光毛细管中传输，标准样品吸收激发光后辐射出荧光，辐射出的荧光透过第一反射镜被荧光探测器6接收；记录此时荧光探测器接收到的光强度或光谱；

第二步，切换样品，将待测样品导入金属导光毛细管中，把光源1发射出的激发光2通过光纤16耦合进入金属导光毛细管一端的内孔中；激发光经金属导光毛细管侧壁、第一反射镜10和第二反射镜的反射在金属导光毛细管中传输，待测样品吸收激发光后辐射出荧光，辐射出的荧光透过第一反射镜被荧光探测器6接收；记录此时荧光探测器接收到的光强度或光谱；

第三步，对比荧光探测器探测到的待测样品与标准样品之间的光强度或光谱变化，从而获知待测样品与标准样品之间的荧光差异，并得到待测样品的组分与含量。

本实施例的金属导光毛细管存在以下优点：①与塑料材质毛细管相比，金属材料致密，内部不存在孔隙，并且金属材料表面可以通过抛光处理，因此对光束的散射损耗极低，也不会吸附液体中的物质；②金属表面对光的全反射不受角度限制，因此可以大幅增加光程，提高检测精度；③无需与玻璃或塑料材料混合使用，单一金属材料即可实现约束光波传输的功能，因此消除了光波溢出到石英管或塑料管测壁内传输的缺点。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。