一种细胞内ATP的圆二色光谱实时检测方法与流程

本发明涉及一种细胞内ATP的圆二色光谱实时检测方法，属于材料化学技术领域。

背景技术：

三磷酸腺苷(Adenosine-5’-triphosphate，ATP)是体内组织细胞所需能量的主要来源，作为能量货币，其参与基因复制，蛋白质或脂类的激酶活性，膜离子通道泵，免疫和神经介导的反应，药物传递等生物活性调节。同时，细胞中ATP的含量的变化可以反映细胞的变异和损伤，以及与贫血、低血糖、心血管疾病以及癌症等疾病的发生关系密切。因此ATP作为重大疾病的标志物之一得到了广泛的关注和研究。

传统上ATP检测的方法主要有：高效液相色谱、毛细管电泳和核磁共振波谱分析等，但这些利用细胞裂解液的分析方法存在有ATP潜在的降解，并且分析时间长，使实时检测很难实现；近年来，荧光分析法、化学发光和电化学跟踪技术等都用于胞内ATP的实时检测中，但这些方法操作繁琐，样品消耗量大，检测时间长、性能不稳定，难以微型化。

近几年来，利用自组装纳米材料构建圆二色传感器进行生物传感得到了广泛的关注。圆二色光谱（CD）是一种已被广泛应用于化学和生物传感的分析方法，相比于荧光技术检测，由于纳米粒子之间的等离子体−等离子体耦合、诱导等离子体CD通过激子−等离子体耦合、混合偶极−偶极之间的耦合和最小矩阵干扰，使得CD能够收集样品足够多的信息，并达到灵敏度低的检测水平，具有更大的潜在生物标志物分析应用能力。但是通过自组装的手性大小金二聚体的纳米传感器实现细胞内ATP含量的实时检测还未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种细胞内ATP的圆二色光谱实时检测方法。

本发明的技术方案，一种细胞内ATP的圆二色光谱实时检测方法，步骤为：

（1）ATP 适配体序列组装构建的圆二色大小金二聚体传感器：柠檬酸还原法合成的25nm金纳米粒子GNP离心重悬后修饰巯基ATP aptamer序列；15nm金纳米粒子GNP修饰与适配体部分互补的巯基序列ATP CS1，将得到的GNP-aptamer及GNP- CS1复合体混匀，得到ATP适配体序列组装的圆二色大小金二聚体aptamer-dimer；

（2）ATP错配序列组装构建的圆二色大小金二聚体传感器：柠檬酸还原法合成的25nm金纳米粒子GNP离心重悬后修饰巯基mismatch DNA序列；15nm金纳米粒子GNP修饰与ATP错配序列部分互补的巯基ATP CS2序列，将得到的GNP-mismatch及GNP- CS2复合体混匀，得到ATP错配序列组装的圆二色大小金二聚体mismatch-dimer；

（3）两种大小金二聚体修饰穿膜肽：将步骤（1）及（2）得到大小金二聚体分别与SH-PEG-5000和穿膜肽TAT混匀，偶联12h，分别得到表面修饰有穿膜肽的圆二色性TAT-aptamer-dimer及 TAT-mismatch-dimer；

（4）两种大小金二聚体传感器在细胞内圆二色信号随时间的变化：分别将步骤（3）得到两种穿膜肽修饰的圆二色大小金二聚体与一定数量的细胞共同培养不同时间点后，用胰蛋白酶消化细胞，分别得到细胞内含有不同量的圆二色aptamer-dimer及mismatch-dimer的细胞悬液；将细胞悬液进行圆二色性表征，记录不同时间点的圆二色信号，绘制散点图，得到胞内最佳检测时间。

（5）基于大小金二聚体的圆二色信号实现胞内ATP实时检测：将步骤（3）得到穿膜肽修饰的圆二色性TAT-aptamer-dimer与添加不同抑制剂和促进剂的细胞及未处理的细胞分别共同孵育，当存在待测物ATP时，组装体逐渐解散，导致圆二色信号的变化，进而进行检测，建立胞内ATP浓度与圆二色光谱的标准曲线。

具体步骤如下：

（1）ATP 适配体序列组装构建的圆二色大小金二聚体传感器：柠檬酸还原法合成的25nm金纳米粒子GNP离心重悬于5mM pH 7.4的PB缓冲液中，取100 μL 2nM 25nm金纳米粒子将其与巯基ATP aptamer序列以摩尔浓度1︰5的比例混匀；将柠檬酸还原法合成的15nm金纳米粒子GNP离心重悬于5mM pH 7.4的PB缓冲液中，取100 μL 2nM 15nm金纳米粒子与适配体部分互补的巯基ATP CS1序列以摩尔浓度1︰5的比例混匀，分别加入终浓度为50mM的NaCl溶液，充分混合后，室温孵育过夜后，离心3次除去溶液中未反应的DNA，分别重悬于100μL的5mM PB缓冲液中，取100μL GNP-aptamer及50μL GNP-CS1复合体混匀，加入NaCl溶液至终浓度为50mM进行老化，室温下孵育12h，得到ATP适配体序列组装的圆二色大小金二聚体aptamer-dimer，待用；

（2）ATP错配序列组装构建的圆二色大小金二聚体传感器：柠檬酸还原法合成的25nm金纳米粒子GNP离心重悬于5mM PH 7.4的pB缓冲液，取100μL 2nM 25nm金纳米粒子将其与巯基mismatch DNA序列以摩尔浓度1︰5的比例混匀；将柠檬酸还原法合成的15nm金纳米粒子GNP离心重悬于5mM pH 7.4的PB缓冲液中，取100μL 2nM 15nm金纳米粒子与适配体部分互补的巯基ATP CS2序列以摩尔浓度1︰5的比例混匀，分别加入终浓度为50mM的NaCl溶液中，充分混合后，室温孵育过夜，离心3次除去溶液中未反应的DNA，分别重悬于100μL的5 mM PB缓冲液中；取100μL GNP-mismatch及50μL GNP-CS2复合体混匀，加入NaCl溶液至终浓度为50mM进行老化，室温下孵育12h，得到ATP错配序列组装的圆二色大小金二聚体mismatch-dimer，待用；

（3）两种大小金二聚体修饰穿膜肽：将步骤（1）及（2）得到大小金二聚体分别与SH-PEG5000和穿膜肽TAT以1︰1000︰100的摩尔浓度混匀，室温孵育12h后，7500rpm离心20min，去除上清液，沉淀重悬于细胞培养液中，得到稳定的表面修饰有穿膜肽的圆二色TAT-aptamer-dimer及 TAT-mismatch-dimer；

（4）两种大小金二聚体传感器在细胞内圆二色信号随时间的变化：将细胞接种于24孔培养板中，使每孔中的细胞数量为10⁴个，培养24h后去掉培养液，取8个孔加入终浓度为5nM的穿膜肽修饰的圆二色TAT-aptamer-dimer分别与10⁴个细胞共同培养0h、2h、4h、6h、8h、12h、16h、24h；取8个孔加入终浓度为5nM的穿膜肽修饰的圆二色性TAT-mismatch-dimer分别与10⁴个细胞共同培养0h、2h、4h、6h、8h、12h、16h、24h；之后分别用胰蛋白酶消化细胞，分别得到细胞内含有不同量的圆二色aptamer-dimer及 mismatch-dimer的细胞悬液。将细胞悬液进行圆二色性表征，记录不同时间点的圆二色信号，绘制散点图，得到胞内最佳检测时间；

（5）基于大小金二聚体的圆二色信号实现胞内ATP实时检测：在将步骤（3）得到穿膜肽修饰的圆二色性TAT-aptamer-dimer与不同量寡霉素A抑制细胞中ATP浓度、不同量依托泊苷促进细胞中ATP浓度及未经处理的细胞分别共孵育6h后，当存在待测物ATP时，组装体逐渐解散，导致圆二色信号的变化，进而进行检测，然后用1mL胰蛋白酶消化细胞，分别得到细胞内含有不同解散程度的圆二色性aptamer-dimer的细胞悬液，将细胞悬液进行圆二色性表征，并建立胞内ATP浓度与圆二色信号的标准曲线。

所述ATP aptamer序列如SEQ ID NO. 1所示，ATP CS1序列如SEQ ID NO. 2所示，mismatch DNA序列如SEQ ID NO. 3所示，ATP CS2序列如SEQ ID NO. 4所示， TAT 多肽序列如SEQ ID NO. 5所示，具体如表1所示。

表1

本发明的有益效果：本发明制备出了组装产率高，性质稳定，在细胞中分散性好的的金纳米粒子二聚体，提供了能够通过圆二色光谱实时检测胞内ATP含量的方法，建立了细胞内ATP浓度与圆二色信号强度两者之间的标准曲线，具有灵敏度高、选择性好，省时省力的优点，具有非常好的实际应用前景。

附图说明

图1是本发明的金纳米粒子二聚体在细胞中的生物透射电镜图。

图2是本发明中两种大小金二聚体传感器在细胞内圆二色信号随时间的变化，绘制散点图。

图3是本发明中穿膜肽修饰的圆二色性TAT-aptamer-dimer与添加不同抑制剂和促进剂的细胞及未处理的细胞分别共同孵育后圆二色信号的变化谱图。

图4是胞内ATP浓度与圆二色信号的标准曲线。

具体实施方式

以下实施例中序列材料购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

实施例1

所有的玻璃仪器都用王水浸泡24h，并用双蒸水清洗，晾干备用。实验中使用的水均为18.2MΩ 的Milli-Q超纯水。

（1）ATP 适配体序列组装构建的圆二色大小金二聚体传感器：柠檬酸还原法合成的25nm金纳米粒子GNP离心重悬于5mM pH 7.4的PB缓冲液中，取100 μL 2nM 25nm金纳米粒子将其与巯基ATP aptamer序列以摩尔浓度1︰5的比例混匀；15nm金纳米粒子GNP离心重悬于5mM pH 7.4的PB缓冲液中，取100 μL 2nM 15nm金纳米粒子与适配体部分互补的巯基序列ATP CS1以摩尔浓度1︰5的比例混匀，分别加入终浓度为50mM的NaCl溶液，充分混合后，室温孵育过夜后，离心3次除去溶液中未反应的DNA，分别重悬于100μL的5mM PB缓冲液中，取100μL GNP-aptamer及50μL GNP-CS1复合体混匀，加入NaCl溶液至终浓度为50mM进行老化，室温下孵育12 h，得到ATP适配体序列组装的圆二色大小金二聚体aptamer-dimer，待用；

（2）ATP错配序列组装构建的圆二色大小金二聚体传感器：柠檬酸还原法合成的25nm金纳米粒子GNP离心重悬于5mM pH 7.4的PB缓冲液，取100μL 2nM 25nm金纳米粒子将其与巯基mismatch DNA序列以摩尔浓度1︰5的比例混匀；15nm金纳米粒子GNP离心重悬于5mM pH 7.4的PB缓冲液中，取100μL 2nM 15nm金纳米粒子与ATP适配体部分互补的巯基ATP CS2序列以摩尔浓度1︰5的比例混匀，分别加入终浓度为50 mM的NaCl溶液，充分混合后，室温孵育过夜后，离心3次除去溶液中未反应的DNA，分别重悬于100μL的5 mM PB缓冲液中，取100μL GNP-mismatch及50μL GNP-CS2复合体混匀，加入NaCl溶液至终浓度为50mM进行老化，室温下孵育12h，得到ATP错配序列组装的圆二色大小金二聚体mismatch-dimer，待用；

（3）两种大小金二聚体修饰穿膜肽：将步骤（1）及（2）得到大小金二聚体分别与SH-PEG5000和穿膜肽TAT以1︰1000︰100的摩尔浓度混匀，室温孵育12h后，7500 rpm离心20 min，去除上清液，沉淀重悬于细胞培养液中，得到稳定的表面修饰有穿膜肽的圆二色性TAT-aptamer-dimer及 TAT-mismatch-dimer，金纳米粒子二聚体在细胞中的生物透射电镜图如图1所示。

（4）两种大小金二聚体传感器在细胞内圆二色信号随时间的变化：将细胞接种于24孔培养板中，使每孔中的细胞数量为10⁴个，培养24h后去掉培养液，取8个孔加入终浓度为5nM的穿膜肽修饰的圆二色性TAT-aptamer-dimer分别与10⁴个细胞共同培养0h、2h、4h、6h、8h、12h、16h、24h；取8个孔加入终浓度为5nM的穿膜肽修饰的圆二色性TAT-mismatch-dimer分别与10⁴个细胞共同培养0h、2h、4h、6h、8h、12h、16h、24h；之后分别用胰蛋白酶消化细胞，分别得到细胞内含有不同量的圆二色性aptamer-dimer及 mismatch-dimer的细胞悬液；将细胞悬液进行圆二色性表征，记录不同时间点的圆二色信号，绘制散点图如图2所示，得到胞内最佳检测时间。

（5）基于大小金二聚体的圆二色信号实现胞内ATP实时检测：将不同量寡霉素A抑制后、不同量依托泊苷促进后及未经抑制的细胞裂解液用ELISA标准曲线进行胞内ATP的定量。在将步骤（3）得到穿膜肽修饰的圆二色性TAT-aptamer-dimer与不同量寡霉素A抑制后、不同量依托泊苷促进后及未经抑制的细胞分别共孵育6h后，当存在待测物ATP时，组装体逐渐解散，导致圆二色信号的变化，进而进行检测，然后用胰蛋白酶消化细胞，分别得到细胞内含有不同解离程度的圆二色性aptamer-dimer的细胞悬液，穿膜肽修饰的圆二色性TAT-aptamer-dimer与添加不同抑制剂和促进剂的细胞及未处理的细胞分别共同孵育后圆二色信号的变化谱图如图3所示；对细胞悬液进行圆二色性表征，并建立胞内ATP浓度与圆二色信号的标准曲线，具体如图4所示。

SEQ ID NO. 1：

ATP aptamer：5’-TTTTTTTTTA CCTGGGGGAG TATTGCGGAG GAAGGT-3’；

SEQ ID NO. 2：

ATP CS1：5’-TTTTTTTCCT ACCTCAGCAA TACTCCTCCA GGA-3’；

SEQ ID NO. 3：

mismatch DNA：5’-TTTTTTTTTA CGTGGGAGAG TATTGCGGAG GAAGGT-3’；

SEQ ID NO. 4：

ATP CS2：5’-TTTTTTACCT ACCTCCGCAA TACTCCTCCA GGA-3’；

SEQ ID NO. 5：

TAT：5’-YGRKKRRQRR RC-3’。