沉降型纳米材料-污染物体系生物效应的检测装置及应用的制作方法

本发明涉及生态风险评价领域，尤其涉及一种沉降型纳米材料-污染物体系生物效应的检测装置及应用。

背景技术：

纳米技术被誉为是21世纪三大支柱技术之一。由于其特殊性质纳米材料被广泛应用于各个领域，但纳米材料在使用和废弃的过程中将不可避免地进入环境和生态系统，从而引发多种生物学效应。目前，纳米材料的生物效应研究多限于单一物质在实验室条件下的毒性作用，然而在实际自然环境中，纳米材料往往与多种污染物同时存在并发生复杂的相互作用。纳米材料相对于宏观颗粒物具有更大的比表面积，一旦进入环境中，可显著影响和改变环境中污染物的环境行为或导致污染物生物有效性和毒性效应的改变。如纳米二氧化钛因其比表面积高和独特的表面化学性质常作为吸附剂来处理水环境中的重金属以及有机污染物，同时水体也被认为是纳米二氧化钛在环境中循环积聚的最终场所，因此其可与各种污染物充分接触，并有可能吸附大量污染物成为毒物的载体增大其在水生生物体内总量，进而放大毒性作用。目前，关于纳米材料载体与环境污染物之间相互作用的研究尚处起步阶段，其联合毒性亟待深入研究。

如何模拟并反应真实环境中掺杂有纳米材料的二元及多元污染物的相互作用、环境过程及毒性变化，是纳米材料环境释放及生态健康评估的重点与难点。然而在此方面研究逐年增多的同时我们不难发现，现有研究大多方式单一，常采用受试生物暴露于“纳米材料-污染物”混合液后的生物效应与对照组相比的简单模式即得最终结论，但纳米材料自身具有多种特点，大多具有沉降作用并可有效吸附多种污染物，其聚集沉降作用在导致污染物浓度局部增大的同时，采用生活于不同水层的实验动物亦会得到相反的结果，不同水特性的纳米材料同样会导致复合体不同的环境归趋。但现有的相关研究均以单一方式进行，研究中大多实验条件并不相同，得到的结论也各有侧重，并未考虑真实水样中的污染物环境过程与分布归趋，往往以一种受试动物的直接结果作为纳米材料-污染物复杂体系环境效应的最终结论，致使现有研究结果并不完全一致，因此相关的研究模式中以一概全的研究方法有待进一步的改善和优化。

因此，制作一种可用于区分纳米材料-污染物复杂体系不同组分生物效应的简易装置，具备放置简单、温度等各参数易控的条件，同时能反映纳米材料对环境污染物的归趋作用，具有非常重要的应用价值，同时也是一个技术难点。本发明正是针对上述问题，重点围绕反应真实环境中不同组分污染物生物效应及水层归趋等方面进行一定的改进。超滤膜对纳米材料的迁移具有阻断作用，而对重金属离子和小分子量污染物具有渗透作用直至两边离子强度一致；其中，对超滤膜的灵活应用对该技术难点的优化具有重要作用。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种适用于小型水生底栖生物的可区分纳米材料-污染物复杂体系不同组分生物效应，放置简单、温度参数易控，同时能反映纳米材料对环境污染物的归趋作用的沉降型纳米材料-污染物体系生物效应的检测装置及应用。

本发明是通过以下技术方案实现的，本发明公开了一种沉降型纳米材料-污染物体系生物效应的检测装置，用于小型水生底栖生物，包括生物培养系统及位于其内部的生物隔离系统；所述生物培养系统包括底盘及位于其上端的外盖；所述生物隔离系统包括隔层片，所述隔层片位于底盘内，又进一步地包括至少四个普通隔层片与一个过滤隔层片。

作为本发明的优选方式之一，所述底盘为开口向上的圆盘状底盘，所述外盖为开口向下的圆形外盖。

作为本发明的优选方式之一，所述底盘的开口直径略小于外盖的开口直径，所述外盖的高度略小于底盘的高度。

作为本发明的优选方式之一，所述隔层片均相交于底盘的正中心位置，且各隔层片之间及与底盘间无缝隙连接。

作为本发明的优选方式之一，所述底盘为聚苯乙烯底盘，所述外盖为聚苯乙烯外盖，所述普通隔层片为聚苯乙烯普通隔层片。

作为本发明的优选方式之一，所述过滤隔层片为超滤膜过滤隔层片。

本发明还公开了使用上述沉降型纳米材料-污染物体系生物效应的检测装置的应用，包括以下步骤：

⑴对照组及实验组的划分：

对上述沉降型纳米材料-污染物体系生物效应的检测装置的生物培养系统中被隔层片划分形成的扇形孔进行分组，并设置一个对照组和四个实验组，分别为：空白对照组、单一纳米材料暴露组、无纳米材料掺杂的污染物暴露组、额外掺杂纳米材料的同浓度污染物暴露组、无纳米材料掺杂的同浓度污染物暴露组，其中，超滤膜隔层片位于额外掺杂纳米材料的同浓度污染物暴露组与无纳米材料掺杂的同浓度污染物暴露组之间；此外，可根据需要再另设实验组；

⑵污染物暴露液的制备：

在各扇形孔中添加所需实验动物的对应生物培养液，随后，分别按步骤(1)的分组制备各组污染物暴露液；

⑶取样及物化表征分析：

一段时间后，吸取各暴露组液体，并对其进行相互作用的物化表征；

⑷实验动物的处理：

对实验动物进行生长期同步化处理，随后将生长期一致的实验动物用于后续实验；

⑸实验动物的添加及生物效应的变化：

将实验动物及其食物等量放入各组，一段时间后，分离生物样品，检测各组污染物生物有效性及其生物积累量的变化。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤(3)中物化表征检测方法为电感耦合等离子体原子发射光谱、X射线光电子能谱、能谱及红外线光谱。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤(5)中污染物生物有效性检测方法为对不同组的动物进行相应生殖腺细胞凋亡数检测。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤(5)中生物积累量的检测方法为电感耦合等离子体质谱。

本发明相比现有技术的优点在于：本发明提供的装置集成了形小易控、对比明确、可对纳米材料-污染物复杂体系的环境过程分层、分组分解析的功能。纳米材料易吸附污染物并发生聚集、沉降作用，易使不同水层浓度变化，而两边未吸附并游离的污染物会因装置中超滤膜的渗透作用而变化浓度直至两边平衡，但对纳米材料的运动具有隔绝作用。内设超滤膜的装置适用于秀丽隐杆线虫等小型水生底栖生物，经超滤膜分隔的两组经过一定环境时间后，可达到一组为水环境底层暴露，另一组为水环境上层污染物暴露的效果，在反应污染物水环境过程及归趋上具有较好效果，还能对游离的污染物毒性贡献进行一定的分析。本发明装置的应用可为受试动物的各种体征研究提供一个平台，使得利用秀丽隐杆线虫等常用模式生物进行快速的生物监测以评价真实环境中掺杂纳米材料的二元污染物相互作用的生态风险和环境健康效应成为可能。该装置使用简单，适合相关研究的推广应用。

附图说明

图1是实施例1中的一种沉降型纳米材料-污染物体系生物效应的检测装置的开盖状态的整体结构示意图；

图2是实施例1中的一种沉降型纳米材料-污染物体系生物效应的检测装置的闭盖状态的整体结构示意图；

图3是实施例1中的一种沉降型纳米材料-污染物体系生物效应的检测装置的应用的结构示意图；

图4是实施例1中的一种沉降型纳米材料-污染物体系生物效应的检测装置的应用的纳米二氧化钛与重金属镉相互作用的能谱(EDX)检测图；

图5是实施例1中的一种沉降型纳米材料-污染物体系生物效应的检测装置的应用的纳米二氧化钛与重金属镉相互作用的X射线光电子能谱分析(XPS)检测图；

图6是实施例1中的一种沉降型纳米材料-污染物体系生物效应的检测装置的应用的各暴露组的线虫单条生殖腺细胞凋亡数对比图。

图中：1为底盘，2为外盖，3为隔层片，31为普通隔层片，32为过滤隔层片，4为秀丽隐杆线虫，5为空白对照组，6为无纳米材料掺杂的污染物暴露组，7为额外掺杂纳米材料的同浓度污染物暴露组，8为无纳米材料掺杂的同浓度污染物暴露组，9为单一纳米材料暴露组。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

如图1-图2所示，本实施例的一种沉降型纳米材料-污染物体系生物效应的检测装置，适用于小型水生底栖生物，包括生物培养系统及位于其内部的生物隔离系统。

生物培养系统包括底盘1及位于其上端的外盖2，底盘1为开口向上的圆盘状底盘，外盖2为开口向下的圆形外盖，其中，底盘1的开口直径略小于外盖2的开口直径，外盖2的高度略小于底盘1的高度，当该装置用于生物培养时，外盖2完全罩住底盘1。

生物隔离系统包括隔层片3，隔层片位于底盘1内，又进一步地包括四个普通隔层片31与一个过滤隔层片32，四个普通隔层片31与一个过滤隔层片32相交于底盘1的正中心位置，且各隔层片3之间及与底盘1间均无缝隙连接，其中，过滤隔层片32为超滤膜过滤隔层片，所用超滤膜的孔径需小于纳米材料的粒径。当该装置用于沉降型纳米材料-污染物体系生物效应的检测时，超滤膜对纳米材料的迁移具有阻断作用，而对重金属离子和小分子量污染物则具有渗透作用扩散至超滤膜两边，直至两边离子强度一致。

进一步的，底盘1为聚苯乙烯底盘，外盖2为聚苯乙烯外盖，普通隔层片为31聚苯乙烯普通隔层片。

如图3所示，本实施例的一种使用上述沉降型纳米材料-污染物体系生物效应的检测装置的应用，采用一种生态环境评价的敏感指示生物-秀丽隐杆线虫4作为实验动物，包括以下步骤：

⑴对照组及实验组的划分：

对上述沉降型纳米材料-污染物体系生物效应的检测装置的生物培养系统中被隔层片3划分形成的扇形孔进行分组，并设置一个对照组和四个实验组，分别为：空白对照组5、单一纳米材料暴露组9、无纳米材料掺杂的污染物暴露组6、额外掺杂纳米材料的同浓度污染物暴露组7、无纳米材料掺杂的同浓度污染物暴露组8，其中，采用超滤膜的过滤隔层片32位于额外掺杂纳米材料的同浓度污染物暴露组7与无纳米材料掺杂的同浓度污染物暴露组8之间；

⑵污染物暴露液的制备：

在各孔中分别添加等体积K-M(51mM NaCl，32mM KCl)线虫培养液，随后，分别按步骤(1)的分组分别于各孔添加纳米二氧化钛与重金属镉，制备各组污染物暴露液，具体为：空白对照组5、单一纳米材料暴露组9(纳米二氧化钛暴露组)、无纳米材料掺杂的污染物暴露组6(重金属镉暴露组)、额外掺杂纳米材料的同浓度污染物暴露组7(添加纳米二氧化钛的重金属镉暴露组)、无纳米材料掺杂的同浓度污染物暴露组8(与额外掺杂纳米材料的同浓度污染物暴露组7之间存在离子可透超滤膜的重金属镉暴露组)，其中，单一纳米材料暴露组9与额外掺杂纳米材料的同浓度污染物暴露组7的纳米二氧化钛浓度相同，无纳米材料掺杂的污染物暴露组6、额外掺杂纳米材料的同浓度污染物暴露组7与无纳米材料掺杂的同浓度污染物暴露组8的重金属镉污染物的浓度相同；

⑶取样及物化表征分析：

24h后，吸取各暴露组液体，对无纳米材料掺杂的污染物暴露组6、额外掺杂纳米材料的同浓度污染物暴露组7及无纳米材料掺杂的同浓度污染物暴露组8进行电感耦合等离子体原子发射光谱(ICP-AES)检测镉浓度变化；额外掺杂纳米材料的同浓度污染物暴露组7在经过干燥处理后进，对其行X射线光电子能谱分析(XPS)、能谱(EDX)及红外线光谱(FT-IR)等物化相互作用分析；

⑷实验动物的处理：

将处于成虫期的秀丽隐杆线虫4进行裂解液(0.7mL M9，0.2mL体积分数为20％的次氯酸钠，0.1mL 5M的氢氧化钠)同步化处理，将从成虫体内裂解出的虫卵置于3mL的M9缓冲液(1000mL的蒸馏水中加入12.1g Na2HPO4·12H2O，3g KH2PO4，5g NaCl和1mL1mol/L MgSO4，高温灭菌)中于20摄氏度恒温培养箱中孵育24小时，解剖镜下观察至95％以上虫卵孵化即同步化成功；

接着，将孵化的L1期幼虫接于铺有OP50(尿嘧啶渗透突变型大肠杆菌)的NGM秀丽隐杆线虫固体培养基(1000mL的培养基加入2.5g蛋白胨，3g NaCl，17g琼脂，975mL蒸馏水，灭菌后分别加入25mL单独灭菌的l mol/L K2HPO4-KH2PO4缓冲液(pH6.0)，1mL胆固醇溶液(5mg/mL 95％乙醇)，1mL 1mol/L MgSO4，1mL 1mol/L CaCl2)上于20摄氏度恒温培养箱中培养48小时，使其生长至L4/Young Adult期；

⑸实验动物的添加及生物效应的变化：

将L4/Young Adult期秀丽隐杆线虫4及其食物OP50等量放入各组，秀丽隐杆线虫4逐渐沉降至生物培养系统的底部。24小时后，吸取各组并分离秀丽隐杆线虫4，对分离的秀丽隐杆线虫4进行不同组的生殖腺细胞凋亡检测(处理后的秀丽隐杆线虫分别置于coster 24孔组织培养板内，加入500μL含1％OP50的M9缓冲液，以终浓度25μg/mL的吖啶橙(AO)染色1小时。之后将秀丽隐杆线虫4吸出于1.5mL的EP管，静置待秀丽隐杆线虫4自然沉降于管底后弃去含AO的上清，吸取秀丽隐杆线虫4于35mm含新鲜OP50的NGM板上恢复30分钟，挑取25-30条秀丽隐杆线虫4于含30μL 40mM叠氮化钠(NaN3)的载玻片中央，使用Olympus IX71荧光显微镜观察。未凋亡的正常生殖腺细胞呈现均匀的浅绿色，而凋亡的细胞因发生DNA片断化等现象呈高亮度的黄色或橙黄色)；同时，对无纳米材料掺杂的污染物暴露组6、额外掺杂纳米材料的同浓度污染物暴露组7、无纳米材料掺杂的同浓度污染物暴露组8的秀丽隐杆线虫4进行体内镉积累量检测(消解后进行ICP-MS)。

结果分析：图4为纳米二氧化钛与重金属镉相互作用的能谱(EDX)检测配合透射电子显微镜(TEM)观察所得到的结果图，图5为通过X射线光电子能谱分析(XPS)检测纳米二氧化钛与重金属镉相互作用时，以结合能为横坐标、每秒光电子数为纵坐标所得到待测物光电子能谱测结果图。结合图4、图5的检测结果，可知：纳米二氧化钛可对溶液中的重金属镉起到聚集作用，吸附于纳米材料表面的镉随着纳米二氧化钛的聚集沉降作用而富集于额外掺杂纳米材料的同浓度污染物暴露组7的底部，造成其污染物镉的水层分布不均。而对无纳米材料掺杂的污染物暴露组6、额外掺杂纳米材料的同浓度污染物暴露组7及无纳米材料掺杂的同浓度污染物暴露组8中镉浓度的检测发现由于纳米二氧化钛的吸附聚集作用，游离的镉离子数量下降，超滤膜作用下额外掺杂纳米材料的同浓度污染物暴露组7、无纳米材料掺杂的同浓度污染物暴露组8两边镉离子浓度达到平衡，导致额外掺杂纳米材料的同浓度污染物暴露组7所测整体镉浓度上升，无纳米材料掺杂的同浓度污染物暴露组所测镉浓度8下降，此结果对上述说法提供了进一步的验证。

此外，图6为各暴露组的线虫单条生殖腺细胞凋亡数对比图，发现额外掺杂纳米材料的同浓度污染物暴露组7的镉浓度水层分布不均导致水底生活型实验动物秀丽隐杆线虫4的生殖腺细胞凋亡数上升。无纳米材料掺杂的同浓度污染物暴露组8的生殖毒性相比额外掺杂纳米材料的同浓度污染物暴露组7有所下降。

超滤膜的引入，使利用一种水层生物模拟并区分真实环境中复杂体系的不同物质组分、不同水层组分的污染物生物效应及环境归趋成为可能。

由此可见：本发明所述的装置及应用可以有效的评价纳米材料与环境污染物的相互作用，可模拟并反映水环境中在纳米材料存在条件下污染物在不同水层的浓度变化，并用巧妙的设计反映出不同水层生物对污染物的归趋作用表现出不同的响应。本发明还可对相互作用后污染物的生物有效性及生物积累做出有效的鉴定。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。