一种儿脾醒颗粒的检测方法与流程

本发明涉及一种儿脾醒颗粒的检测方法，属于药品技术的领域；

背景技术：

小儿厌食症在儿童中很常见，主要的症状有呕吐、食欲不振、腹泻、便秘、腹胀、腹痛和便血等。儿童厌食是儿科的常见及多发病，如不有效干预可造成患儿发育迟缓，引起营养性贫血、佝偻病，给予患儿身心健康造成加大影响。同时厌食儿童存在胃电节律紊乱。

小儿厌食症的病因多种多样，归纳起来主要有全身性疾病、药物、气候、情绪因素以及喂养不当和神经性厌食，不论何种原因引起的小儿厌食症，持续时间较长均会影响小儿身高、体重的正常增长，合并消瘦、营养不良、免疫力低下，甚则发展成疳病，表现为面黄肌瘦、毛发稀疏、肚腹膨胀青筋暴露或腹凹如舟等，严重影响小儿的生长发育，且易引发并发症。西药因常引起过敏、恶心、腹泻、肝功能损害等毒副作用已越来越为人们所尽量避免，治疗小儿厌食症首选中药，中医应对此类疾病时，往往可采用效果明显且不良反应较小的药物。以山楂、麦芽、鸡内金、山药、薏苡仁、白扁豆、陈皮和茯苓制成的儿脾醒颗粒的药物具有健脾和胃，消食化积的功效。可用于脾虚食滞引起的小儿厌食，大便稀溏，消瘦体弱等症。为了更好地控制该产品的质量，确保临床药效，本发明提供了这种药物的检测方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于，提供一种儿脾醒颗粒的检测方法；所述检测方法准确，灵敏度高，重复性好，结果可靠，能有效控制该产品的质量，确保药物的临床药效。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案实现：

一种儿脾醒颗粒的检测方法，所述颗粒主要由按重量份计算的山楂300-340份、麦芽

300-340份、鸡内金220-260份、山药220-260份、薏苡仁140-180份、白扁豆220-260份、陈皮86-106份和茯苓86-106份按下述方法制成：以上八味，山楂、陈皮粉碎成粗粉，用65％乙醇作溶剂，浸渍24小时后，进行渗漉，收集漉液，漉液回收乙醇，浓缩至55-65℃时相对密度为1.35-1.40的稠膏，备用；其余麦芽等六味药材加水煎煮三次，每次1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至55-65℃时相对密度为1.10的清膏，加等量乙醇使沉淀，取上清液，回收乙醇，浓缩至相对密度为1.35-1.40的稠膏；与上述山楂、陈皮稠膏混匀，加入蔗糖适量，制成颗粒，干燥，即得；所述检测方法包括鉴别方法和含量测定方法；所述鉴别方法包括对山楂、陈皮、山药或鸡内金的薄层鉴别检测；所述含量测定方法包括对橙皮苷或枸橼酸的含量测定。

前述的儿脾醒颗粒的检测方法，所述山楂的鉴别方法为：取药物颗粒,研细后，取4-12g加20-30ml乙醚，加热回流0.5-1.5小时，滤过，滤液挥干，残渣加甲醇0.5-1.5m1使溶解，作为供试品溶液；另取山楂对照药材0.1-0.3g，研细后，取4-12g加20-30ml乙醚，加热回流0.5-1.5小时，滤过，滤液挥干，残渣加甲醇0.5-1.5m1使溶解，制得对照药材溶液；再取熊果酸对照品适量，加甲醇制成每0.5-1.5ml含0.05-0.15mg的溶液，作为对照品溶液；按照中国药典薄层色谱法试验，吸取上述三种种溶液各5-10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯：乙酸乙酯：甲酸＝15-25∶2-6∶0.1-1.0为展开剂，展开，取出，晾干，喷以硫酸乙醇溶液，硫酸乙醇溶液中硫酸与乙醇的体积比为2-4:9-11；在105℃加热至斑点显色清晰，分别置日光或360-370nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点或荧光主斑点；在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点或荧光斑点。

前述的儿脾醒颗粒的检测方法，所述山楂的鉴别方法为：取药物颗粒,研细后，取8g加25ml乙醚，加热回流1小时，滤过，滤液挥干，残渣加甲醇1m1使溶解，作为供试品溶液；另取山楂对照药材0.2g，研细后，取8g加25ml乙醚，加热回流1小时，滤过，滤液挥干，残渣加甲醇1m1使溶解，制得对照药材溶液；再取熊果酸对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，作为对照品溶液；按照中国药典薄层色谱法试验，吸取上述三种种溶液各5～10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯：乙酸乙酯：甲酸＝20∶4∶0.5为展开剂，展开，取出，晾干，喷以硫酸乙醇溶液，硫酸乙醇溶液中硫酸与乙醇的体积比为3:10；在105℃加热至斑点显色清晰，分别置日光或365nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点或荧光主斑点；在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点或荧光斑点。

前述的儿脾醒颗粒的检测方法，所述陈皮的鉴别方法为：取药物颗粒,研细后，取5-15g，加甲醇25-35ml，加热回流0.5-1.5小时，滤过，滤液挥干，残渣加水5-15ml使溶解，转移至分液漏斗中，用乙酸乙酯振摇提取2-3次，每次各5-15ml，合并乙酸乙酯提取液，水浴上蒸干，残渣加甲醇1-4ml使溶解，作为供试品溶液；另取陈皮对照药材0.5-1.5g，同法制成对照药材溶液；再取橙皮苷对照品适量，加甲醇制成饱和溶液，作为对照品溶液；按照中国药典薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液各2-5μl，分别点于同一用0.1-1.0％氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯：甲醇：水＝95-105∶15-19∶10-16为展开剂，展至1-6cm，取出，晾干，再以甲苯：乙酸乙酯：甲酸：水＝15-25∶5-15∶0.5-1.5∶0.5-1.5的上层溶液为展开剂，展至5-10cm，取出，晾干，喷以1-10％三氯化铝乙醇溶液，置于波长为360-370nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光主斑点；在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

前述的儿脾醒颗粒的检测方法，所述鸡内金的鉴别方法为：取药物颗粒,研细，取1-10g，加水25-35ml，浸渍过夜，水溶液连同残渣一起移置分液漏斗中，加水饱和的正丁醇振摇提取2-4次，每次15-25ml，分取正丁醇液，蒸干，残渣加适量甲醇使溶解，加于100-120目、1-10g、内径10-15mm的中性氧化铝柱上，用5-15％甲醇90-110ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加0.5-1.5ml，,65-75％乙醇使溶解，作为供试品溶液；另取鸡内金对照药材0.5-1.5g，加水25-35ml，煎煮1-3小时，水溶液连同残渣一起移置分液漏斗中，同法制成对照药材溶液；按照中国药典薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各3～5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇：冰醋酸：水＝5-15∶1-6∶0.5-1.5为展开剂，预平衡点样后的薄层板10-20分钟，展开，取出，晾干，喷以茚三酮试液，在110℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点。

前述的儿脾醒颗粒的检测方法，所述鸡内金的鉴别方法为：取药物颗粒,研细，取5g，加水30ml，浸渍过夜，水溶液连同残渣一起移置分液漏斗中，加水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次20ml，分取正丁醇液，蒸干，残渣加适量甲醇使溶解，加于100-120目、5g、内径10-15mm的中性氧化铝柱上，用10％甲醇100ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加1ml70％乙醇使溶解，作为供试品溶液；另取鸡内金对照药材1g，加水30ml，煎煮2小时，水溶液连同残渣一起移置分液漏斗中，同法制成对照药材溶液；按照中国药典薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各3～5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇：冰醋酸：水＝9∶3∶1为展开剂，预平衡点样后的薄层板15分钟，展开，取出，晾干，喷以茚三酮试液，在110℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点。

前述的儿脾醒颗粒的检测方法，所述橙皮苷含量测定方法为：

按照中国药典高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇：冰醋酸：水＝30-40∶1-8∶55-65为流动相；柱温为33-37℃；检测波长为280-286nm；理论板数按橙皮苷峰计算应不低于3000；

对照品溶液的制备：取橙皮苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每0.5-1.5ml含0.005-0.015mg的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取药物颗粒内容物，混匀，研细，取0.2-0.6g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20-30ml，密塞，称定重量，超声处理，超声处理功率为200-300W，超声处理频率为30-40kHz，超声处理时间为25-35分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

前述的儿脾醒颗粒的检测方法，所述橙皮苷含量测定方法为：

按照中国药典高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇：冰醋酸：水＝35∶4∶61为流动相；柱温为35℃；检测波长为283nm；理论板数按橙皮苷峰计算应不低于3000；

对照品溶液的制备：取橙皮苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.01mg的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取药物颗粒内容物，混匀，研细，取0.4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理，超声处理功率为250W，超声处理频率为35kHz，超声处理时间为30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

前述的儿脾醒颗粒的检测方法，所述枸橼酸含量测定方法为：按照中国药典高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；理论板数按枸橼酸峰计算应不低于3000；

对照品溶液的制备：取枸橼酸对照品适量，精密称定，加水制成每0.5-1.5ml含0.1-0.6mg的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取药物颗粒内容物，研细，精密称取1-4g，置20-30ml量瓶中，精密加入水适量，超声处理，超声处理功率为200-300W，超声处理频率为30-40kHz，超声处理时间为15-25分钟，放冷，加水稀释至刻度摇匀，滤过，取续滤液，过0.35-0.55μm微孔滤膜，即得。

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各15-25μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

前述的儿脾醒颗粒的检测方法，所述山楂的鉴别方法为：取药物颗粒研细后，取8g加25ml乙醚，加热回流1小时，滤过，滤液挥干，残渣加甲醇1m1使溶解，作为供试品溶液；另取山楂对照药材0.2g，研细后，取8g加25ml乙醚，加热回流1小时，滤过，滤液挥干，残渣加甲醇1m1使溶解，制得对照药材溶液；再取熊果酸对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，作为对照品溶液；按照中国药典薄层色谱法试验，吸取上述三种种溶液各5～10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯：乙酸乙酯：甲酸＝20∶4∶0.5为展开剂，展开，取出，晾干，喷以硫酸乙醇溶液，硫酸乙醇溶液中硫酸与乙醇的体积比为3:10；在105℃加热至斑点显色清晰，分别置日光或365nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点或荧光主斑点；在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点或荧光斑点；

所述陈皮的鉴别方法为：取药物颗粒内容物,研细后，取10g，加甲醇30ml，加热回流1小时，滤过，滤液挥干，残渣加水10ml使溶解，转移至分液漏斗中，用乙酸乙酯振摇提取2次，每次各10ml，合并乙酸乙酯提取液，水浴上蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；另取陈皮对照药材1g，同法制成对照药材溶液；再取橙皮苷对照品适量，加甲醇制成饱和溶液，作为对照品溶液；按照中国药典薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液各2～5μl，分别点于同一用0.5％氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯：甲醇：水＝100∶17∶13为展开剂，展至约3cm，取出，晾干，再以甲苯：乙酸乙酯：甲酸：水＝20∶10∶1∶1的上层溶液为展开剂，展至8cm，取出，晾干，喷以5％三氯化铝乙醇溶液，置于波长为365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光主斑点；在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

所述鸡内金的鉴别方法为：取药物颗粒,研细，取5g，加水30ml，浸渍过夜，水溶液连同残渣一起移置分液漏斗中，加水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次20ml，分取正丁醇液，蒸干，残渣加适量甲醇使溶解，加于100-120目、5g、内径10-15mm的中性氧化铝柱上，用10％甲醇100ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加1ml70％乙醇使溶解，作为供试品溶液；另取鸡内金对照药材1g，加水30ml，煎煮2小时，水溶液连同残渣一起移置分液漏斗中，同法制成对照药材溶液；按照中国药典薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各3～5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇：冰醋酸：水＝9∶3∶1为展开剂，预平衡点样后的薄层板15分钟，展开，取出，晾干，喷以茚三酮试液，在110℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点；

所述橙皮苷含量测定方法为：按照中国药典高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇：冰醋酸：水＝35∶4∶61为流动相；柱温为35℃；检测波长为283nm；理论板数按橙皮苷峰计算应不低于3000；

对照品溶液的制备：取橙皮苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.01mg的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取药物颗粒内容物，混匀，研细，取0.4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理，超声处理功率为250W，超声处理频率为35kHz，超声处理时间为30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；所述枸橼酸含量测定方法为：按照中国药典高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以5％磷酸二氢铵溶液，用磷酸缓调节pH至3.0为流动相，柱温为25℃；检测波长为210nm；理论板数按枸橼酸峰计算应不低于3000；

对照品溶液的制备：取枸橼酸对照品适量，精密称定，加水制成每1ml含0.3mg的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取药物颗粒内容物，研细，精密称取2.0g，置25ml量瓶中，精密加入水适量，超声处理，超声处理功率为250W，超声处理频率为35kHz，超声处理时间为20分钟，放冷，加水稀释至刻度摇匀，滤过，取续滤液，过0.45μm微孔滤膜，即得。

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

发明人进行了大量的实验，以下是本发明所述检测方法的研究

实验例：检测方法研究

一、样品

样品：儿脾醒颗粒，按实施例1的方法进行制备，为棕黄色的颗粒；气微香，味酸甜、微苦。收载于WS-10441(ZD-0441)-2002-2012Z，标准中原有项目为：性状；山楂、陈皮薄层鉴别；检查；含量测定项目为陈皮中橙皮苷的测定；根据提高质量标准要求，拟对原标准项目进行修订及增加了方中山药、鸡内金薄层鉴别、山楂含量测定。经实验研究对本品质量标准提出增修订项目进行了方法学验证，增修订验证内容实验依据如下。

二、鉴别

1、山楂的薄层鉴别：

原标准收载方法中仅用熊果酸作为对照，专属性不强，故在此，对本鉴别进行了修订，增加了山楂对照材。修订方法为：取本品装量差异项下的内容物，研细，取约8g，加乙醚25ml，加热回流1小时，滤过，滤液挥干，残渣加甲醇1m1使溶解，作为供试品溶液。另取山楂对照药材0.2g，同法制得对照药材溶液。再取熊果酸对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2015年版四部通则0502)试验，吸取上述三种种溶液各5～10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(20∶4∶0.5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以硫酸乙醇溶液(3→10)，在105℃加热至斑点显色清晰。分别置日光或紫外光灯(365nm)下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点或荧光主斑点；在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点或荧光斑点。按要求，对此鉴别进行了方法学考察，经过方法学验证，该薄层鉴别方法斑点清晰，分离好，重现好，且阴性无干扰。方法学验证如下：

1.1试剂与试药

儿脾醒颗粒由贵州润生制药业有限公司提供，即按实施例1进行制备；山楂对照药材(121626-201402)、熊果酸对照品(110742-201421)均由中国药品生物制品检定所提供；硅胶G薄层板：青岛海洋化工厂分厂生产的硅胶G薄层板及自制硅胶G薄层板；试剂：甲苯、乙酸乙酯、甲酸均为分析纯；

1.2专属性

取儿脾醒颗粒、山楂对照药材、熊果酸对照品及缺山楂阴性样品，同正文所述方法制得供试品溶液、对照药材溶液、对照品溶液及阴性供试品溶液，分别点样、展开、显色，置日光或紫外光灯(365nm)，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点或荧光主斑点；在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点或荧光斑点。且斑点分离较好，阴性无干扰，具体见图1和图2。

2、陈皮薄层鉴别

由于原标准收载方法提取点样后，样品杂质较多，有一定干扰，在此对此鉴别提取方法进一步除杂，同时增加了对照品点样，方法确定为：取本品装量差异项下的内容物，研细，取约10g，加甲醇30ml，加热回流1小时，滤过，滤液挥干，残渣加水10ml使溶解，转移至分液漏斗中，用乙酸乙酯振摇提取2次，每次各10ml，合并乙酸乙酯提取液，水浴上蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。另取陈皮对照药材1g，同法制成对照药材溶液。再取橙皮苷对照品适量，加甲醇制成饱和溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2015年版四部通则0502)试验，吸取上述三种溶液各2～5μl，分别点于同一用0.5％氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-水100∶17∶13)为展开剂，展至约3cm，取出，晾干，再以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水(20∶10∶1∶1)的上层溶液为展开剂，展至约8cm，取出，晾干，喷以5％三氯化铝乙醇溶液，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光主斑点；在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。对此鉴别进行了方法学考察，经过方法学验证，该薄层鉴别方法斑点清晰，分离好，重现好，且阴性无干扰。方法学验证如下：

2.1试剂与试药

儿脾醒颗粒由贵州润生制药业有限公司提供；陈皮对照药材(120969-201109)及橙皮苷对照品(110721-201014)均由中国药品生物制品检定所提供；薄层板：青岛海洋化工厂分厂生产的硅胶G薄层板浸入0.5％氢氧化钠溶液，取出，晾干；自制0.5％氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板；试剂：甲苯、乙酸乙酯、甲酸、甲醇均为分析纯；

2.2、专属性

取儿脾醒颗粒、陈皮对照药材、橙皮苷对照品及缺陈皮阴性样品，同正文所述方法制得供试品溶液、对照药材溶液、对照品溶液及阴性供试品溶液，分别点样、展开、显色，置紫外光灯(365nm)下检视，在供试品色谱中，与对照药材色谱相应的位置上显相同颜色的荧光主斑点，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。且斑点分离较好，阴性无干扰，见图3。

2.3山药薄层鉴别

经过试验，方法确定为：取药物颗粒,研细，取约5g，加二氯甲烷50ml，加热回流2小时，滤过，取滤液置分液漏斗中，用水洗涤3次，每次50ml，分取二氯甲烷液，蒸干，残渣加1ml二氯甲烷使溶解，作为供试品溶液。另取山药对照药材0.5g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(中国药典2015年版四部通则0502)试验，吸取上述两种溶液各5～10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水(16∶3∶0.1)为展开剂，预平衡点样后的薄层板15分钟，展开，取出，晾干，喷以磷钼酸试液，在110℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点。按药典要求，对此鉴别进行了方法学考察，经过方法学验证，该薄层鉴别方法斑点清晰，分离好，重现好，且阴性无干扰。方法学验证如下：

2.3.1、试剂与试药

儿脾醒颗粒贵州润生制药业有限公司提供；山药对照药材(121137-200402)由中国药品生物制品检定所提供；硅胶薄层板：青岛海洋化工厂分厂生产的硅胶G薄层板及自制硅胶G薄层板试剂：二氯甲烷、三氯甲烷、甲醇均为分析纯，水为超纯化水；

2.3.2、专属性

取儿脾醒颗粒、山药对照药材及缺山药阴性样品，同正文所述方法制得供试品溶液、对照药材溶液、对照品溶液及阴性供试品溶液，分别点样、展开、喷以磷钼酸试液，在110℃加热至斑点显色清晰，在供试品色谱中，与对照药材色谱相应的位置上显相同颜色的主斑点，且斑点分离较好，阴性无干扰，结果见图4。

2.4鸡内金的薄层鉴别

经过试验，方法确定为：取药物颗粒,研细，取约5g，加水30ml，浸渍过夜，水溶液连同残渣一起移置分液漏斗中，加水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次20ml，分取正丁醇液，蒸干，残渣加适量甲醇使溶解，加于中性氧化铝柱(100-120目，5g，内径10-15mm)上，用10％甲醇100ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加1ml70％乙醇使溶解，作为供试品溶液。另取鸡内金对照药材1g，加水30ml，煎煮2小时，水溶液连同残渣一起移置分液漏斗中，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(中国药典2015年版四部通则0502)试验，吸取上述两种溶液各3～5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-冰醋酸-水(9:3:1)为展开剂，预平衡点样后的薄层板15分钟，展开，取出，晾干，喷以茚三酮试液，在110℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。按药典要求，对此鉴别进行了方法学考察，经过方法学验证，该薄层鉴别方法斑点清晰，分离好，重现好，且阴性无干扰。方法学验证如下：

2.4.1试剂与试药

儿脾醒颗粒由贵州润生制药业有限公司提供；鸡内金对照药材(1153-200001)由中国药品生物制品检定所提供；硅胶G薄层板：青岛海洋化工厂分厂生产的硅胶G薄层板及自制硅胶G薄层板；试剂：甲醇、乙醇、正丁醇均为分析纯，水为超纯化水；

2.4.2专属性

取儿脾醒颗粒、鸡内金对照药材及缺鸡内金阴性样品，同正文所述方法制得供试品溶液、对照药材溶液、对照品溶液及阴性供试品溶液，分别点样、展开、喷以茚三酮试液，在110℃加热至斑点显色清晰，在供试品色谱中，与对照药材色谱相应的位置上显相同颜色的主斑点，且斑点分离较好，阴性无干扰，见图5。

二、含量测定

1橙皮苷含量测定

陈皮：陈皮含量测定为为原标准收载，在此并无修订，根据要求，对原标准收载陈皮含量测定进行了方法学验证，方法学验证如下：

1.1仪器与试药

高效液相色谱仪：岛津液相色谱仪；儿脾醒颗粒：贵州润生制药有限公司；橙皮苷对照品由中国药品生物制品检定所提供，批号为110721-201014；试剂：甲醇为色谱醇、水为重蒸馏水。

1.2测定方法

1.2.1色谱条件选择：

(1)色谱柱：参照原标准及2010年版药典陈皮含量测定，选择十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的柱子进行考察。结果表明采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的柱子分离效果较好。

(2)流动相：参照原标准，采用甲醇-冰醋酸-水(35∶4∶61)为流动相，待测成分橙皮苷及其他杂质可得到较好分离。

(3)检测波长：参照原标准及2010年版药典橙皮苷含量测定，检测波长定为283nm。

(4)理论塔板数：根据不同柱子检测结果，同时参照2010年版药典陈皮含量测定，暂定理论塔板数按橙皮苷峰计算，应不低于3000。

1.2.2供试品溶液的制备

取药物颗粒，混匀，研细，取约0.4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率35kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

1.2.3、对照品溶液的制备

取橙皮苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.01mg的溶液，即得。

1.3方法验证

1.3.1线性考察

分别精密吸取橙皮苷对照品溶液(0.031906mg/ml)1ml、2ml、3ml、5ml、6ml、10ml到10ml容量瓶中，加甲醇至刻度，分取10μl进样，记录色谱，以峰面积为纵坐标，以进样量(μg)为横坐标作图，计算回归方程为：A＝1847322.47C+3897.83801(r＝0.9999)，回归方程拟合过原点的直线方程为：A＝1866179.663C；见图6和表1.将一供试品溶液进样分析，所得峰面积分别代入上两式计算，相对偏差为0.32％，故可认为标准曲线过原点，回归方程截距为零。由此含量测定可采用外标一点法计算。橙皮苷在0.032μg～0.319μg之间线性关系良好。

表1橙皮苷线性关系考察

1.3.2、精密度试验

取对照品溶液0.011867mg/ml，重复进样6次，记录色谱，结果见表2及精密度图谱，RSD为0.41％，说明有良好的精密度。

表2精密度试验

1.3.3、重复性试验

取一样品按正文所述制备6份供试品溶液，分别进样，记录色谱，计算，结果见表3，重复性图谱，RSD为0.58％，说明有良好的重复性。

表3重复性试验

1.3.4、回收率试验

采用加样回收，精密吸取已测定含量的样品0.2g(0.5789mg/g)，再加入橙皮苷对照品适量，按正文所述色谱条件测定，计算回收率，结果见表4，回收率图谱，橙皮苷的回收率为97.81％，RSD为0.75％，说明本法有良好的回收率。

表4回收率试验

1.3.5、专属性

取儿脾醒颗粒及阴性样品按供试品溶液制备方法制备样品溶液及阴性样品溶液，按上述色谱条件，分别取对照品溶液、样品溶液、阴性样品溶液注入液相色谱仪，样品溶液色谱在对照品溶液色谱相应位置有相应的色谱峰，且阴性无干扰，结果见图8、图9和图10。

1.3.6、耐用性

1.3.6.1样品提取溶剂的选择

取药物颗粒，研细，取5份，每份约0.4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入乙醇、甲醇、60％甲醇、70％甲醇、80％甲醇各25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，分别用乙醇、甲醇、60％甲醇、70％甲醇、80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。分别取上述溶液各10μl注入液相色谱仪，计算，结果见表5，说明本品采用甲醇作为提取溶剂，含量提取更完全。

表5提取溶剂的选择

1.3.6.2、样品提取方法的选择

取药物颗粒，研细，取2份，每份约0.4g，精密称定，第1份置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，超声处理30分钟，另一份回流提取30分钟，取出，放冷，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过；分别取上述2种溶液10μl注入液相色谱仪，计算，结果见表6，回流提取含量、超声提取含量无本质差异，故选择超声提取。

表6提取方法的选择

1.3.6.3、样品提取时间影响

取装量差异项下的内容物药物颗粒，研细，取3份，每份约0.4g，精密称定，分别置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量，分别超声提取10、15、30、40分钟，取出，放冷，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，分别取10μl续滤液注入液相色谱仪，计算含量，结果见表7，超声提取30分钟就完全提取，故选择提取时间为30分钟。

表7提取时间影响

提取方法确定为:取药物颗粒，混匀，研细，取约0.4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率35kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

1.3.6.4、不同品牌柱子的影响

采用不同品牌十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的柱子，分别测定了儿脾醒颗粒中橙皮苷的含量，考察不同品牌的色谱柱的影响。含量测定结果见表8。结果表明不同品牌十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱对含量测定无影响。

表8不同品牌色谱柱的测定结果

1.3.6.5、样品稳定性试验

取儿脾醒颗粒，按供试品溶液制备方法制备，按上述色谱条件测定橙皮苷峰面积，结果见表9。

表9样品稳定性试验

1.3.7十批含量样品测定：结果表10；

表10 10批样品含量测定结果

根据原标准含量限度及10批样品测定值，本品陈皮含量测定限度为：本品每袋含陈皮以橙皮苷(C₂₈H₃₄O₁₅)计，不得少于0.62mg。

2、山楂含量测定

2.1、仪器与试药

液相色谱仪：Waters e2695液相色谱仪；儿脾醒颗粒：贵州润生制药有限公司；枸橼酸对照品(100396-200301)由中国药品生物制品检定所提供；试剂：磷酸二氢铵、磷酸为分析级、水为超纯化水。

2.2、测定方法

2.2.1、色谱条件选择

(1)色谱柱：选择十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的柱子进行考察。结果表明采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的柱子分离效果较好。

(2)流动相：对不同流动相进行比较，采用5％磷酸二氢铵溶液(用磷酸缓调节pH至3.0)为流动相，待测成分枸橼酸及其他杂质可得到较好分离。

(3)检测波长：根据枸橼酸对照品的紫外吸收波长，检测波长定为210nm。

(4)理论塔板数：根据不同柱子检测结果，暂定理论塔板数按枸橼酸计算，应不低于3000。

2.2.2、供试品溶液的制备

取药物颗粒，研细，精密称取约2.0g，置25ml量瓶中，精密加入水适量，超声处理(功率250W，频率35kHz)20分钟，放冷，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，过0.45μm微孔滤膜，即得。

2.2.3、对照品溶液的制备

取枸橼酸对照品适量，精密称定，加水制成每1ml含0.5mg的溶液，即得。

2.3、方法验证

2.3.1、线性考察精密称取枸橼酸对照品0.2010g至10ml量瓶得A液(2.01mg/ml)；取1mlA液至2ml量瓶得B液(1.005mg/ml)；取2mlA液至5ml量瓶得C液(0.804mg/ml)；取1.5mlA液至5ml量瓶得D液(0.603mg/ml)；取1ml B液至2ml量瓶得E液(0.402mg/ml)；取1ml E液至2ml量瓶得F液(0.201mg/ml)；取1ml F液至2ml量瓶得G液(0.1005mg/ml)，B、C、D、E、F、G分取20μl进样。记录色谱，以峰面积为纵坐标，以进样量(μg)为横坐标作图，计算回归方程为：A＝146399.4943C-65747.9151(r＝0.9998)，回归方程拟合过原点的直线方程为：A＝141811.156C；将一供试品溶液进样分析，所得峰面积分别代入上两式计算，相对偏差为3.27％，故可认为标准曲线过原点，回归方程截距为零。由此含量测定可采用外标一点法计算。枸橼酸在2.02μg～20.1μg之间线性关系良好。具体结果见表11和图7。

表11枸橼酸线性关系考察(n＝2)

2.3.2、精密度试验

取同一枸橼酸对照品溶液，重复进样6次，记录色谱，结果见表12及精密度图谱，RSD为0.19％，说明有良好的精密度。

表12精密度试验

2.3.3重复性试验

取一样品按正文所述制备6份供试品溶液，分别进样，记录色谱，计算，结果见表13，RSD为1.01％，说明有良好的重复性。

表13重复性试验

2.3.4回收率试验

采用加样回收，精密吸取已测定含量的样品1g(4.007mg/g)，再加入枸橼酸对照品适量，按正文所述色谱条件测定，计算回收率，结果见表14，回收率图谱，枸橼酸的回收率为102.93％，RSD为0.92％，说明本法有良好的回收率。

表14回收率试验

2.3.5、专属性

取儿脾醒颗粒及阴性样品按供试品溶液制备方法制备样品溶液及阴性样品溶液，按上述色谱条件，分别取对照品溶液、样品溶液、阴性样品溶液注入液相色谱仪，样品溶液色谱在对照品溶液色谱相应位置有相应的色谱峰，且阴性无干扰，结果见图11、图12和图13。

2.3.6、耐用性、

2.3.6.1、样品提取溶剂的选择

取药物颗粒，研细，取4份，每份约2g，精密称定，置25ml量瓶中，根据有机酸易溶于水、甲醇、乙醇的性质，故分别精密加入适量水、1％碳酸氢钠水、甲醇、乙醇，称定重量，超声处理1小时，放冷，分别用水、1％碳酸氢钠水、甲醇、乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，过0.45μm微孔滤膜，作为供试品溶液。分别取上述溶液各20μl注入液相色谱仪，通过甲醇、乙醇提取得到的色谱图分离效果较差无法计算含量，故对水和1％碳酸氢钠水进行比较，计算，结果见表15，本品采用水作为提取溶剂，含量提取更完全。

表15提取溶剂的选择

2.3.6.2、样品提取方法的选择

取药物颗粒，研细，取3份，每份约2g，精密称定，分别精密加入25ml水，分别通过回流、超声、浸泡提取，称定重量，回流1小时，超声1小时，浸泡1小时，放冷，分别用水补足减失重量，滤过，取续滤液，过0.45μm微孔滤膜，作为供试品溶液。分别取上述溶液各20μl注入液相色谱仪，计算，结果见表16，回流、超声、浸泡三种提取方法所测的含量相差不大，故选择简便、效果较好的超声提取作为提取方法。

表16提取方法的选择

2.3.6.3、样品提取时间影响

取药物颗粒，研细，取4份，每份约2.0g，精密称定，分别置25ml量瓶中，精密加入水适量，分别超声10、20、40、60分钟，放冷，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，过0.45μm微孔滤膜，作为供试品溶液。分别取上述溶液各20μl注入液相色谱仪，计算，结果见表17，10、20、40、60分钟所测得的含量相差不大，为了保证提取完全，故选择提取时间为20分钟。

表17提取时间影响

提取方法确定为:取药物颗粒，研细，精密称取约2.0g，置25ml量瓶中，精密加入水适量，超声处理(功率250W，频率30kHz)20分钟，放冷，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，过0.45μm微孔滤膜，即得。

2.3.6.4、不同品牌柱子的影响

采用不同品牌十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的柱子，分别测定了儿脾醒颗粒中枸橼酸的含量，考察不同品牌的色谱柱的影响。含量测定结果见表18。结果表明不同品牌十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱对含量测定无影响。

表18不同品牌色谱柱的测定结果

2.3.6.5、样品稳定性试验

取儿脾醒颗粒，按供试品溶液制备方法制备，按上述色谱条件测定枸橼酸峰面积，结果见表19。

表19样品稳定性试验

2.4.10批含量样品测定：

结果见表20。

表20 10批样品含量测定结果

根据10批样品测定值，本品山楂含量测定限度为：本品每袋含山楂以枸橼酸(C₆H₈O₇)计，不得少于6.0mg。

本发明的有益效果在于：本发明提供了一种儿脾醒颗粒的检测方法，包括以有效成分橙皮苷和枸橼酸为指标，采用高效液相色谱法测定橙皮苷和枸橼酸的含量；以及药物中对山楂、陈皮、山药和鸡内金的薄层鉴别方法；所述检测方法准确，灵敏度高，重复性好，检测结果稳定，可有效控制儿脾醒颗粒的质量，既更有利于生产厂家和监督管理部门对产品质量的监测，也可以为医疗部门和患者的治疗提供更好的保障。

附图说明

图1是山楂薄层鉴别时，专属性试验时，日光下检视图；1-20151001，2-20151002，3-20151003，4-阴性样品，5-山楂对照药材，6-熊果酸对照品；

图2是山楂薄层鉴别时，专属性试验时，紫外光灯(365nm)下检视图；1-20151001，2-20151002，3-20151003，4-阴性样品，5-山楂对照药材，6-熊果酸对照品；

图3是山楂薄层鉴别时，专属性试验时，日光下检视图；1-20151001，2-20151002，3-20151003，4-阴性样品，5-陈皮对照药材，6-橙皮苷对照品；

图4是山药薄层鉴别时；专属性试验时，日光下检视结果图，1-20151001，2-20151002，3-20151003，4-山药对照药材，5-阴性样品；

图5是鸡内金薄层鉴别时，专属性试验时，日光下检视结果图；1-20151001，2-20151002，3-20151003，4-鸡内金对照药材，5-阴性样品；

图6是橙皮苷标准曲线图，X轴为进样量(μg)、Y轴为峰面积；

图7是枸橼酸标准曲线图，X轴为进样量(μg)、Y轴为峰面积；

图8是橙皮苷含量测定时，橙皮苷对照品专属性实验图；

图9是橙皮苷含量测定时，橙皮苷供试品专属性实验图；

图10橙皮苷含量测定时，橙皮苷阴性样品专属性实验图；

图11是枸橼酸含量测定时，枸橼酸对照品专属性实验图；

图12是枸橼酸含量测定时，枸橼酸供试品专属性实验图；

图13是枸橼酸含量测定时，枸橼酸阴性样品专属性实验图。

下面结合实施例对本发明作进一步的说明

具体实施方式

实施例：颗粒剂的检测方法

颗粒剂配方：山楂320g、麦芽320g、鸡内金240g、山药240g、薏苡仁160g、白扁豆240g、陈皮96g和茯苓96g。

工艺：以上八味，山楂、陈皮粉碎成粗粉，用65％乙醇作溶剂，浸渍24小时后，进行渗漉，收集漉液，漉液回收乙醇，浓缩至55-65℃时相对密度为1.35-1.40的稠膏，备用；其余麦芽等六味药材加水煎煮三次，每次1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.10(60℃)的清膏，加等量乙醇使沉淀，取上清液，回收乙醇，浓缩至相对密度为1.35-1.40的稠膏；与上述山楂、陈皮稠膏混匀，加入蔗糖适量，制成颗粒，干燥，即得。

用法与用量：温开水冲服。1～5岁一次1袋，一日3次；5岁以上一次2袋，一日3次；10天为一个疗程。

规格：每袋装2.5g。

检测方法：

性状：药物为棕黄色的颗粒；气微香，味酸甜、微苦。

鉴别：

(1)取药物颗粒内容物,研细后，取8g加25ml乙醚，加热回流1小时，滤过，滤液挥干，残渣加甲醇1m1使溶解，作为供试品溶液；另取山楂对照药材0.2g，研细后，取8g加25ml乙醚，加热回流1小时，滤过，滤液挥干，残渣加甲醇1m1使溶解，制得对照药材溶液；再取熊果酸对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，作为对照品溶液；按照中国药典薄层色谱法试验，吸取上述三种种溶液各5～10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯：乙酸乙酯：甲酸＝20∶4∶0.5为展开剂，展开，取出，晾干，喷以硫酸乙醇溶液(3→10)，在105℃加热至斑点显色清晰，分别置日光或365nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点或荧光主斑点；在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点或荧光斑点。

(2)取药物颗粒内容物,研细后，取10g，加甲醇30ml，加热回流1小时，滤过，滤液挥干，残渣加水10ml使溶解，转移至分液漏斗中，用乙酸乙酯振摇提取2次，每次各10ml，合并乙酸乙酯提取液，水浴上蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；另取陈皮对照药材1g，同法制成对照药材溶液；再取橙皮苷对照品适量，加甲醇制成饱和溶液，作为对照品溶液；按照中国药典薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液各2～5μl，分别点于同一用0.5％氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯：甲醇：水＝100∶17∶13为展开剂，展至约3cm，取出，晾干，再以甲苯：乙酸乙酯：甲酸：水＝20∶10∶1∶1的上层溶液为展开剂，展至8cm，取出，晾干，喷以5％三氯化铝乙醇溶液，置于波长为365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光主斑点；在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

(3)取药物颗粒内容物,研细，取5g，加水30ml，浸渍过夜，水溶液连同残渣一起移置分液漏斗中，加水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次20ml，分取正丁醇液，蒸干，残渣加适量甲醇使溶解，加于100-120目、5g、内径10-15mm的中性氧化铝柱上，用10％甲醇100ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加1ml70％乙醇使溶解，作为供试品溶液；另取鸡内金对照药材1g，加水30ml，煎煮2小时，水溶液连同残渣一起移置分液漏斗中，同法制成对照药材溶液；按照中国药典薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各3～5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇：冰醋酸：水＝9∶3∶1为展开剂，预平衡点样后的薄层板15分钟，展开，取出，晾干，喷以茚三酮试液，在110℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点。

应符合(《中国药典》2015年版四部附录I C)颗粒剂项下有关的各项规定。

含量测定：

(1)橙皮苷：

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇：冰醋酸：水＝35∶4∶61为流动相；柱温为35℃；检测波长为283nm；理论板数按橙皮苷峰计算应不低于3000；

对照品溶液的制备：取橙皮苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.01mg的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取药物颗粒内容物，混匀，研细，取0.4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理，超声处理功率为250W，超声处理频率为35kHz，超声处理时间为30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

本品每袋含陈皮以橙皮苷(C₂₈H₃₄O₁₅)计，不得少于0.62mg。

(2)枸橼酸：按照中国药典高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以5％磷酸二氢铵溶液(用磷酸缓调节pH至3.0)为流动相，柱温为25℃；检测波长为210nm；理论板数按枸橼酸峰计算应不低于3000；

对照品溶液的制备：取枸橼酸对照品适量，精密称定，加水制成每1ml含0.3mg的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取药物颗粒内容物，研细，精密称取2.0g，置25ml量瓶中，精密加入水适量，超声处理，超声处理功率为250W，超声处理频率为35kHz，超声处理时间为20分钟，放冷，加水稀释至刻度摇匀，滤过，取续滤液，过0.45μm微孔滤膜，即得。

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

本品每袋含山楂以枸橼酸(C₆H₈O₇)计，不得少于6.0mg。