一种用于叶酸定量检测的化学修饰电极以及电化学传感器的制备方法与流程

本发明涉及电化学传感技术领域，具体涉及一种用于叶酸定量检测的化学修饰电极以及电化学传感器的制备方法。

背景技术：

叶酸在人体中具有重要的生理功能，在人身体内是不可以直接合成的，而必须通过饮食来获得。在人体内，叶酸被吸收后可转变为具有生物活性的四氢叶酸，它参与核糖核酸和脱氧核糖核酸的合成与制造，并对细胞内嘌呤核酸和嘧啶核苷酸的合成和转化起着非常重要的作用。叶酸与DNA的合成密切相关，孕妇如果严重缺乏叶酸，就会妨碍胎儿体内DNA的合成，且细胞分裂会减弱，其脊柱的关键部位发育受损，导致脊柱裂。妇女在怀孕前6周内若摄入叶酸不足，其生出无脑儿和脑脊柱裂的畸形儿的可能性会大增。另外缺乏叶酸会导致患抑郁症、心血管疾病、精神分裂症、老年性痴呆和一些癌症如宫颈癌、直肠癌和食道癌的风险增加。因此，对叶酸进行定量检测对于临床医疗诊断和保障人类身心健康等方面具有重要意义。

目前，测量叶酸方法主要有微生物法、直接比色法、茚三酮比色法、高效液相色谱法、薄层层析法、荧光光度法等。这些方法虽然很重要，但都有一定的局限性。比如光度法容易受到干扰物影响；荧光法需要荧光标记物或者被测物本身具有荧光性；色谱法不仅需昂贵的仪器设备，还需较大花费购买色谱柱和大量有机溶剂。电化学检测方法具有低成本、效率高、灵敏度高和选择性好等特点，而其最大的优点就是可以直接检测而不需要前期处理，且步骤操作简单，能够快速运用于现场测定。电化学测定方法中用到的工作电极若未经修饰直接使用，其较低的电催化活性将导致分析物的电化学响应信号弱，灵敏度和检出限达不到痕量检测要求。鉴于此，发展各种纳米材料修饰电极，能有效改善电化学传感器的灵敏度和检出限。碳纳米管具有奇特的电学性能、明显的量子效应、大的比表面积、高的稳定性以及强的吸附特性，对许多化合物的氧化具有优异的催化效果。将碳纳米管应用于电化学传感器制备中能降低底物的过电位、促进电子传递、增大电流响应。现有技术中基于多壁碳纳米管(MWCNTs)制备得到的修饰电极及其检出限如下：如单组分的多壁碳纳米管(MWCNTs)修饰电极构建的叶酸电化学传感器的检出限为2.59×10^-6mol/L(蒋晓丽、李容、何晓英，西华师范大学学报(自然科学版)，29(2008)182–185)、聚次甲基蓝/多壁碳纳米管修饰电极构建的叶酸电化学传感器的检出限为1.6×10^-6mol/L(杜学萍，河南大学硕士学位论文，2014)和铂纳米颗粒/多壁碳纳米管修饰电极构建的叶酸电化学传感器的检出限为5.01×10^-8mol/L(赵玲，辽宁大学硕士学位论文，2011)。虽然，上述电极对叶酸的检出限得到进一步降低，但开发一种检出限更低、电催化活性更好的化学修饰电极仍具有重要的意义。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是，为了克服现有叶酸测定技术中存在着易受干扰物影响、样品前期处理复杂以及检出限高等技术问题，提供一种用于叶酸定量检测的化学修饰电极以及电化学传感器的制备方法。由该方法制备得到的化学修饰电极以及电化学传感器，电催化效果和选择性好、检出限低。

本发明所要解决的上述技术问题通过以下技术方案予以实现：

一种用于叶酸定量检测的化学电极的制备方法，包含如下步骤：

S11.取30～50mg多壁碳纳米管，加入0.5～1.5mL浓硝酸和2～4mL浓硫酸后超声2～5h，得悬浊液；

S12.在上述的悬浊液中加乙醇至8～15mL，离心分离；然后加水离心分离至滤液pH值为6～8后，将沉淀物烘干得到羧基化的多壁碳纳米管；

S13.取3～6mg羧基化的多壁碳纳米管，加入2～4mL水超声分散均匀，然后加入0.10～0.30g葡萄糖形成溶液A；

S14.取0.02～0.03g硝酸银于2～4mL水中搅拌溶解，随后逐滴加入0.3～0.6mL浓NH3·H2O形成溶液B；

S15.将溶液B加入溶液A搅拌0.3～1h，陈化1～3h后，经离心和洗涤后，于50～80℃烘箱中干燥8～24h后得银纳米粒子负载的多壁碳纳米管复合材料(Ag/MWCNTs纳米复合材料)；

S16.取0.3～0.6mg银纳米粒子负载的多壁碳纳米管复合材料(Ag/MWCNTs复合材料)在1～2mL有机溶剂中分散得银纳米粒子负载多壁碳纳米管复合材料(Ag/MWCNTs复合材料)分散液；将银纳米粒子负载多壁碳纳米管复合材料(Ag/MWCNTs复合材料)分散液涂覆并固定在洗净的玻碳电极表面，即得银纳米粒子负载多壁碳纳米管复合膜修饰电极(Ag/MWCNTs复合膜修饰电极)。

对于使用纳米复合材料制备测定具体某种化学成分含量的电极，则需要发明人根据具体待测定的化学物质的性质制备不同的纳米复合材料。制备出的电极对所要测定物质的检出限、灵敏度、稳定性和抗干扰性等效果的好坏主要由纳米复合材料的制备方法决定。纳米复合材料的制备方法主要包括原材料的选择、原材料的配比，以及各个步骤反应条件等。对于用作电极的纳米复合材料，其制备方法中原材料的选择、配比以及各个步骤反应条件的不同都会导致后续制备得到的电极电性能的巨大差异，从而导致检出限、灵敏度、稳定性和抗干扰性等效果的巨大差异。

根据叶酸的特性，为得到具有低检出限的叶酸检测电极，本发明发明人通过大量的实验，不断调整原料组成、配比以及制备过程中的工艺参数；制备得到粒径为20～40nm的Ag纳米粒子并成功将其高分散地负载在羧基化的多壁碳纳米管上，该过程将成功增加复合纳米材料的比表面积和催化活性，使得制备得到的Ag/MWCNTs复合膜修饰电极具有优异的电化学响应性能，可以显著降低样品中叶酸的检出限，以及提高检测的灵敏度、稳定性与抗干扰性。

优选地，步骤S11中取40mg多壁碳纳米管，加入1mL浓硝酸和3mL浓硫酸后超声4h。

优选地，步骤S12中在上述的悬浊液中加乙醇至10mL；加水离心分离至滤液pH值为7。

优选地，步骤S13中取4.5mg羧基化的多壁碳纳米管，加入3mL水超声分散均匀，然后加入0.19g葡萄糖形成溶液A。

优选地，步骤S14中取0.026g硝酸银于3mL水中搅拌溶解，随后逐滴加入0.5mL浓NH3·H2O形成溶液B。

优选地，步骤S15中将溶液B加入溶液A搅拌0.5h，陈化2h后，经离心和洗涤后，于60℃烘箱中干燥12h后得银纳米粒子负载的多壁碳纳米管复合材料。

优选地，步骤S16中取0.5mg银纳米粒子负载多壁碳纳米管复合材料在1mL二甲基甲酰胺中分散得银纳米粒子负载多壁碳纳米管复合材料分散液；将银纳米粒子负载多壁碳纳米管复合材料分散液涂覆在洗净的玻碳电极表面，在红外灯下烤干后即得银纳米粒子负载多壁碳纳米管复合膜修饰电极。

一种用于叶酸定量检测的电化学传感器的制备方法，包括如下步骤：将上述制备得到的银纳米粒子负载多壁碳纳米管复合膜修饰电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，利用三电极法组装电极测试体系后连接电化学工作站得用于叶酸定量检测的电化学传感器。

一种叶酸定量检测的方法，其特征在于，使用权利要求8制备得到的电化学传感器，用方波伏安法检测样品中的叶酸含量。

S21.样品溶解，以pH为2.0～7.0的柠檬酸-磷酸二氢钠底液定容，制备样品溶液；

S22.使用权利要求8制备得到的电化学传感器，用方波伏安法检测样品中叶酸的氧化峰电流值；

S23.根据线性回归方程，计算出样品溶液中叶酸的溶度，从而换算出样品中叶酸的含量。

优选地，步骤S21中以pH为4.0的柠檬酸-磷酸二氢钠底液定容。

发明人经大量实验研究表明，本发明制备得的Ag/MWCNTs复合膜修饰电极，在为pH为4.0的柠檬酸-磷酸二氢钠底液中测试，其中叶酸的氧化还原峰灵敏度较高、峰电流最大，峰型较好且电极的稳定性较好。

优选地，步骤S22中所述的方波伏安法的操作条件为：电位范围0.4～1.2V、电位增幅1～10mV、电位振幅1～50mV、测试频率5～30Hz。

最优选地，步骤S22中所述的方波伏安法的操作条件为：电位范围0.4～1.2V、电位增量5mV、电位振幅25mV、测试频率15Hz。

优选地，步骤S23中所述的线性回归方程在5.0×10^-7～1.0×10^-5mol/L和1.0×10^-5～8.0×10^-5mol/L的两个范围内叶酸氧化峰电流与其浓度呈良好的线性关系，线性回归方程为：Ip(A)＝0.00577C(mol/L)+1.29498×10^-7(R²＝0.99929)，Ip＝0.01529C(mol/L)+2.28819×10^-7(R²＝0.98232)；方程中C为叶酸浓度，Ip为方波伏安法得到氧化峰电流值。

有益效果：(1)本发明提供了一种全新的用于叶酸定量检测的化学修饰电极以及化学传感器，本发明利用绿色化学法将Ag纳米粒子负载在多壁碳纳米管上制备成Ag/MWCNTs复合材料可进一步增加其比表面积和增强其催化活性，利用该复合纳米材料对工作电极进行修饰，可极大增强其对叶酸的电催化活性和检测性能；(2)所述的用于叶酸定量检测的化学修饰电极或化学传感器具有极低的检出限(实施例表明其检出限为6.2nmol/L，远远低于现有技术中的2590nmol/L、1600nmol/L和50.1nmol/L)以及良好的稳定性、抗干扰性和重现性；(3)基于本发明构建的叶酸电化学传感器操作简单、成本低廉，在药品质量控制、食品安全和临床医疗等方面有着广泛的应用前景。

附图说明

图1为本发明所述的MWCNTs和Ag/MWCNTs复合材料的扫描电镜图(A、B)、透射电镜图(C、D)和能谱图(E、F)。

图2为MWCNTs修饰电极(a)和本发明所述的Ag/MWCNTs复合膜修饰电极(b)在1.0mmol/L K3[Fe(CN)6]和0.1mol/L KCl底液中的交流阻抗(A)和循环伏安图(B)。

图3为玻碳电极(a)、MWCNTs修饰电极(b)和本发明所述的Ag/MWCNTs复合膜修饰电极(c)在0.2mmol/L叶酸溶液中的循环伏安图。

图4为不同浓度的叶酸在Ag/MWCNTs复合膜修饰电极上与其氧化峰电流值之间的线性关系图。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步解释本发明，但实施例对本发明不做任何形式的限定。

实施例1一种用于叶酸定量检测的化学电极的制备

S1.取40mg多壁碳纳米管，加入1mL浓硝酸和3mL浓硫酸后超声4h，得悬浊液；

S2.在上述的悬浊液中加乙醇至10mL，离心分离；然后加水离心分离至滤液pH值为中性后，将沉淀物烘干得到羧基化的多壁碳纳米管(MWCNTs)；

S3.取4.5mg羧基化的多壁碳纳米管，加入3mL水超声分散均匀，然后加入0.19g葡萄糖形成溶液A；

S4.取0.026g硝酸银于3mL水中搅拌溶解，随后逐滴加入0.5mL NH3·H2O形成溶液B；

S5.将溶液B加入溶液A搅拌0.5h，陈化2h后，经离心和洗涤后，于60℃烘箱中干燥12h后得Ag/MWCNTs复合材料；

S6.将玻碳电极分别用0.3μm和0.05μm的铝粉抛光，然后在稀硝酸、乙醇和纯净水中分别超声5min洗净电极，室温下干燥备用；取0.5mg Ag/MWCNTs复合材料在l mL二甲基甲酰胺中超声分散后，用移液枪取5μL该分散液涂覆在洗净的玻碳电极表面，在红外灯下烤干得Ag/MWCNTs复合膜修饰电极。

图1显示步骤S2制备得到的MWCNTs和步骤S5制备得到的Ag/MWCNTs复合材料在20000倍放大率下的扫描电镜图(A，B)和50000倍放大率下的透射电镜图(C，D)，从图中可见MWCNTs经过强酸处理后绝大部分发生断裂，相互分离，管长变短端口打开，端口碳原子容易被氧化成羧基，这些含氧基团成为负载金属粒子的活性位点。加入金属离子原位还原后，小尺寸的Ag纳米颗粒高分散地负载在多壁碳纳米管上，整个复合材料具有网状结构，负载的金属纳米粒子粒径在20–40nm之间。纳米颗粒尺寸小、分散程度高，有利于提高复合膜修饰电极的电催化活性比表面积。MWCNTs和Ag/MWCNTs纳米复合材料能谱分析(E，F)结果对比表明，金属Ag成功负载在本发明所述的Ag/MWCNTs纳米复合材料上。

实施例2一种用于叶酸定量检测的电化学传感器

将实施例1制备得到的Ag/MWCNTs复合膜修饰电极作为工作电极，以饱和甘汞电极为参比电极、铂丝电极为辅助电极组装成三电极测试体系，并连接电化学工作站得用于叶酸定量检测的电化学传感器。

实施例3用于叶酸定量检测的电化学传感器的电学性能测试

(1)不同电极的电子传递性能对比

在如实施例2制备得到的三电极测试体系中，分别以MWCNTs修饰电极(a)和实施例1制备得到的Ag/MWCNTs复合膜修饰电极(b)为工作电极在1.0mmol/L K3[Fe(CN)6]混合了0.1mmol/L KCl的底液中进行交流阻抗和循环伏安测试，交流阻抗测试条件为：频率范围10⁵～0.1HZ、振幅5mV、电位0.18V；循环伏安测试条件为：电位范围-0.4～1.0V，扫描速度0.1V/s，测试结果如图2。从图2可见电化学阻抗在上述MWCNTs和Ag/MWCNTs复合膜修饰电极两种工作电极上分别为60Ω和30Ω，氧化峰电流分别为50μA和80μA，结果表明探针离子在本发明所述的Ag/MWCNTs复合膜修饰电极上的阻抗减小、峰电流增加，说明MWCNTs上负载Ag纳米粒子后其电子传递性能和催化活性得到极大增强。

(2)不同电极对叶酸的电催化性能对比

在如实施例2制备得到的三电极测试体系中，分别以玻碳电极(a)、MWCNTs修饰电极(b)和实施例1制备得到的Ag/MWCNTs复合膜修饰电极(c)为工作电极在0.2mmol/L叶酸溶液中的进行循环伏安测试，测试的电位范围为0.3～1.0V、扫描速度为0.1V/s，图3为测试结果。从图中可见叶酸在本发明所述的Ag/MWCNTs复合膜修饰电极上的氧化峰电流为26.75μA，峰电位为0.658V。叶酸在玻碳电极和MWCNTs修饰电极上的峰电流分别为7.16μA和18.20μA，峰电位分别为0.677V和0.691V。叶酸在本发明所述的Ag/MWCNTs复合膜修饰电极上的氧化峰电流值最大，氧化超电势分别下降了19mV和33mV，说明了本发明所制备的Ag/MWCNTs复合膜修饰电极对叶酸有着较好的电催化活性，有利于提高传感器的检测灵敏度。

(3)本发明制备得到的电化学传感器对叶酸的检测性能测试

以实施例1制备得到的Ag/MWCNTs复合膜修饰电极为工作电极、饱和甘汞电极为参比电极和铂丝电极为辅助电极，利用三电极法组装电极测试体系，并连接电化学工作站(构建方法如实施例2所示)；在pH为4.0的柠檬酸-磷酸二氢钠底液中，搅拌富集60s，静止5s后对一系列叶酸溶液进行方波伏安法测试。方波伏安法设置的操作条件为：电位扫描范围0.4～1.2V、电位增幅5mV、电位振幅25mV、测试频率15Hz。结果表明(见图4)叶酸的氧化峰电流随其浓度增加而增大，在5.0×10^-7～1.0×10^-5mol/L和1.0×10^-5～8.0×10^-5mol/L的两个范围内叶酸氧化峰电流与其浓度呈良好的线性关系，线性回归方程为：Ip(A)＝0.00577C(mol/L)+1.29498×10^-7(R²＝0.99929)，Ip(A)＝0.01529C(mol/L)+2.28819×10^-7(R²＝0.98232)，该方程中C为叶酸浓度，Ip为方波伏安法得到氧化峰电流值；检出限计算为6.2nmol/L。说明本发明所制备得到的电极具有良好的线性关系和极低的检出限。

(4)本发明制备得到的Ag/MWCNTs复合膜修饰电极的稳定性和重现性测试

按照实施例1的步骤制备8支相同的Ag/MWCNTs修饰电极，分别以这8支电极为工作电极、饱和甘汞电极为参比电极和铂丝电极为辅助电极，用三电极法组装电极测试系统并连接电化学工作站(构建方法如实施例2所示)，在pH为4.0的柠檬酸-磷酸二氢钠底液中，搅拌富集60s，静止5s，利用方波伏安法对同一浓度的叶酸进行测定。方波伏安法设置的操作条件为：电位扫描范围0.4～1.2V、电位增幅5mV、电位振幅25mV、测试频率15Hz，测定结果的相对标准偏差为2.93％。将其中一支Ag/MWCNTs修饰电极保存在4℃冰箱中，选取8个不同的时间段(保存前测试第1次，然后每隔1天测试1次)，利用上述同样条件和方法对同一浓度的叶酸进行测定，测定的相对标准偏差为3.78％；表明本发明提供的Ag/MWCNTs复合膜修饰电极具有较好的稳定性和重现性。

(5)本发明制备得到的Ag/MWCNTs复合膜修饰电极的抗干扰能力测试

将实施例1制备得到的Ag/MWCNTs复合膜修饰电极利用三电极法组装电极测试体系，并连接电化学工作站构成电化学传感器(构建方法如实施例2所示)，利用方波伏安法考察了外来干扰物质对叶酸测定的影响。方波伏安法设置的操作条件为：电位扫描范围0.4～1.2V、电位增幅5mV、电位振幅25mV、测试频率15Hz。具体测试方法是，在4.5mL柠檬酸-磷酸二氢钠底液中加入0.5mL1mmol/L的叶酸，调节底液pH为4.0，在搅拌富集60s、静止5s后通过方波伏安法测定其氧化峰电流值，再加入0.5mL 1mol/L的干扰物质，通过方波伏安法测定叶酸的氧化峰电流值。对比加入干扰物质前后叶酸的氧化峰电流值的变化情况，如果偏差在±5％以内，可以认为干扰物对分析物的检测无影响。测试结果表明，本发明所制备的传感器在10倍的咖啡酸、左旋多巴以及1倍的抗坏血酸、草酸、VB1、扑热息痛和香草醛等物质的干扰下对叶酸的检测值偏差在±5％以内，说明本发明提供的Ag/MWCNTs复合膜修饰电极具有较好的抗干扰能力，能快速有效地给出检测结果。

实施例4实际样品检测

将某药片取20mg，在研磨中碾碎后，用二次蒸馏水溶解，于超声波清洗机中超声30min后用布氏漏斗过滤，转移到容量瓶中用pH为4.0的柠檬酸-磷酸二氢钠底液定容至50mL。每次取一定量实际样品溶液，将实施例1制备得到的Ag/MWCNTs复合膜修饰电极利用三电极法组装电极测试体系，并连接电化学工作站构成电化学传感器，利用方波伏安法进行测定，然后加入已配的叶酸标准溶液进行回收率测定。方波伏安法设置的操作条件为：电位扫描范围0.4～1.2V、电位增幅5mV、电位振幅25mV、测试频率15Hz。具体测试方法是，取上述实测样品10mL，依次加入1mmol/L的标准叶酸溶液0.1mL、0.2mL、0.3mL，分别调节底液pH为4.0，在搅拌富集60s、静止5s后通过方波伏安法测定叶酸的氧化峰电流值，根据实施例3得到的线性关系找到对应的叶酸浓度值。根据上述方法得到叶酸测定值的相对标准偏差在2.98～4.12％之间，回收率在98.11～99.82％之间；说明了本发明提供的化学修饰电极或电化学传感器可用于药品质量监控和临床医疗检测等行业中叶酸含量的准确测定。