一种基于HPLC‑ELSD和偏最小二乘判别分析法的蜂蜜掺假检测方法与流程

本发明涉及一种基于HPLC-ELSD和偏最小二乘判别分析法的蜂蜜掺假检测方法，属于食品检测技术领域。

背景技术：

蜂蜜作为天然物质，具有独特的风味、口感和营养价值，主要成分为葡萄糖和果糖，同时含有维生素、多种有机酸、无机盐、矿物质和微量元素，具有改善肠胃功能，提高免疫力等功效，同时还在烧伤烫伤，预防心血管疾病，促进溃疡、伤口愈合等方面具有较好的疗效。近年来，蜂蜜的营养价值和保健作用逐渐被人们所熟知，国内外对于蜂蜜的需求量也在不断的增加，蜂蜜的产量难以满足日益增长的市场需求，使得一些不法商贩在利益的驱使下，通过掺入低价蜜、糖浆等甜味物质等方式以假乱真、以次充好，增加蜂蜜产量。这严重扰乱了蜂蜜市场秩序，损害了正规蜂农和企业的利益。

针对较为普遍存在的蜂蜜掺假现象，目前国内外应用较为普遍且较有效的鉴别检测方法，即稳定碳同位素比例法和大米糖浆掺假的LC-MS/MS鉴定方法，所用仪器较为昂贵，难以推广普及，且只能鉴别C4植物类糖浆或C植物糖浆中的一种掺假蜂蜜，不能同时鉴别这两种糖浆掺假，有其局限性。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种掺入淀粉糖浆(包括果葡糖浆或麦芽糖浆)的蜂蜜掺假检测新方法，该方法既适用于C4植物源糖浆也适用于C3植物源糖浆掺假的蜂蜜鉴别。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案为：样品经水溶、过滤处理后，采用亲水作用色谱分离-蒸发光散射检测(HILIC-ELSD)的方法分析纯真蜂蜜和掺有果葡糖浆、麦芽糖浆的蜂蜜样品中低聚糖及其异构体组分，并利用纯真蜂蜜和掺假蜂蜜的低聚糖组分指纹图谱的差异，通过偏最小二乘判别分析法进行数据处理进而实现掺假鉴别。

本发明的技术方案具体包括下列步骤：

1)首先对不同产地、不同蜜源的纯真蜂蜜样品中低聚糖及其异构体进行分析，得到其特征性指纹图谱，即将若干个不同产地、不同蜜源的蜂蜜样品用水溶解定容和过滤，再对它们进行高效液相色谱分离和蒸发光散射检测，根据所得指纹图谱的相对保留时间确定共有特征峰或将所得色谱数据导入指纹图谱专用软件得到蜂蜜的低聚糖标准色谱指纹图谱并确定其共有特征峰；

2)测定得到待检蜂蜜样品的低聚糖指纹图谱；

3)将步骤2)获得的待检蜂蜜样品的指纹图谱的相对峰面积数据与步骤1)获得的若干个不同产地、不同蜜源的纯真蜂蜜样品的指纹图谱的相对峰面积数据组成矩阵，进行偏最小二乘判别分析。

本发明的一种实施方式，具体包括下列步骤：

(1)待检蜂蜜样品的预处理

样品预处理：称取1-2g待检蜂蜜样品于25mL或50mL容量瓶内，蒸馏水定容，充分振摇混匀后，取1mL过0.45μm微孔滤膜，滤液用于低聚糖及其异构体的HPLC分析；

(2)待检蜂蜜样品、低聚糖混合标样的液相色谱分析

色谱条件：色谱柱为XBridgeTMAmide 3.5μm 4.6×250mm；流动相A是50％乙腈，流动相B是75％乙腈，二元梯度洗脱，梯度程序：0～20min，0～50％A；20～30min，50％A；30～33min，50～0％A；33～38min，100％B；柱温：35℃；流速：1.0mL/min；进样量：10μL；检测器ELSD的参数：漂移管温度为95℃；氮气流速为2.5mL/min；

在此条件下分别进样分析低聚糖混合标样、多个纯真蜂蜜样品及待检蜂蜜样品，得到混合标样的色谱图和蜂蜜样品的色谱指纹图谱；根据低聚糖混合标样的色谱保留时间定性纯真蜂蜜样品及待检蜂蜜样品的色谱指纹图谱中的单糖及不同聚合度低聚糖所对应的色谱峰，并以第7个共有峰为参考峰，计算各指纹峰的相对保留时间；

(3)蜂蜜色谱指纹共有特征峰的确定

通过纯真蜂蜜样品的低聚糖及其异构体的HPLC指纹分析，比较其色谱图，根据峰的相对保留时间确定8个共有特征峰，按出峰顺序以第7个共有特征蜂为参照，计算得到8个共有特征峰的相对保留时间(RT)如下：

1号峰平均RT为0.767，RSD为0.24％；

2号峰平均RT为0.806，RSD为0.41％；

3号峰平均RT为0.852，RSD为0.22％；

4号峰平均RT为0.885，RSD为0.13％；

5号峰平均RT为0.916，RSD为0.13％；

6号峰平均RT为0.954，RSD为0.09％；

7号峰平均RT为1.000，RSD为0.00％；

8号峰平均RT为1.118，RSD为1.44％；

(4)偏最小二乘-判别分析

对共有色谱峰进行积分，以每个峰的峰面积与参考峰的峰面积的比值即相对峰面积为新变量，采用偏最小二乘-判别分析方法进行判别分析，对检测的蜂蜜进行真假分类。

在本发明的一种实施方式中，纯蜂蜜样品为9种或9种以上不同蜜源的、不同产地的33个或33个以上纯真蜂蜜样品。

本发明的有益效果：

利用亲水作用色谱分离低聚糖异构体的优势，对纯真蜂蜜和掺假蜂蜜中的低聚糖及其异构体进行分离分析，根据它们的色谱指纹峰的差异，采用偏最小二乘判别分析方法，可鉴别出麦芽糖浆掺假量在5％以上、果葡糖浆掺假量高于10％的掺假蜂蜜样品，建立了仪器较为普及、易于基层蜂蜜企业和检测机构推广应用，且对C4和C3植物糖掺假均适用的HPLC掺假检测方法。

附图说明

图1：9种蜂蜜样品低聚糖组分的HPLC-ELSD指纹图谱。

图2：纯真洋槐蜜色谱图。

图3：纯真洋槐蜜与二、三、四、五、六糖标准品的色谱图对比。

图4：纯真洋槐蜜与分别掺有10％，20％、30％果葡糖浆的洋槐蜜的色谱图对比，其中，图4(b)、图4(c)分别是图4(a)中左右两个矩形框部分的放大图。

图5：纯真洋槐蜜与分别掺有5％、10％麦芽糖浆的洋槐蜜的色谱图对比。

图6：纯真蜂蜜与掺假蜂蜜的主成分得分(t₁/t₂)3D图；两虚线椭圆圈出的部分分别代表掺假蜂蜜、纯真蜂蜜。

图7：PLS-DA模型置换验证图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，下述实施例仅用于说明本发明而非对本发明的限制。

实施例1：基于HILIC-ELSD和偏最小二乘判别分析法的蜂蜜掺假检测

1、仪器、样品及试剂

1.1仪器

Agilent 1100系列高效液相色谱系统：G1313A自动进样器，G1311C四元泵，配Alltech2000蒸发光散射检测器，Agilent1100色谱工作站。

1.2样品及试剂

9种单花种蜂蜜：洋槐蜜、油菜蜜、荔枝蜜、枣花蜜、龙眼蜜、椴树蜜、枇杷蜜、雪脂莲蜜、荆条蜜，共33个样品，由中国养蜂协会副理事长单位江苏日高峰产品有限公司提供。

果葡糖浆(F42)、麦芽糖浆分别由山东香驰健源生物科技有限公司和鲁洲生物科技有限公司提供。

乙腈，色谱纯，(Tedia，USA)；蔗糖，分析纯(国药集团化学试剂有限公司)。

麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖及麦芽六糖标准品(97％以上，日本Hayashibara Biochemical Laboratories，Inc.)。

2、样品前处理与模拟掺假蜂蜜样品的制备

使用上述33个9种不同蜜源的、不同产地的纯真蜂蜜样品，分别按梯度10％、质量分数10％至30％，加入果葡糖浆配制一个掺假蜂蜜样品集，获得掺假蜂蜜样品99个(33×3＝99)；选择15个纯真蜂蜜分别按质量分数5％、10％，加入麦芽糖浆配制一个掺假蜂蜜样品集，获得掺假蜂蜜样品30个；纯真蜂蜜样品33个；由此，获得的样品集总数为162个(99+33+30＝162)。

分别称取1g上述162个样品于25mL容量瓶内，蒸馏水定容至刻度,充分混匀后，取1mL过0.45μm滤膜，滤液于液相进样瓶中备用。

3、蜂蜜中低聚糖组分的色谱指纹分析

色谱柱为XBridgeTMAmide 3.5μm 4.6×250mm；流动相：A(50％乙腈)-B(75％乙腈)二元梯度洗脱。梯度程序：0～20min，0～50％A；20～30min，50％A；30～33min，50～0％A；33～38min，0％A(即100％B)。柱温：35℃；流速：1.0mL/min；进样量：10μL。检测器(ELSD)参数：漂移管温度，95℃；氮气流速，2.5mL/min。

在此条件下分别进样分析低聚糖混合标样及蜂蜜样品，得到混合标样的色谱图和蜂蜜样品的色谱指纹图谱。根据混合标样的色谱保留时间定性蜂蜜样品的色谱指纹图谱中的单糖及不同聚合度低聚糖所对应的色谱峰，并以第7个共有峰为基准，计算各指纹峰的相对保留时间。

通过9种不同蜜源、33个不同产地的纯真蜂蜜样品的低聚糖及其异构体的HPLC指纹分析，比较其色谱图，根据峰的相对保留时间确定得到8个共有特征峰，其相对标准偏差RSD均小于2％；

1号峰平均RT为0.767，RSD为0.24％；

2号峰平均RT为0.806，RSD为0.41％；

3号峰平均RT为0.852，RSD为0.22％；

4号峰平均RT为0.885，RSD为0.13％；

5号峰平均RT为0.916，RSD为0.13％；

6号峰平均RT为0.954，RSD为0.09％；

7号峰平均RT为1.000，RSD为0.00％；

8号峰平均RT为1.118，RSD为1.44％。

对8个共有色谱峰进行积分，以每个峰的峰面积与参考峰(第7个共有峰)的峰面积的比值作为相对峰面积用于后续化学计量学的数据处理。

4、纯真蜂蜜与模拟掺假蜂蜜的色谱峰特征及差异

附图2为一个真洋槐蜜的色谱图。根据与糖标准样品色谱图对比(如附图3)可知，洋槐蜜在保留时间为10.644min(峰1)的色谱峰与蔗糖出峰时间接近(偏后)，而洋槐蜜最后一个峰的保留时间为16.195min(峰8)的色谱峰与麦芽三糖出峰时间相近(偏前)，因此洋槐蜜在保留时间为10.644min(峰1)、11.209min(峰2)、11.869min(峰3)、12.382min(峰4)、12.878min(峰5)、13.464min(峰6)、14.169min(峰7)处的色谱峰可能均为二糖及其异构体，而保留时间为16.195min(峰8)的色谱峰则可能是三糖。将真洋槐蜜与掺有不同比例的果葡糖浆及麦芽糖浆的洋槐蜜色谱图分别进行对比(附图4和图附图5)可见，纯真洋槐蜜与掺假洋槐蜜的差异主要集中在10～15min之间。附图4显示，随着果葡糖浆掺入量的增加，10～13min的色谱峰高逐渐减小，说明该时间段，以蜂蜜成分峰为主；而13～15min的色谱峰高随着果葡糖浆掺入量的增加而增加，这表明该时间段以果葡糖浆成分峰为主。同样，由附图5可见，随着麦芽糖浆掺入量的增加，模拟掺假样的10～12min和13～15min的色谱峰的峰高逐渐减小，即这两时间段内，亦以蜂蜜成分峰为主；而12～13min的色谱峰高则随着麦芽糖浆掺入量少的增加而增加，也说明这些色谱峰以麦芽糖浆及其异构体为主。

5、偏最小二乘判别分析

偏最小二乘法(SIMCA-P11软件)是一种多元统计方法，集典型相关分析、主成分分析和多元回归线性分析的基本功能为一体，分析过程中可以将相互重叠的化学信息消除，使得分析数据更加准确可靠。随机选取16个样品组成验证集，其余146个样品为训练集，并通过相关系数R2和交叉验证回归系数Q2对PLS-DA模型有效性进行评价。将样品的所有色谱峰的相对峰面积作为变量，进行统计学分析。提取2个主成分，自变量的累积解释能力是48.5％，对因变量的解释能力为34.8％，主成分得分图中(如附图6所示)，纯真蜂蜜与掺有果葡糖浆的蜂蜜样品没有交叉，表明该模型能够对样品进行很好的分类。

6、PLS-DA模型的分析

将所有的样品组成的集合分为两类，第一类为所有的纯真蜂蜜，第二类为所有的掺假蜂蜜(包括果葡糖浆和麦芽糖浆)。对模型进行20次的置换检验实验，如附图7所示。结果表明，所有位于左边的点的R²和Q²值(Y轴数据)均低于最右边点的R²和Q²值，且Q²回归线的截距均小于零，说明PLS-DA判别模型不存在过拟合的现象，且对真假蜂蜜的判定有较好的预测能力。

7、PLS-DA模型对样品分类结果

通过分类列表来评估模型的分类能力。对每一个样品的判定标准为：①当Y大于0.5，且偏差小于0.5时，判定样本属于该类，②当Y小于0.5，偏差小于0.5时，判定不属于该类，③当Y约为0.5，判定不稳定[100]，部分样品判定结果如表1，其中大于0.5的数字已用“加粗”标出，错判的样品用“加粗斜体”标出。经统计训练集中的判别率为94.02％，验证集的预测识别率为100％，因此，可得出PLS-DA模型对蜂蜜掺假鉴别效果较好。

表1部分样品分类结果列表

以上试验显示，上述基于HPLC-ELSD和偏最小二乘判别分析法的蜂蜜掺假检测方法既不是基于稳定碳同位素比例法，也不是根据某一种植物源糖浆中特征性物质进行检测，因此，其方法对于C4植物源或C3植物源的淀粉糖浆(包括果葡糖浆和麦芽糖浆)的掺假蜂蜜均能有效鉴别，且所用分析仪器较普及，便于推广应用。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。