一种原位判定混合酿造体系中风味功能微生物的方法
【专利摘要】本发明公开了一种原位判定混合酿造体系中风味功能微生物的方法，属于微生物【技术领域】。本发明主要包括以下步骤：（1）通过酵母26S?rDNA?D1/D2区PCR-DGGE指纹图谱分析确定发酵过程酵母群落结构；（2）测定不同发酵过程挥发性产物；（3）主成分分析方法比较不同发酵过程酵母群落结构与风味轮廓差异；（4）偏最小二乘法回归分析建立挥发性产物谱图与酵母数据之间的联系，确定酵母原位代谢特征、功能酵母。将所得风味功能微生物添加到酿造食品发酵系统中提高产品品质。本发明可应用于发酵食品中酵母原位代谢特征分析，确定酵母对发酵食品风味的影响，判定食品自然混合酿造体系中的风味功能酵母，为调控和优化自然发酵食品微生态系统的功能提供指导。
【专利说明】一种原位判定混合酿造体系中风味功能微生物的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种原位判定混合酿造体系中风味功能微生物的方法，属于微生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]自然微生态系统在发酵食品生产部门中具有重要地位，酵母群落在白酒、干酪、酸奶、酒酿等多个エ业部门中都具有重要的用途。这些传统食品生产エ业是我国传统优势产业之一，历史悠久、文化底蕴深厚，是国民经济发展中增长最快、最具活力的产业之一。传统发酵食品酿造エ艺往往比较复杂，包括若干个エ艺阶段或者若干个エ艺组成部分。比如说茅台酒的酿造エ艺一年ー个周期，投料两次，总共要经过八次发酵，八次蒸酒。在整个酿造过程中，酵母群落的活动会改变系统中的物理、化学參数以及营养的组成，从而影响下ー次发酵时的酵母群落结构组成，因此酵母群落的时空演替贯穿于整个自然发酵食品发酵过程。酵母群落结构的时空演替不断进行，使毎次发酵后得到的产品质感完全不同。酵母群落结构决定了最终发酵食品的品质，因此对于不同发酵阶段酵母群落时空演替的分析，以及酵母原位功能的分析，能够使我们在系统的水平上对整个エ艺进行优化和调控，并在发酵食品品质出现问题时对品质发生变化的原因进行分析。同时，认识微生物在自然酿造中的原位功能，对于在生产中去強化有用的功能菌株，对于提高白酒品质具有重要的意义。但是，目前没有酵母原位功能分析的任何报道，目前认识酵母功能的方法主要通过菌株分离后逐一进行功能測定的方法尽管能初歩认识菌株的功能，但是由于单ー菌株培养条件无法完全模拟混合微生物自然发酵条件，所測定的体外功能与自然酿造体系中微生物的原位功能是不相同的，因此，这种错误的判断使我们对微生物在生产中的功能会造成误导，从而无法有效判定功能菌株，也无法有效应用功能菌株。
[0003]目前关于自然酿造 体系中，如白酒中微生物的研究主要在分析微生物的菌群结构，例如，Xiao-Ran Li等人使用ITSl区域的16S rRNA基因克隆库结合qPCR技术对汾酒酿造过程的微生物群落的时间演替进行了描述。但是，该文献没有提出方法对酵母群落演替模式进行深入分析寻找决定白酒品质的关键酵母。赵立平等人建立了ー种工程化微生态系统运行状态诊断方法，该方法比较正常系统与故障系统之间群落演替模式差別，找出了正常和故障系统中差异的微生物，但是通过简单的比较正常系统与故障系统微生物组成的差别，无法判断在自然原位发酵过程中不同微生物生成的挥发性产物对食品风味的影响。
[0004]本发明g在提供ー种适合于自然酿造体系中微生物原位功能的方法，利用原位的方法判定食品自然混合酿造体系中风味功能酵母。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种原位判定混合酿造体系中风味功能微生物的方法。通过分析白酒发酵过程不同时间酵母群落及挥发性产物时空演替的差别，以及不同种类酵母与挥发性产物关系的确立，来确定白酒酿造微生态中关键优良酵母。[0006]所述方法主要包括以下步骤:
[0007](I)基于酵母26S rDNA D1/D2区PCR-DGGE指纹图谱分析确定发酵过程酵母群落结构；
[0008]所述指纹图谱分析是提取白酒酿造ー轮次不同时间点的酒醅样品中的基因组DNA，进行26S rDNA D1/D2区PCR，并通过DGGE指纹图谱分析所有样品的酵母群落结构；所述26S rDNA D1/D2 区PCR分两步，第一歩PCR体系包括:引物NLl (5’_GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’)和 NL4 (5 ’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3 ’)各 6.25pmol，dNTP5mmol，模板 DNAlOng，Taq DNA聚合酶IU以及配套I Xbuffer及50mmol MgCl2 ;扩增程序为:94°C预变性3分钟，然后94°C变性I分钟，50°C退火2分钟，72°C延伸I分钟，共进行30个循环，最后72°C延伸10分钟；采用UVI band/map软件对条带的迁移位置和亮度进行分析。
[0009]所述的26S rDNA D1/D2区PCR扩增第二步反应体系如下:引物GC_NL1(5’_CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCCATATCAATAAGC-3’)和 LS2 (5 ’-ATTCCCAAACAACTCGACTC-3 ”)各 6.25pmol, dNTP5mmol,模板 DNAlOng, Taq DNA 聚合酶 IU 以及配套 I Xbuffer 及 50mmolMgCl2 ;扩增程序同第一步反应；采用UVIband/map软件对条带的迁移位置和亮度进行分析。
[0010](2)通过主成分载量分析找到在群落演替中起着重要作用的DGGE条带，鉴定其代表的酵母种群；
[0011]主成分分析确定对酵母群落时空演替差异显著的酵母DGGE条带，从原始凝胶上将重要条带分离下来，用相应引物进行扩増，按步骤(1)中所述方法进行PCR、测序，将DNA序列提交数据库进行比对，确定所对应的种属。
[0012](3)測定不同窖池酒醅挥发性产物，对挥发性产物演替轨迹作主成分分析，比较不同过程风味轮廓差异；
[0013]測定发酵过程不同时间点酒醅样品的挥发性产物，具体为:5g样品与20mL无菌生理盐水混合，添加1%的CaCl2粉末，浸泡过夜；超声30分钟后离心，上清液用0.22 ii m的无机膜过滤，滤液用GC-MS分析挥发性产物。
[0014]对所有样品中的挥发性产物半定量数据进行主成分分析，比较不同发酵过程之间挥发性产物差异，具体为:每ー时间点上的挥发性产物指纹图谱可以转换为ー组多维向量，不同的迁移位置代表不同的维度，而挥发性产物浓度作为每ー维度的数值；每ー个样品的挥发性产物指纹图谱就对应了多维空间的ー个点，把每次发酵的每个时间点所对应的点在多维空间中连接起来就组成了一条系统轨迹，再使用主成分分析对多维空间里的挥发性产物变化轨迹进行降维，然后可以直观地在一个二维平面或者三维空间里比较不同发酵过程之间挥发性产物的差別。
[0015](4)偏最小二乗法回归分析建立发酵食品挥发性产物谱图与酵母数据之间的联系:
[0016]通过偏最小二乗法回归分析建立不同种类酵母与挥发性产物之间的预测模型，确定发酵过程中对酵母群落时空演替贡献较大的酵母与挥发性产物之间的关系，即酵母的原位代谢特征；具体为:对不同发酵过程不同时间点的样品酵母DGGE谱图进行亮度分析，获得不同种类酵母的相对量，以所有不同发酵过程不同时间点样品的酵母数量作为自变量X矩阵，相对应时间点某种挥发性产物的量构成ー个ー维向量，作为Y变量，即应变量向量；偏最小二乗法回归分析采用对变量X和Y都进行分解的方法，从变量X和Y中同时提取成分(通常称为因子)，再将因子按照它们之间的相关性从大到小排列。
[0017]本发明的技术方案可以建立所有酵母与不同挥发性产物之间的联系，表现方式是对应检测到的每ー种化合物都可以建立用酵母数量表达的预测方程，在方程中不同种类酵母前面的系数有正有负，方程中酵母系数为正即表示这种酵母与相对应的化合物呈正相关，体系中的化合物含量随这种酵母数量增多而增多。
[0018]应用上述技术方案，本发明从清香型白酒中鉴定筛选得到下述与白酒风味功能微生物:
[0019](I)酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) CGMCC N0.8130 原位功能在于与多种白酒关键风味物质相关，包括苯こ醇，辛醇，辛酸，乳酸乙酯，辛酸乙酯；单纯液态发酵測定风味产物时，能够测到苯こ醇，辛醇，辛酸，但无法测到该菌能够产生辛酸こ酯和乳酸乙酯，而将该菌株用于白酒生产中能够增加白酒中苯こ醇，辛醇，辛酸，乳酸こ酯，辛酸こ酯的含量;
[0020](2)异常毕赤酵母Pichia anomala CGMCC N0.4740原位功能在于与多种白酒关键风味物质相关，包括こ酸乙酯，乳酸乙酯，己酸，1-辛烯-3-醇，异丁酸こ酯；单纯液态发酵测定风味产物时，能够测到こ酸乙酯，乳酸乙酯，己酸和异丁酸乙酯，但未测到该菌能够产生1-辛烯-3-醇，而将该菌株用于白酒生产中能够增加白酒中こ酸乙酯，乳酸乙酯，己酸，1-辛烯-3-醇，异丁酸こ酯的含量；
[0021](3)东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis) CGMCC N0.4741 原位功能在于与白酒中こ酸乙酯，こ酸异戊酷，1-壬醇、壬酸こ酯含量正相关；单纯液态发酵測定风味产物时，能够测到こ酸乙酯， 1-壬醇，但未测到该菌能够产生こ酸异戊酯和壬酸乙酯，而将该菌株用于白酒生产中能够增加白酒中こ酸乙酯，こ酸异戊酷，1-壬醇、壬酸こ酯的含量；
[0022](4)葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum) CGMCC N0.8134原位功能在于与白酒中辛酸，癸酸，己酸乙酯，辛酸乙酯，癸酸こ酯含量正相关；将单纯液态发酵測定风味产物吋，也能测到上述风味产物，将该菌株用于白酒生产中能够增加白酒中辛酸，癸酸，己酸乙酯，辛酸乙酯，癸酸こ酯的含量；
[0023](5) Saccharomyces servazzii CGMCC N0.8132 原位功能，其特征在于与白酒中苯こ醇，こ酸，1-壬醇含量呈正相关；单纯液态发酵測定风味产物吋，能够测到苯こ醇和こ酸，但未测到该菌能够产生1-壬醇。将该菌株用于白酒生产中能够增加白酒中相应的物质的含量；
[0024](6)德尔布有抱酵母(Torulaspora de lbrueckii) CGMCC N0.8133 原位功能在于与白酒中异丁酸乙酯、十二烷酸乙酯，壬内酯含量正相关；单纯液态发酵測定风味产物吋，能够测到异丁酸こ酯和壬内酷，但未测到该菌能够产生十二烷酸乙酯，将该菌株用于白酒生产中能够增加白酒中异丁酸こ酯、十二烷酸こ酯，壬内酯的含量；
[0025](7) Pichia scaptomyzae CGMCC N0.8131原位功能在于与白酒中1-壬醇、异辛醇、3-羟基-2- 丁酮含量正相关；单纯液态发酵測定风味产物吋，能够测到1-壬醇和3-羟基-2_ 丁酮，但未测到该菌能够产生异辛醇，将该菌株用于白酒生产中能够增加白酒中1-壬醇、异辛醇、3-羟基-2- 丁酮的含量；
[0026](8)膜酸毕赤酵母(Pichia membranifaciens) CGMCC N0.4751 原位功能在于与白酒中3-羟基-2-丁酮含量正相关；单纯液态发酵测定风味产物时，能够测到3-羟基-2-丁酮，将该菌株用于白酒生产中能够增加白酒中3-羟基-2- 丁酮的含量。
[0027] 将上述酵母组合2种、3种、4种或更多种组合应用于白酒生产中，白酒中由上述酵母贡献的对应的风味物质可累积增加。
[0028]以上结果表明该原位判定方法可以预测到比单纯发酵更多的物质，并且，在白酒生产中也证明了该法的有效性。
[0029]本发明技术方案可应用于多微生物发酵的各种酿造食品的发酵系统中，包括白酒、黄酒、酱油、醋、各种发酵生产食品中，用以判定出风味功能微生物；将判定出的功能微生物添加到相应的发酵过程中可以增加相应风味物质的含量。
[0030]利用所述原位判定方法获得的食品自然混合酿造体系中的风味功能酵母，可単独或混合应用于各种酿造食品发酵系统，包括白酒、黄酒、酱油、醋、各种发酵生产食品中，以增加产品中相应的风味物质含量。
[0031]本发明首次提供了ー种适合于自然酿造体系中微生物原位功能的方法，利用原位的方法判定食品自然混合酿造体系中风味功能酵母能够有效、准确认识酵母在白酒中的酿造功能，并有助于在白酒生产中强化这些酵母，提高白酒品质。
【专利附图】
【附图说明】
[0032]图1清香型酒一轮次四次发酵过程酵母群落PCR-DGGE指纹图谱示意图，所标记的是在发酵过程中酵母群落空间演替过程中起重要作用的条带。
[0033]图2四楂次发酵过程的酵母群落空间演替轨迹的主成分分析示意图，A、B、C、D分别代表4个不同楂次。
[0034]图3四楂次发酵过程挥发性产物时间演替轨迹的主成分分析示意图，A、B、C、D分别代表4个不同楂次。
【具体实施方式】
[0035]实施例1清香型白酒发酵过程酵母群落结构空间演替模式的比较
[0036]某清香型白酒是采用清蒸四次清，瓷片窖池或砖砌窖池固态分离发酵，固态蒸馏取酒的生产エ艺。
[0037]在本实施例中，对ー轮次生产过程中的四楂次发酵过程(A、B、C、D)分别在0天、5天、10天、15天、20天进行了取样，大楂发酵过程样品构建编号如下:A0、A5、A10、A15、A20 ；二楂发酵过程B0、B5、B10、B15、B20 ;三楂发酵过程C0、C5、C10、C15、C20 ;四楂发酵过程D0、D5、D10、D15、D20。其中大楂二楂发酵过程蒸馏所得的大楂、二楂酒清香纯净，无杂味；三楂四楂发酵过程蒸馏所得的三楂、四楂酒则风味一般，有苦涩味。
[0038]首先使用26S rDNA D1/D2区PCR-DGGE指纹图谱分析了所有样品中酵母群落的组成(如图1所示)。在A、B、C、D四次发酵过程中总共有188条条带分布在28个不同的迁移位置上。因此，每ー个发酵过程的DGGE指纹图谱可以转换为ー个28维向量，其中28个不同的迁移位置分别代表不同的维度，而条带的亮度作为每ー维度的数值(如果没有条带则相应维度上的值为O)。这样每一发酵过程的DGGE指纹图谱就对应了这个28维空间里的一个点，把系统中每个发酵过程所对应的点沿着群落演替的顺序分别连接起来就组成了一条系统轨迹。这样的一条轨迹就代表了发酵过程的空间群落演替模式。因此A、B、C、D四次发酵过程的微生物群落空间演替的模式可以分别用四条28维空间中的系统轨迹来代表。可以进一歩使用PCA分析对这些复杂的多维系统轨迹进行降维，这样就可以在ー个二维平面或者三维的空间里对这两个窖池的微生物群落空间演替模式进行直观比较(图2)。PCl和PC2分别能够解释44%和21%的数据差异。条带7、12、21、23、25、26、28具有较大的PCl载量，这些条带代表了四楂次发酵过程酵母群落演替中重要的种群。这些不同酵母种群的动态变化是这些酵母种群在群落演替的过程中相互协作和竞争的结果。通过构建克隆文库或者直接割胶对这些条带进行鉴定(如表1所示)。26和28具有最大的PCl正载量，21具有最大的PCl负载量，所以这些种群都是四楂次发酵过程酵母群落空间演替中最重要的种群。[0039]表1四楂次发酵过程中重要的酵母种群[0040]
【权利要求】
1.一种原位判定混合酿造体系中风味功能微生物的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)通过对酵母26SrDNA D1/D2区PCR-DGGE指纹图谱分析确定发酵过程酵母群落结构； (2)通过主成分载量分析确定在发酵过程群落演替中起着重要作用的DGGE条带，鉴定其代表的酵母种群； (3)測定发酵过程不同窖池酒醅挥发性风味产物，对挥发性产物演替轨迹作主成分分祈，比较不同发酵过程挥发性风味产物轮廓差异； (4)通过偏最小二乗法回归分析建立挥发性风味产物谱图与在发酵过程群落演替中起着重要作用的酵母群落之间的联系，确定酵母原位代谢特征，确定功能酵母。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是，对发酵过程不同时间点的白酒酒醅样品中的基因组DNA进行26S rDNA D1/D2区PCR，并通过DGGE指纹图谱分析所有样品的酵母群落结构。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述通过偏最小二乗法回归分析，建立酵母对挥发性产物的预测模型，是将发酵过程不同发酵时间点时所有重要酵母DGGE条带作为预测矩阵，相对应时间点时的挥发性风味产物浓度为被预测量，偏最小二乘回归模型建立所有重要酵母与这种挥发性产物之间的联系。
4.根据权利要求1所述的方法，判定出下述清香型白酒中的风味功能微生物: (1)酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)CGMCC N0.8130,与风味物质苯こ醇、辛醇、辛酸、乳酸乙酯、辛酸こ酯相关； (2)异常毕赤酵母(Pichiaanomala)CGMCC N0.4740,与风味物质こ酸こ酯、乳酸乙酯、己酸、1-辛烯-3-醇、异丁酸こ酯相关； (3)东方伊萨酵母(Issatchenkiaorientalis)CGMCC N0.4741,与风味物质こ酸乙酯、こ酸异戊酷、1-壬醇、壬酸こ酯相关； (4)葡萄汁酵母(Saccharomycesuvarum)CGMCC N0.8134,与风味物质辛酸、癸酸、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸こ酯相关； (5)Saccharomycesservazzii CGMCC N0.8132,与风味物质苯こ醇、こ酸、1-壬醇含量相关; (6)德尔布有抱酵母(Torulasporadelbrueckii) CGMCC N0.8133,与风味物质异丁酸乙酯、十二烷酸乙酯、壬内酯相关； (7)Pichiascaptomyzae CGMCC N0.8131,与风味物质 1-壬醇、异辛醇、3_ 羟基 _2_ 丁酮相关； (8)膜酸毕赤酵母(Pichiamembranifaciens) CGMCC N0.4751,与风味物质 3-轻基-2-丁酮相关。
5.一种应用利要求I所述方法増加食品发酵系统中风味物质含量的方法，是将原位判定获得的风味功能微生物添加到酿造食品发酵系统中。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述酿造食品为白酒、黄酒、酱油、醋。
【文档编号】C12Q1/02GK103589773SQ201310587080
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2013年11月20日 优先权日:2013年11月20日
【发明者】徐岩, 吴群 申请人:江南大学