一种活性提高的偏甘油酯脂肪酶突变体及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种活性提高的偏甘油酯脂肪酶突变体及其应用，该突变体是对马拉色霉菌（Malassezia?globosa）偏甘油酯脂肪酶进行定点突变获得的酶突变体，其中突变位点为278位的Phe，所述278位的Phe突变为Ile或Gly。本发明所得突变体Phe278Ile和Phe278Gly为偏甘油酯水解活性提高的突变体，更适合生物化工行业的应用。经改造后的SMG1Phe278Ile和SMG1Phe278Gly突变体的水解偏甘油酯的活性有不同程度的提高，分别是野生型的SMG1脂肪酶的水解活性的1.84倍和1.68倍，具有更好的水解偏甘油酯的活性，可以应用于去除油脂中偏甘油酯。
【专利说明】一种活性提高的偏甘油酯脂肪酶突变体及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，涉及一种活性提高的偏甘油酯脂肪酶突变体及其应用。
【背景技术】
[0002]脂肪酶(EC3.1.1.3)即三酰基甘油酰基水解酶，能够催化水解天然底物油脂生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯。而偏甘油酯脂肪酶是一种只水解甘油单酯和甘油二酯，而不水解甘油三酯的一种脂肪酶。脂肪酶参与的催化反应类型广泛，包括催化解脂、酯交换、酯合成等反应，广泛应用于饲料添加剂、油脂加工、食品行业、生物医药、日用化工等领域。
[0003]偏甘油酯脂肪酶特异的底物选择特性可以被利用于将油脂中的甘油单酯和甘油二酯选择性地去除。专利JP62061590公开了一种利用混合的催化剂Lipase G和Rhizopusderemer lipase制备低甘油二酯含量的硬质奶油。中国专利201210549885.1公开了一种利用混合的偏甘油脂肪酶和单甘油脂肪酶用于去除油脂中的偏甘油酯。尽管这些方法可以有效地降低油脂中偏甘油酯的含量，但是需要使用两种不同类型脂肪酶制剂，增加了生产过程中的成本投入，从而导致最终产品价格的上升。使用高水解甘油单酯和甘油二酯的活性的偏甘油脂肪酶，用去除偏甘油酯是一种可行的方法，但此类型的脂肪酶试剂仍然缺乏。
[0004]蛋白质工程是一种能够改善酶蛋白质特性的可行的方法，借助分子生物学和生物信息学的方法对蛋白进行定向突变和理性改造，而获得性能提高蛋白或酶突变体，由于该方法具有工作量小和获得阳性突变体的概率大，因此被广泛应用于酶分子改造的应用领域。
【发明内容】
[0005]本发明解决的技术问题是提供一种对偏甘油酯水解活性提高的SMGl脂肪酶突变体，可以应用于选择性去除油脂产品中的偏甘油酯。通过理性选择突变位点，是由马拉色霉菌属(Malassezia globosa) SMGl 脂肪酶基因(Genbank 登录号 XM_001732152.1),通过对其蛋白结构(PDB:3UUE)的分析，运用定点突变的方法而获得的脂肪酶突变体。进行定点突变获得酶突变体，亲本SMGl氨基酸序列SEQ ID NO:1中在氨基酸取代位置发生突变，采用“原始氨基酸-位置-替换的氨基酸”来表示脂肪酶突变体中突变的氨基酸，所述偏甘油酯脂肪酶突变体为:Phe278Ile和Phe278Gly。
[0006]本发明的技术方案具体如下:
[0007]一种活性提高的偏甘油酯脂肪酶突变体，该突变体是对马拉色霉菌(Malasseziaglobosa)偏甘油酯脂肪酶进行定点突变获得的酶突变体，其中突变位点为278位的Phe，所述278位的Phe突变为Ile或Gly。
[0008]所述突变体的DNA序列为SEQ N0.2或SEQ N0.3。
[0009]所述突变体的氨基酸序列为SEQ N0.4或SEQ N0.5。
[0010]上述突变体在去除油脂产品中偏甘油酯的应用。该应用主要包括如下步骤:[0011](I)利用偏甘油酯脂肪酶突变体制备突变体表达质粒:
[0012]a、利用重叠延伸PCR方法引入目的突变氨基酸位点，先分段扩增含有突变氨基酸位点的上下游基因片段，然后将带有突变位点的基因片段拼接成含有突变位点全长基因片段；
[0013]b、将上述扩增基因PCR产物经DNA纯化后，限制性内切酶Kpn I和SalI分别对纯化的基因片段和质粒PGAPZaA进行双酶切消化，连接，转化至大肠杆菌E.coli DH5 α感受态细胞，得到突变体表达质粒；
[0014](2)利用突变体表达质粒制备重组菌株:
[0015]a、将步骤(1)的突变体表达质粒经限制性内切酶Bln I线性化后，电转至宿主细胞；
[0016]b、将转化液涂布于含有100mg/ml博莱霉素的YPD平板中，30°C培养3天后，平板上长出酵母单菌落为重组菌株；
[0017](3)将重组菌株重组表达的偏甘油酯脂肪酶用于去除油脂产品中的偏甘油酯。
[0018]步骤(1)所述PCR的引物序列如下:
[0019]SMG For5’ -GGGGTACCAGCAGTATTTACGCCCGTGGCCG-3’
[0020]3’ A0X5， -GGCAAATGGCATTCTGACAT-3，
[0021]Phe278Ile For5’-GCTCGCGAGTTCAACATTGACGACCACCAAG-3’
[0022]Phe278Ile Rev5’-CTTGGTGGTCGTCAATGTTGAACTCGCGAGC-3’
[0023]Phe278Gly For5' -GTTGCTCGCGAGTTCAACGGTGACGACCACCA
[0024]AGGTAT-3’
[0025]Phe278Gly Rev5’ -ATACCTTGGTGGTCGTCACCGTTGAACTCGCGA
[0026]GCAAC-3，
[0027]步骤(2)所述宿主细胞为巴斯德毕赤酵母X-33 (Pichia pastoris)。
[0028]与现有技术相比，本发明具有如下有益效果:
[0029]本发明所得突变体Phe278Ile和Phe278Gly为偏甘油酯水解活性提高的突变体，更适合生物化工行业的应用。经改造后的SMGlPhe278Ile和SMGlPhe278Gly突变体的水解偏甘油酯的活性有不同程度的提高，分别是野生型的SMGl脂肪酶的水解活性的1.84倍和
1.68倍，具有更好的水解偏甘油酯的活性，可以应用于去除油脂中偏甘油酯。
【专利附图】
【附图说明】
[0030]图1为脂肪酶SMGl三维结构图，箭头指向的是278位氨基酸的Phe位点。
[0031]图2为脂肪酶SMGl及突变体的蛋白纯化图，泳道一是蛋白分子量marker，泳道二是纯化后的SMG1，泳道三是纯化后的SMG1-Phe27811e泳道四是纯化后的SMGl_Phe278Gly。
[0032]图3为脂肪酶SMGl及突变体水解偏甘油酯释放脂肪酸的相对含量。
【具体实施方式】
[0033]下面结合具体 实施例对本发明作进一步具体详细描述，但本发明的实施方式不限于此，对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。
[0034]实施例1[0035]脂肪酶SMGl野生型毕赤酵母表达载体的构建
[0036]根据Genbank的球形马拉色偏甘油脂肪酶smgl基因(登录号:XM_001732152)，委托上海生工生物工程公司利用人工合成的方法，并根据毕赤酵母密码子偏好性对序列进行优化(序列 SEQ ID NO:1)。基因合成后，利用引物 SMG For:5’ -GGGGTACCAGCAGTATTTACGCCCGTGGCCG-3’ 及 SMG Rev:5’ ACGCGTCGACTTAATGAGCACCAACCTGAGCT-3’ 扩增成熟肽序列，PCR 扩增条件-MV 5min ；94°C 20s, 53°C 30s, 72°C 80s，25 个循环；72°C 7min。PCR 扩增产物经DNA纯化试剂盒纯化后，限制性内切酶Kpn I和Sal I分别对纯化的基因片段和质粒pGAPZa A进行双酶切消化，连接，转化至大肠杆菌E.coli DH5 α感受态细胞。涂布于LB(含25ug/ml zeocion)平板。挑取阳性克隆通过Kpn I和SalI双酶切鉴定及基因测序，结果表明获得了野生型pGAPZ a A-SMGl表达质粒。
[0037]实施例2
[0038]脂肪酶SMG1278氨基酸位点突变体构建
[0039]采用定点突变技术构建突变体SMGlPhe278Gly和SMGlPhe278Ile，利用重叠延伸PCR方法引入目的突变位点，以SMGl野生型基因pGAPZ a A-SMGl为模板，定点突变反应条件:
[0040]扩增突变上游片段:
[0041]
【权利要求】
1.一种活性提高的偏甘油酯脂肪酶突变体，其特征在于，该突变体是对马拉色霉菌(Malassezia globosa)偏甘油酯脂肪酶进行定点突变获得的酶突变体，其中突变位点为278位的Phe，所述278位的Phe突变为Ile或Gly。
2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体的DNA序列为SEQN0.2或SEQ N0.3。
3.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列为SEQN0.4或 SEQ N0.5。
4.权利要求1~3任意一项突变体在去除油脂产品中偏甘油酯的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，包括如下步骤: (1)利用偏甘油酯脂肪酶突变体制备突变体表达质粒: a、利用重叠延伸PCR方法引入目的突变氨基酸位点，先分段扩增含有突变氨基酸位点的上下游基因片段，然后将带有突变位点的基因片段拼接成含有突变位点全长基因片段； b、将上述扩增基因PCR产物经DNA纯化后，限制性内切酶KpnI和Sal I分别对纯化的基因片段和质粒PGAPZaA进行双酶切消化，连接，转化至大肠杆菌E.coli DH5 α感受态细胞，得到突变体表达质粒； (2)利用突变体表达质粒制备重组菌株: a、将步骤 (1)的突变体表达质粒经限制性内切酶BlnI线性化后，电转至宿主细胞； b、将转化液涂布于含有100mg/ml博莱霉素的YPD平板中，30°C培养3天后，平板上长出酵母单菌落为重组菌株； (3)将重组菌株重组表达的偏甘油酯脂肪酶用于去除油脂产品中的偏甘油酯。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤(1)所述PCR的引物序列如下:
SMG For5’ -GGGGTACCAGCAGTATTTACGCCCGTGGCCG-3’
3’A0X5’ -GGCAAATGGCATTCTGACAT-3’
Phe278Ile For5’-GCTCGCGAGTTCAACATTGACGACCACCAAG-3’
Phe278Ile Rev5’-CTTGGTGGTCGTCAATGTTGAACTCGCGAGC-3’
Phe278Gly For5' -GTTGCTCGCGAGTTCAACGGTGACGACCACCA
AGGTAT-3，
Phe278Gly Rev5’-ATACCTTGGTGGTCGTCACCGTTGAACTCGCGA
GCAAC-3，。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤(2)所述宿主细胞为巴斯德毕赤酵母X-33 (Pichia pastoris)。
【文档编号】C12N15/81GK103627685SQ201310586753
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2013年11月20日 优先权日:2013年11月20日
【发明者】王永华, 蓝东明, 刘璐, 王卫飞, 杨博 申请人:华南理工大学