木槿属植物全基因组dna的提取方法
【专利摘要】本发明涉及一种植物全基因组DNA的提取方法，具体公开了一种木槿属植物全基因组DNA的提取方法。该方法主要是将传统的DNA提取方法(CTAB法)与新型的DNA提取试剂盒配合使用，提取高质量、高浓度的木槿属植物全基因组DNA。首先用CTAB法的DNA提取裂解液对木槿属植物叶片的DNA进行提取，然后用氯仿／异戊醇(24：1)进行去污抽提，最后转入DNA提取试剂盒的AP2缓冲液，按照试剂盒的操作说明依次应用试剂盒配制的AP3／E溶液、WB漂洗液、EB洗脱液以及吸附柱完成对DNA的提取。本发明提取的高质量的DNA，为进一步应用分子标记技术进行木槿属植物的相关研究奠定了良好的基础。
【专利说明】木槿属植物全基因组DNA的提取方法
【技术领域】
[0001]本发明属于一种DNA的提取方法领域，具体涉及木槿属植物全基因组DNA的提取方法。
【背景技术】
[0002]木槿属(Hibiscus Linn)植物大部分种类花色艳丽，大多于夏、秋开花,花朵繁茂且色彩丰富，花期较长，观赏价值极高，是世界上重要的观赏花卉之一。木槿属植物约200余种，分布于热带和亚热带地区。我国有24种和16变种或变型，产于全国各地。在我国，木槿属植物在园林应用上较多，主要是因为夏、秋季开花的植物较少，而木槿属植物能从6月初开花，可持续到9月末，且花色艳丽。目前，木槿属植物在园林绿化上仍是采用一些传统品种，在新品种选育方面仍处于初级阶段，而通过充分利用木槿属植物种质资源，培育木槿属植物新品种，特别是挖掘木槿属植物观赏价值高的耐盐碱新品种，这对我国沿海的公路、城市和庭园绿化具有重要的意义。 申请人:于2003年起开始进行木槿属植物的杂交育种工作，获得了杂交新品种，其杂交育种方法于2011年获得授权发明专利(ZL200710190933.1)。随着杂交工作的持续进行，为了减少对杂交后代培育和管理的工作量，节约相关的物力和财力，对杂交后代进行早期杂种鉴定工作显得越来越重要。过去，木槿属植物的杂种鉴定通常是通过形态变异来进行判断，特别是通过植株开花时的花色和花朵的大小以及其它外部形态特征来进行杂种鉴定，这通常需要种植2-3年才能完成杂种鉴定。而现在随着分子生物学的深入研究，杂交种子播种当年即可应用分子标记方法来进行杂交鉴定，判定其是否为真杂交，去除假杂种，保留真杂种，这种应用分子标记方法进行杂交后代的早期鉴定，可节省大量的人力、物力和财力。同时在木槿属植物新品种保护方面，分子标记技术可在木槿新品种实质审查和品种权纠纷司法鉴定中广泛应用。
[0003]我们在提取木槿属植物DNA进行分子鉴定研究时发现，木槿属植物叶片糖、酚含量特别高，应用传统的CTAB法进行提取，当用酒精沉淀时，DNA与糖等裹在一起，很难将其分开，挑取出也无法溶解。而当单纯用DNA提取试剂盒进行DNA提取时，发现结果也不理想，虽然吸附柱将糖类等物质过滤，但提取的DNA浓度极低，几乎检测不到。但到目前为止，还没有关于木槿属植物全基因组DNA提取方法的文献报道，要提取到高质量、高浓度的木槿属植物DNA必须研究一种新的提取方法。
【发明内容】
[0004]本发明是针对上述情况，提供一种木槿属植物全基因组DNA的提取方法，为通过分子标记等技术对木槿属植物基因组学的研究奠定基础。
[0005]本发明充分利用CTAB法对木槿属植物全基因组DNA有效的抽提效果和DNA提取试剂盒的吸附柱将多糖、酚类物质等充分过滤的效果，将2种方法配合使用，对木槿属植物的DNA进行提取，提取过程如下:
[0006](I)取2g左右`木槿属植物幼叶，用液氮研磨成粉状，转入1.5mL的离心管中(以I / 2管为宜)，加入2%的CTAB裂解液500uL(l升2%的CTAB DNA提取裂解液包含:CTAB20g、NaC181.816g、PVP20g、IM Tris-HCl (PH8.0) 100mL、0.5MEDTA_Na2 (PH=8.0) 40mL、ddH20800mL,最后定溶到 1L)和 4uL RNAase (IOmg / mL),揽匀后,65°C水浴 lhr,每 20min 摇
匀一次。
[0007](2)水浴结束后将样品从水浴锅取出冷却，冷却至室温后加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)，混匀后在摇床上摇动lhr。
[0008](3)将(2)中摇匀的样品在冷冻离心机12000rpm离心lOmin，小心吸取上清液到一个新的1.5mL离心管。
[0009](4)加入130uL DNA提取试剂盒缓冲液AP2，充分混匀，冰箱放置5min，14000rpm离心IOmin,吸取上清到I个新的1.5mL离心管。
[0010](5)计算上清量，加入1.5倍体积的DNA提取试剂盒AP3 / E溶液，吹打混匀。
[0011](6)将(5)中所得混合物加入一个吸附柱AC中(DNA提取试剂盒配制)，13000rpm离心lmin，倒掉收集管中的废液，再加入剩余的溶液，再次离心。
[0012](7)加入700uL漂洗液WB (DNA提取试剂盒配制)，12000rpm离心lmin，弃掉废液。
[0013](8)加入500uL漂洗液WB (DNA提取试剂盒配制)，12000rpm离心lmin，弃掉废液。
[0014](9)将吸附柱AC放回空收集管中，13000rpm离心2min，尽量除去漂洗液。
[0015](10)取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加入150uL洗脱缓冲液EB (事先在65?水浴中预热)，室温放置lOmin, 12000rpm离心lmin。
[0016](11)将(10)中得到的溶液重新加入吸附柱中，室温放置5min，12000rpm离心Imin0
[0017](12)由(11)中得到的溶液即为DNA溶液，放置在_20°C保存备用。
具体实施方案
[0018]1、木槿属植物全基因组DNA提取实验设计及其方法步骤
[0019]以红花木槿、白花木槿及其它们的杂交种为试验材料，本发明设计了3种试验方案对其DNA进行提取，3种实验方案分别为:(I)采用常规的CTAB法进行提取；(2)采用北京盖宁金诺生物技术有限责任公司生产的新型广谱植物基因组DNA快速提取试剂盒(HF213)进行DNA提取；(3) CTAB法与DNA快速提取试剂盒(HF213)配合使用对木槿属植物DNA进行提取。3种方法的具体实验步骤如下:
[0020](I) CTAB 法
[0021]①取2g左右木槿属植物幼叶，用液氮研磨成粉状，转入1.5mL的离心管中(以
I/ 2管为宜)，加入2%的CTAB裂解液500uL(l升2%的CTAB DNA提取裂解液包含:CTAB20g、NaC181.816g、PVP20g、lM Tris-HCl (PH8.0) lOOmL.0.5MEDTA-Na2 (PH=8.0)40mL、ddH20800mL,最后定溶到 1L)和 4uL RNAase (IOmg / mL),揽匀后，65°C水浴 lhr,每 20min 摇
匀一次。
[0022]②水浴结束后将样品从水浴锅取出冷却，冷却至室温后加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)，混匀后在摇床上摇动lhr。
[0023]③将②中摇匀的样品在冷冻离心机12000rpm离心lOmin，小心吸取上清液到一个新的1.5mL离心管。再加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)混匀后在摇床上摇动0.5hr左右。摇好后再12000rpm离心lOmin。
[0024]④取上清液加入已加预冷无水乙醇的1.5mL离心管，并上下颠倒几次，_20°C放置Ihr0
[0025]⑤挑出沉淀的DNA到一个新的1.5mL的离心管中，并加入适量的70%乙醇洗涤1-2 次。
[0026]⑥自然凉干DNA，加入 150uL TE(1LTE 包含 ImoL / L Tris-HCl (ρΗ8.0) IOmL,
0.5moL / L EDTA Na2 (pH8.0) 2mL)在室温下溶解，溶解后放冰箱于_20°C保存。
[0027](2) DNA快速提取试剂盒(HF213)提取法
[0028]试剂盒提取法，完全按照试剂盒的说明书进行操作，具体步骤如下:
[0029]①取2g左右木槿属植物幼叶，用液氮研磨成粉状，转入1.5mL的离心管中(以I /
2管为宜)，加入试剂盒中的APl溶液400uL和4uL RNAase (IOmg / mL)，搅匀后，65°C水浴lhr,每20min摇匀一次。
[0030]②水浴结束后将样品从水浴锅取出冷却，冷却至室温后加入130uL DNA提取试剂盒缓冲液AP2,充分混匀，冰箱放置5min, 14000rpm离心lOmin,吸取上清液到I个新的
1.5mL离心管。
[0031 ] ③计算上清液量，加入1.5倍体积的DNA提取试剂盒AP3 / E溶液，吹打混匀。
[0032]④将③中所得混合物加入一个吸附柱AC中(DNA提取试剂盒配制)，13000rpm离心lmin，倒掉收集管中的废液，再加入剩余的溶液，再次离心。
[0033]⑤加入700uL漂洗液WB (DNA提取试剂盒配制)，12000rpm离心lmin，弃掉废液。
[0034]⑥加入500uL漂洗液WB (DNA提取试剂盒配制),12000rpm离心lmin,弃掉废液。
[0035]⑦将吸附柱AC放回空收集管中，13000rpm离心2min，尽量除去漂洗液。
[0036]⑧取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加入150uL洗脱缓冲液EB (事先在65°C水浴中预热),室温放置lOmin, 12000rpm离心lmin。
[0037]⑨将⑧中得到的溶液重新加入吸附柱中，室温放置5min，12000rpm离心lmin。
[0038]⑩将⑨中得到的溶液即为DNA溶液，放置在_20°C保存备用。
[0039](3) CTAB法与快速提取试剂盒(HF213)配合使用法
[0040]该方法主要是采用CTAB法的裂解液对木槿的DNA进行提取，然后用氯仿/异戊醇(24:1)混合液进行去污抽提，最后转入DNA快速提取试剂盒(HF213)的AP2绶冲液，按照试剂盒的说明进行进一步的DNA提取。具体操作步骤如下:
[0041]①取2g左右木槿属植物幼叶，用液氮研磨成粉状，转入1.5mL的离心管中(以I / 2管为宜)，加入2%的CTAB裂解液500uL(l升2%的CTAB DNA提取裂解液包含:CTAB20g、NaC181.816g、PVP20g、lM Tris-HCl (PH8.0) 100mL、0.5MEDTA_Na2 (PH=8.0)40mL、ddH20800mL,最后定溶到 1L)和 4uL RNAase (IOmg / mL),揽匀后,65°C水浴 lhr,每 20min 摇
匀一次。
[0042]②水浴结束后将样品从水浴锅取出冷却，冷却至室温后加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)，混匀后在摇床上摇动lhr。
[0043]⑧将②中摇匀的样品在冷冻离心机12000rpm离心lOmin，小心吸取上清液到一个新的1.5mL离心管。
[0044]④加入130uL DNA提取试剂盒缓冲液AP2，充分混匀，冰箱放置5min，14000rpm离心lOmin,吸取上清液到I个新的1.5mL离心管。
[0045]⑤计算上清液量，加入1.5倍体积的DNA提取试剂盒AP3 / E溶液，吹打混匀。
[0046]⑥将⑤中所得混合物加入一个吸附柱AC中(DNA提取试剂盒配制)，13000rpm离心lmin，倒掉收集管中的废液，再加入剩余的溶液，再次离心。
[0047]⑦加入700uL漂洗液WB (DNA提取试剂盒配制)，12000rpm离心lmin，弃掉废液。
[0048]⑧加入500uL漂洗液WB (DNA提取试剂盒配制),12000rpm离心lmin,弃掉废液。
[0049]⑨将吸附柱AC放回空收集管中，13000rpm离心2min，尽量除去漂洗液。
[0050]⑩取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加入150uL洗脱缓冲液EB (事先在65°C水浴中预热),室温放置lOmin, 12000rpm离心lmin。
[0051]◎将⑩中得到的溶液重新加入吸附柱中，室温放置5min，12000rpm离心lmin。
[0052]◎将◎中得到的溶液即为DNA溶液，放置在_20°C保存备用。
[0053](4) DNA浓度检测
[0054]以上3种方法提取的DNA，均通过琼脂糖凝胶电泳法进行浓度检测，具体操作步骤如下:
[0055]取2 μ L DNA、2 μ L去离子水与2 μ L0.25%的溴酚兰(含蔗糖)，将其混合后，上样于0.8%琼脂糖凝胶(含有溴化乙锭(EB)染色剂)，在IXTAE的电泳缓冲液中进行水平板电泳(电泳仪为DYCP-34型电泳仪，电泳槽为DYY-5型水平电泳槽)，电泳电压为100V，时间90min左右，电泳结束后，在上海培清科技有限公司JS-380自动凝胶图像分析仪观测分析，确定DNA浓度并拍照。
[0056]2、DNA提取结果
[0057]用I中设计的3种方法对木槿属植物的DNA进行提取，结果发现:
[0058]用方法(I)提取DNA，在最后一步用酒精对DNA进行沉淀时，发现大量的糖类和酚类物质与DNA凝合在一起，挑取DNA时只能将这些固体物质一并挑出，用TE进行溶解时发现，根本就无法溶解，第二天吸取其中的溶液部分进行DNA浓度检测，没能检测到DNA。用该方法又反复提取2次，均未检测到DNA。
[0059]用方法⑵提取DNA，完全按照DNA提取试剂盒的说明书进行操作，结果进行DNA浓度检测时，也没能检测到DNA。同方法(I) 一样用该方法又反复提取2次，均未检测到DNA。
[0060]用方法(3)进行木槿属植物DNA的提取，即采用CTAB法与DNA提取试剂盒相结合的方法，DNA浓度检测结果发现，参试的4份材料(两个亲本和两个后代)均提取出了高质量、高浓度的DNA(约为300ng)，且4份材料均一次性提取成功。从检测结果来看，点样孔没有任何参留物质，说明糖、酚以及蛋白质等杂质去除的非常干净(附图1)。
[0061]3、SRAP-PCR技术对方法(3)中提取的DNA的质量验证
[0062]利用以上方法(3)中提取的DNA，通过SRAP-PCR技术对小白花木槿、大红花木槿及其两个杂交后代进行扩增扫描，并通过聚丙烯凝胶电泳法进行电泳检测，从而对所提取的DNA的质量进行进一步的验证。应用SRAP-PCR技术验证的实验方法及其结果如下:
[0063](I)实验方法
[0064]SRAP-PCR扩增引物:利用由5条正向引物和2条反向引物共组成的10对SRAP引物对所提取的DNA进行PCR`扩增，5条正向引物和2条反向引物的引物序列如下表所示。[0065]表1 5条正向引物和2条反向引物的引物的引物序列
[0066]
【权利要求】
1.木槿属植物全基因组DNA的提取方法，其特征在于包括以下步骤: (1)用CTAB法中2%的CTAB裂解液提取DNA，并用氯仿:异戊醇(24:1)进行去污抽提，得到上清液。 (2)将上清液吸入一个新的1.5mL离心管，加入北京盖宁金诺生物技术有限责任公司生产的新型广谱植物基因组DNA快速提取试剂盒(型号:HF213)中的AP2缓冲液130uL，以下操作全部按照该试剂盒的操作说明，依次应用试剂盒配制的AP3 / E溶液、WB漂洗液、EB洗脱液以及吸附柱完成对DNA的提取。
2.根据权利要求1所述的木槿属植物全基因组的DNA提取方法，其特征在于: 本发明充分利用CTAB法对木槿属植物全基因组DNA有效的提取效果和DNA提取试剂盒的吸附柱能将多糖、酚类物质等充分过滤的效果，将CTAB法与北京盖宁金诺生物技术有限责任公司生产的新型广谱植物基因组DNA快速提取试剂盒(HF213)配合使用，提取到高质量、高浓度的木槿属植物全基 因组DNA。
【文档编号】C12N15/10GK103555713SQ201310586697
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年11月21日 优先权日:2013年11月21日
【发明者】於朝广, 殷云龙, 芦治国, 徐建华 申请人:江苏省中国科学院植物研究所