‘苏植1号’杂交结缕草品种鉴定的分子标记方法
【专利摘要】本发明涉及一种植物遗传标记和品种分子鉴定的方法，具体公开了一组鉴定‘苏植1号’杂交结缕草的SRAP标记引物及其鉴别方法。使用该组引物进行PCR反应获取每对引物的扩增片段，根据所获片段与本发明所公开的基因组片段进行比较，可以准确鉴定该结缕草品种是否为‘苏植1号’杂交结缕草。
【专利说明】‘苏植1号’杂交结缕草品种鉴定的分子标记方法
一、【技术领域】
[0001]本发明涉及ー种植物遗传标记和品种分子鉴定的方法，具体地说是ー种基于基因组SRAP分析的‘苏植I号’杂交结缕草品种分子鉴定方法。
二、技术背景 [0002]结缕草属(Zoysia Willd.)是ー类多年生暖季型草坪草，广泛分布于太平洋西岸和北岸沿海地区，在非洲和澳洲等温暖地区亦有分布。我国是全球结缕草分布最广泛、储蓄量最大的国家。然而，从新品种的培育情况来看，我国远远落后于美国、日本和韩国。美国本土不产结缕草，但当美国人发现结缕草为一种优良的草坪草以后，就大量地从国外引进结缕草，美国的德克萨斯农业与机械大学(Texas A&M University)就收集了来自太平洋北部沿岸国家的1000多份结缕草属种质资源，并在此基础上培育了一系列结缕草新品种，如Meyer、Belair、EI Toro、JaMur 等等。
[0003]随着我国草坪业的迅速发展以及国内外对结缕草的大量需求，近些年来我国的一些研究部门与育种专家们也越来越对充分利用我国的结缕草资源，推出国产草种加以重视，先后有‘青岛’结缕草、‘兰引3号’结缕草、‘上海’结缕草等育成。江苏省中国科学院植物研究所从1993年起从国内外广泛收集结缕草种质资源，到目前为止已经收集了结缕草属资源6种I变种共178份种源，并对这些资源从外部性状，坪用价值，形态类型，结实性，抗逆性等方面进行了一系列系统评价，在此基础上，根据优良性状互补配对的原则进行结缕草属种间及种内杂交育种工作，‘苏植I号’杂交结缕草即为结缕草与细叶结缕草杂交所获得的一个优良后代。与已有品种相比，该品种具有密度高、质地柔软细致，叶色深緑，均一性高，弾性好，匍匐茎和地下茎发达，生长速度快等诸多优良特征，可广泛用于长江三角洲及以南地区等地观赏草坪、公共緑地、运动场草坪以及保土草坪建植。该品种于2010年已通过国家草品种审定委员会审定，为我国自主育成的第一个杂交结缕草新品种。
[0004]‘苏植I号’杂交结缕草为一典型的营养繁殖型结缕草新品种，其外部形态易受生长的自然生态条件和草坪管理水平的影响，导致开发商及其使用者难以辨别品种的真实性，给新品种的进一步开发利用带来影响。因此，寻找ー种快速有效，不受环境影响，能够准确区分不同基因型的简单、有效的的鉴别技术显得十分重要。
[0005]SRAP(Sequence-related Amplified Polymorphism)标记是 2001 年由 Li 和Quiros开发的一种基于PCR的新型分子标记技术(Li G, Quiros C F.Sequence-relatedamplIIiea polymorphism(SRAP), a new marker system based on a simple PCRreaction:its application to mapping and gene tagging in Brassica.Theoreticaland Applied Genetics, 2001,103:455-461.), SRAP标记自开发以来，已在多种植物的遗传多祥性、指纹图谱、纯度鉴定、资源亲缘关系分析、连锁图谱构建、基因定位、比较基因组学研究等领域得到广泛应用，2007年本単位首次将SRAP分子标记技术应用到结缕草属植物的杂种真实性鉴定和遗传多样性研究中(薛丹丹，郭海林，郑轶琦，陈宣，刘建秀.结缕草属植物杂交后代杂种真实性鉴定——SRAP分子标记.草业学报，2009，18(1):72-79.郭海林，郑轶琦，陈宣，薛丹丹，刘建秀.结缕草属植物种间关系和遗传多样性的SRAP标记分析.草业学报，2009，18 (5) =201-210.)，研究表明该标记具有操作简便、快速，多态性丰富，重复性好，不受环境影响，能够准确区分不同基因型等特点，可有效地应用于结缕草属植物的品种鉴定中。
三、
【发明内容】
[0006]技术问题:本发明提供一种基于结缕草新品种‘苏植I号’杂交结缕草基因组的SRAP分子标记鉴定方法，它克服了根据形态鉴定的模糊性，该方法对‘苏植I号’杂交结缕草的鉴别更可靠、准确、重复性高。[0007]技术方案:
[0008]上述‘苏植I号’杂交结缕草品种鉴定的分子标记方法，其特征在于:
[0009]1、用新型广谱植物基因组DNA快速提取试剂盒(型号:HF213)提取‘苏植I号’杂交结缕草叶片DNA。
[0010]2、用标记弓丨物Me4Eml的左端弓丨物序列5’ -TGAGTCCAAACCGGACA-3’和右端弓丨物序列5’ -GACTGCGTACGAATTCAA-3’对‘苏植I号’杂交结缕草叶片分离的DNA进行扩增，在100 ~1000bp 范围内，能扩增出且只能扩增出 140bp、190bp、300bp、310bp、400bp、420bp、490bp、620bp 和 900bp 共 9 个 DNA 片段。
[0011]用标记引物Me7Eml的左端引物序列5’ -TGAGTCCAAACCGGACG-3’和右端引物序列5’ -GACTGCGTACGAATTCAA-3’对‘苏植I号’杂交结缕草叶片分离的DNA进行扩增，在400~1000bp范围内，能扩增出且只能扩增出400bp、470bp、600bp、760bp和890bp共5个DNA片段。
[0012]用标记引物MelEm4的左端引物序列5’ -TGAGTCCAAACCGGATA-3’和右端引物序列5’ -GACTGCGTACGAATTTGA-3’对‘苏植I号’杂交结缕草叶片分离的DNA进行扩增，在300~700bp 范围内，能扩增出且只能扩增出 380bp、390bp、400bp、420bp、430bp、450bp、480bp、490bp、520bp、550bp、580bp、650bp、670bp、690bp 共 14 个 DNA 片段。
[0013]同时用以上3对引物对结缕草品种的叶片DNA进行扩增，并且每对引物的扩增结果与上述的扩增片段及其大小完全一致，则表明该结缕草品种为‘苏植I号’杂交结缕草，否则为其它品种。
[0014]3、上述的对‘苏植I号’杂交结缕草叶片分离的DNA进行扩增及其产物的检测方法如下:
[0015]SRAP-PCR采用IOiiL的反应体系，其中包括:50ng模板DNA，10XPCR缓冲液，Mg2+L 5mmol ? I71，dNTPs200 u mo I ? I71，引物 0.2 u mo I ? I74，Taq DNA 聚合酶 0.5U。
[0016]SRAP-PCR 扩增程序为:94°C预变性 4min ;94°C变性 lmin，37°C退火 lmin，72°C延伸10sec，5个循环；94°C变性lmin，50°C退火lmin，72°C延伸10sec，35个循环；循环结束后72°C 延伸 7min，4°C 保存。
[0017]扩增反应在英国TECHNE公司的TC-412型PCR仪上进行。扩增产物通过10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测，并通过银染技术进行染色。
[0018]有益效果:
[0019]1、本发明通过直接检测‘苏植I号’杂交结缕草的DNA序列对其进行鉴定，它克服了根据外部形态鉴定的不确定性，该方法对‘苏植I号’杂交结缕草的鉴别更可靠、准确、重复性高。
[0020]2、本发明为‘苏植I号’杂交结缕草新品种的专利保护提供了客观科学的技术保障。
[0021]3、本发明为‘苏植I号’杂交结缕草推广应用中的品种鉴定提供了有力的实验证据。
四、【专利附图】
【附图说明】:
[0022]图1:SRAP标记引物Me4Eml对‘苏植I号’杂交结缕草的扩增图谱
[0023]图2 =SRAP标记引物Me4Eml对‘苏植I号’杂交结缕草及其对照品种的扩增图谱
[0024]图3 =SRAP标记引物Me7Eml对‘苏植I号’杂交结缕草的扩增图谱
[0025]图4 =SRAP标记引物Me7Eml对‘苏植I号’杂交结缕草及其对照品种的扩增图谱
[0026]图5 =SRAP标记引物MelEm4对‘苏植I号’杂交结缕草的扩增图谱
[0027]图6 =SRAP标记引物MelEm4对‘苏植I号’杂交结缕草及其对照品种的扩增图谱
[0028]在以上六幅图中，图谱下方为材料编号，其中‘苏植I号’杂交结缕草的编号为31-3，M为DNA Maker ; 图谱右侧为DNA marker片段大小；图1、图3和图5中图谱左侧为‘苏植I号’杂交结缕草扩增片段大小。
五、【具体实施方式】
[0029]本发明中利用SRAP分子标记技术鉴别‘苏植I号’杂交结缕草采取的步聚如下:
[0030](一)DNA的提取及鉴定标记的获得
[0031]用新型广谱植物基因组DNA快速提取试剂盒(HF213)提取‘苏植I号’杂交结缕草叶片DNA。
[0032]用48对SRAP引物对所提取的DNA进行PCR扩增，SRAP-PCR采用10 ii L的反应体系，其中包括:50ng 模板 DNA, 10XPCR 缓冲液，Mg2+L 5mmol ?じ1，dNTPs200 u mo I ?じ1，引物 0.2 ii mo I ?じ1，Taq DNA 聚合酶 0.5U。SRAP-PCR 扩增程序为:94°C 预变性 4min ;94°C 变性 lmin,37°C退火 lmin,72°C延伸 IOsec, 5 个循环；94°C变性 Imin, 50°C退火 Imin, 72。。延伸10sec，35个循环；循环结束后72°C延伸7min，4°C保存。扩增反应在英国TECHNE公司的TC-412型PCR仪上进行。扩增产物通过10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测，并通过银染技术进行染色。
[0033]48对SRAP引物的扩增结果表明Me4Eml，Me7Eml和MelEm4这3对引物对‘苏植I号’杂交结缕草的扩增带型清晰，稳定，没有杂带，这3对引物的序列及其扩增结果如下:
[0034]用标记引物Me4Eml的左端引物序列5’ -TGAGTCCAAACCGGACA-3’和右端引物序列5’ -GACTGCGTACGAATTCAA-3’对‘苏植I号’杂交结缕草叶片分离的DNA进行扩增，在100~1000bp 范围内，能扩增出且只能扩增出 140bp、190bp、300bp、310bp、400bp、420bp、490bp、620bp和900bp共9个DNA片段。
[0035]用标记引物Me7Eml的左端引物序列5’ -TGAGTCCAAACCGGACG-3’和右端引物序列5’ -GACTGCGTACGAATTCAA-3’对‘苏植I号’杂交结缕草叶片分离的DNA进行扩增，在400~1000bp范围内，能扩增出且只能扩增出400bp、470bp、600bp、760bp和890bp共5个DNA片段。
[0036]用标记引物MelEm4的左端引物序列5’ -TGAGTCCAAACCGGATA-3’和右端引物序列5’ -GACTGCGTACGAATTTGA-3’对‘苏植I号’杂交结缕草叶片分离的DNA进行扩增，在300~700bp 范围内，能扩增出且只能扩增出 380bp、390bp、400bp、420bp、430bp、450bp、480bp、490bp、520bp、550bp、580bp、650bp、670bp、690bp 共 14 个 DNA 片段。
[0037]( 二 )用所筛选的3对SRAP标记鉴别‘苏植I号’杂交结缕草的验证实验
[0038]应用上述3对引物，对‘苏植I号’杂交结缕草，生产上主栽的结缕草品种沟叶结缕草、‘兰引3号’结缕草、‘青岛’结缕草和上海结缕草，以及本单位选育的坪用价值优良的杂交后代18-1与22-2同时进行扩增，扩增体系、扩增程序和产物检测方法都同上。扩增结果(图1-图6)发现，这3对引物都可以将‘苏植I号’杂交结缕草与其它结缕草区分开来，以不同基因位点有带的记为1，无带的记为0构建不同结缕草品种的数字指纹(表1)，发现每对引物都可以将这些材料相互区分。这表明本发明设计的3对SRAP引物和方法可以用来进行‘苏植I号，杂交结缕草的品种鉴定。
[0039]从验证结果可以看出，本发明设计的3对SRAP引物中，每对弓丨物都可以单独对‘苏植I号’杂交结缕草的品种真实性进行鉴定，但考虑到本发明验证实验的对照品种有限，将来可能会有更多的结缕草新品种问世，为了保证鉴定的准确性，本发明建议用以上3对引物同时对‘苏植I号’杂交结缕草进行鉴定，若3对引物的扩增带型与本发明公布的带型完全一致，则说明该品种为‘苏植I号’杂交结缕草。
[0040]表17份结缕草材料的双码指纹图谱
[0041]
【权利要求】
1.‘苏植I号’杂交结缕草品种鉴定的分子标记方法，其特征在于: 用标记引物Me4Eml的左端引物序列5 ’ -TGAGTCCAAACCGGACA-3 ’和右端引物序列5’ -GACTGCGTACGAATTCAA-3’对‘苏植I号’杂交结缕草叶片分离的DNA进行扩增，在100~1000bp 范围内，能扩增出且只能扩增出 140bp、190bp、300bp、310bp、400bp、420bp、490bp、620bp和900bp共9个DNA片段。 用标记引物Me7Eml的左端引物序列5’ -TGAGTCCAAACCGGACG-3 ’和右端引物序列5’ -GACTGCGTACGAATTCAA-3’对‘苏植I号’杂交结缕草叶片分离的DNA进行扩增，在400~1000bp范围内，能扩增出且只能扩增出400bp、470bp、600bp、760bp和890bp共5个DNA片段。 用标记引物Me lEm4的左端引物序列5’ -TGAGTCCAAACCGGATA-3 ’和右端引物序列5’ -GACTGCGTACGAATTTGA-3’对‘苏植I号’杂交结缕草叶片分离的DNA进行扩增，在300~700bp 范围内，能扩增出且只能扩增出 380bp、390bp、400bp、420bp、430bp、450bp、480bp、490bp、520bp、550bp、580bp、650bp、670bp、690bp 共 14 个 DNA 片段。
2.根据权利要求1所述，‘苏植I号’杂交结缕草品种鉴定的分子标记方法，其特征在于: 同时用以上3对引物对某一结缕草的叶片DNA进行扩增，并且每对引物的扩增结果与权利要求1所述的扩增片段及其大小完全一致，则表明该结缕草品种为‘苏植I号’杂交结缕草。
3.根据权利要求1所述的一种对‘苏植I号’杂交结缕草叶片分离的DNA进行扩增，其特征在于: 用新型广谱植物基因组DNA快速提取试剂盒(型号:HF213)提取‘苏植I号’杂交结缕草叶片DNA。 SRAP-PCR采用10 ii L的反应体系，其中包括:50ng模板DNA，10XPCR缓冲液，Mg2+L 5mmol ? I71，dNTPs200 u mo I ? I71，引物 0.2 u mo I ? I71，Taq DNA 聚合酶 0.5U。 SRAP-PCR扩增程序为:94°C预变性4min ;94°C变性lmin，37°C退火lmin，72°C延伸10sec，5个循环；94°C变性lmin，50°C退火lmin，72°C延伸10sec，35个循环；循环结束后72°C 延伸 7min，4°C 保存。 扩增反应在英国TECHNE公司的TC-412型PCR仪上进行。扩增产物通过10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测，并通过银染技术进行染色。
【文档编号】C12Q1/68GK103602742SQ201310586698
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年11月21日 优先权日:2013年11月21日
【发明者】郭海林, 刘建秀, 郭爱桂, 陈静波, 宗俊勤 申请人:江苏省中国科学院植物研究所