一种菌种保藏方法
【专利摘要】本发明涉及一种菌种保藏方法，该方法是将菌种与10%甘油、2%海藻糖溶液制备的冷冻保护剂混合，放入100孔冻存管盒内，盒盖上做好标记，置于-80℃冰箱内冻存。保藏的菌种取用时，按照冻存盒盖上的标记可快速查找到所需的冻存管菌种。冻存管取出后，立即放入35～40℃的水浴中进行快速、震荡解冻，直到全部融化为止。在无菌操净台下打开冻存管，将内容物移入适宜的培养基上培养。采用本发明方法保藏的菌种，大大降低了保藏成本，无需购买专用设备，所用冷冻保护剂价廉易采购，冻存管制备程序简单、耗时短，存活率高、纯度高、传代5代内稳定性好。
【专利说明】一种菌种保藏方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物发酵【技术领域】，特别是涉及一种在超低温冷冻条件下，保护菌种稳定性及其代谢活性的保藏方法。
【背景技术】
[0002]工业生产中常用的几种菌种保藏方法包括:定期移植法、液体石蜡油保藏法、沙土管保藏法、冷冻真空干燥法、液氮超低温冻结法、-80°C低温冷冻保藏等待。这些菌种保藏方法各有其优点和缺点。例如定期移植法，斜面在保藏期间培养基的水分易于蒸发而收缩、干涸、塌陷，使其浓度增高，渗透压加大，因而会引起菌种退化甚至死亡；连续传代后一些有利性状会减弱；易造成杂菌污染。液体石蜡油保藏法:石蜡油多为化学纯，若含有杂质，尤其是有毒物质，应用于菌种保藏则会影响菌种的生产性能；在保藏过程中石蜡油会因为蒸发减少，而致使斜面培养物露出，若不及时补加，会引起菌种退化甚至死亡；保藏的斜面须直立放置，占据的储存空间太大，对储存设备需量大。沙土管保藏法:保藏载体之一的土，要取于贫瘠土，取材存在要求高；沙、土需要洗涤、除杂、除铁屑；沙土管中沙土的比例不固定，受沙土质量和菌种特性所影响，往往需要通过试验而定；存活率低、变异率高。冷冻真空干燥法:对设备的要求高，制备耗时长，对操作人员的技能要求高。液态氮超低温冻结法:需要先慢速冷冻至-40°C，然后再放入液氮罐内速冷至-150°C进行保存；操作相对繁琐，对设备要求也高。
【发明内容】
[0003]本发明的目的就在于克服上述现有技术的缺陷，提供一种操作方便、简单易行、可操作性高、生物安全性高、保存效能高、保藏成本低的菌种保藏方法。
[0004]为实现上述发明目的所采取的技术方案为:
[0005]本着单一保护剂不能满足菌体抵抗外界恶劣条件的客观情况，本发明所提供的液体菌种的保藏方法是:
[0006]1、冷冻保护剂的制备:按终浓度分别配制10%甘油和2%海藻糖溶液。经119~12rC、30min灭菌，得到冷冻保护剂。
[0007]2、将菌种与复合冷冻保护剂混合后，用冻存管分装好后放入100孔冻存管盒内，盒盖上做好标记，置于_80°C冰箱内直接一步冻存。
[0008]3、复苏操作时，从冰箱中取出制品，立即放置35V -40°C水浴中快速摇动复苏，使得内部结冰全部溶解为止。
[0009]采用本发明的保藏方法，在现有超低温保藏技术的方法上，大大降低了保藏成本，无需购买专用设备，所用冷冻保护剂价廉易采购，冻存管制备程序简单、耗时短。存活率高、纯度高、传代5代内稳定性好。
[0010]与单一采用高浓度甘油做保护剂相比，有以下优点:能消除悬浮在保护剂中的菌样的不均匀状态；能确保制品的质量；给传代生长创造了良好的环境。保证了蛋白质的稳定性。冷冻保存过程中无需实施程序降温，查找与复苏操作方便。
【具体实施方式】
[0011]1、用种液做菌种保藏的流程:
[0012]生产菌株冻存管一活化一代一活化二代一活化三代一自然选育一摇瓶初筛、复筛—性能优良菌种保藏
[0013]2、用斜面孢子做菌种保藏的流程:
[0014]生产菌株冻存管一分离平板一制备斜面一自然选育一种子液制备一发酵液接种—摇瓶初筛、复筛一性能优良斜面保臧
[0015]3、用纯化的单菌落做菌种保藏的流程:
[0016]生产菌株斜面一自然选育一分离平板一单菌落一对一点种一性能优良单菌落保藏。
[0017]实施例
[0018]冷冻保护剂的制备:按终浓度分别配制10%甘油和2%海藻糖溶液。经119~12rC、30min灭菌，得到冷冻保护剂。
[0019]1、种液做菌种保藏
[0020]1.1接种液体培养基，恒温振荡培养后，用刻度吸管精确吸取菌悬液1ml~2ml入耐高温、冷冻离心管内，经8000~10000rpm/min高速离心，弃去上清液，补加1ml~2ml冷冻保护剂，在漩涡混合器上使之与菌体充分混匀。
[0021]1.2冻存管菌种的保存:将上述分装好菌液的冻存管放入100孔冻存管盒内，盒盖上做好标记，置于-80 V超低温冰箱内保存。
[0022]1.3冻存管菌种的恢复培养:保藏的菌种取用时，将按照冻存盒盒盖上的标记可快速查找到所需的冻存管菌种。冻存管取出后，立即放入35~40°C的水浴中进行快速、震荡解冻，直到全部融化为止。在无菌操净台下打开冻存管，将内容物移入适宜的培养基上培养。
[0023]2、斜面孢子做菌种保藏
[0024]2.1在斜面瓶内注入冷冻保护剂(茄瓶斜面:10~15ml ； Φ 32*320_的试管斜面:5~8ml)，用缠有脱脂棉花的接种环轻轻刮取培养物斜面上的孢子(注意勿带起培养基)，将孢子悬浮液转入带有玻璃珠的三角烧瓶内，置于摇床上震荡，得到均一分散的单孢子悬浮液。用刻度吸管精确吸取1.0-2ml (根据用途确定)菌悬液入冻存管内，旋紧盖子。
[0025]2.2冻存管菌种的保存:将上述分装好菌液的冻存管放入100孔冻存管盒内，盒盖上做好标记，置于-80 V超低温冰箱内保存。
[0026]2.3冻存管菌种的恢复培养:保藏的菌种取用时，将按照冻存盒盒盖上的标记可快速查找到所需的冻存管菌种。冻存管取出后，立即放入35~40°C的水浴中进行快速、震荡解冻，直到全部融化为止。在无菌操净台下打开冻存管，将内容物移入适宜的培养基上培养。
[0027]3、用纯化的单菌落做菌种保藏
[0028]3.1将培养物在平皿培养，形成菌落后，用无菌打孔器从平板上切取一些大小均匀的小块(0 0.5-1.0cm)，加入盛有1~2ml冷冻保护剂的冻存管内，置于漩涡混合器上使之充分混合打散。
[0029]3.2冻存管菌种的保存:将上述分装好菌液的冻存管放入100孔冻存管盒内，盒盖上做好标记，置于-80 V超低温冰箱内保存。
[0030]3.3冻存管菌种的恢复培养:保藏的菌种取用时，将按照冻存盒盒盖上的标记可快速查找到所需的冻存管菌种。冻存管取出后，立即放入35~40°C的水浴中进行快速、震荡解冻，直到全部融化为止。在无菌操净台下打开冻存管，将内容物移入适宜的培养基上培养。
[0031]4、铺展性和渗透性考察
[0032]
保
【权利要求】
1.一种菌种保藏方法，其特征是:将需保藏的菌种与冷冻保护剂混合分装，将分装好的菌液冻存管放入100孔冻存管盒内，盒盖上做好标记，置于-80°C超低温冰箱内保存。
2.按照权利要求1所述的菌种的保藏方法，其特征在于冷冻保护剂的制备是按终浓度分别配制10%甘油和2%海藻糖溶液，经119~121°C、30min灭菌，得到冷冻保护剂。
3.按照权利要求1所述的菌种的保藏方法，其特征在于保藏的菌种取用时，按照冻存盒盖上的标记取出冻存管后，立即放入35~40°C的水浴中进行快速、震荡解冻，直到全部融化为止，在无菌操 净台下打开冻存管，将内容物移入适宜的培养基上培养。
【文档编号】C12N1/04GK103667061SQ201310586921
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年11月21日 优先权日:2013年11月21日
【发明者】崔莉, 孙瑞君, 马学霞, 张志
申请人:宁夏启元药业有限公司