香芋南瓜的筛选方法与流程

本发明涉及蔬菜育种领域，特别是涉及一种香芋南瓜的筛选方法。

背景技术：

南瓜作为葫芦科植物中一种重要的园艺作物，具有较高的商业价值和经济价值，是我国重要的经济作物之一。其中香芋南瓜因其具备香味浓郁、品质佳等特点，是市场上深受消费者青睐的小果型南瓜品种之一，销售价格较高，具有较好的经济效益。

香芋南瓜的香味是其品质构成的重要指标，在香芋南瓜品种选育过程中，十分关键的问题是对香味性状的准确鉴定，目前，育种家常采用感官鉴定的方法，主要依靠主观嗅觉来进行香味性状的判断，但是此方法具有一定的局限性，缺乏客观判断的标准，检测人的嗅觉阈值差异不同，感官差异较大，鉴定结果准确定和可靠性难以保证，会对香芋南瓜的鉴定、筛选产生主观影响，而不能对香芋南瓜的筛选做出一种数据化的、客观的评价。由于香味组成复杂，且各种香味成分互相影响，使得准确、快速、简单的对香芋南瓜的香味进行鉴定成为香芋南瓜育种的难题之一。

并且，目前为止还未见关于南瓜香味物质检测技术以及香芋南瓜特征香味化合物的报道。

技术实现要素：

基于此，有必要针对上述问题，提供一种香芋南瓜的筛选方法。

具体技术方案如下：

一种香芋南瓜的筛选方法，先采用气相色谱-质谱法检测南瓜果肉是否含有特征化合物2-乙酰基-1-吡咯啉，含有该特征化合物的南瓜为香芋南瓜。

在其中一些实施例中，所述气相色谱-质谱法的检测步骤如下：

样品预处理：取南瓜果肉切薄片，液氮冷冻，在-70～-80℃保存，得样品，检测前将样品冷冻干燥，脱水，加入液氮中研磨成粉，液氮挥发后得粉状样品；

检测：准确称取1～3g所述粉状样品，放入20ml顶空瓶中，加入1μL浓度为4μg/μL的3-壬酮作为内标物，溶剂为乙醇，迅速拧紧顶空瓶瓶盖，放入40～70℃水浴中，然后迅速插入固相微萃取装置，平衡2～30min，40～70℃吸附35～50min；吸附后把萃取头插入气相色谱-质谱仪的进样口进行解吸附，进样口温度为270℃，解吸附时间为4.5min；解吸附后采用所述气相色谱-质谱仪对样品的挥发性成分进行数据采集和分析。

在其中一些实施例中，所述气相色谱-质谱法的检测步骤如下：

样品预处理：取南瓜果肉切薄片，液氮冷冻，在-80℃保存，得样品，检测前将样品冷冻干燥，然后加入液氮中研磨成细粉，液氮挥发后得预处理干燥粉状样品；

检测：准确称取1g所述粉状样品，放入20ml顶空瓶中，加入1μL浓度为4μg/μL的3-壬酮作为内标物，溶剂为乙醇，迅速拧紧顶空瓶瓶盖，放入70℃水浴中，然后迅速插入固相微萃取装置，平衡2min，70℃吸附35min；吸附后把萃取头插入气相色谱-质谱仪的进样口进行解吸附，进样口温度为270℃，解吸附时间为4.5min；解吸附后采用所述气相色谱-质谱仪对样品的挥发性成分进行数据采集和分析。

在其中一些实施例中，所述气相色谱-质谱法检测中的气相色谱条件如下：气相色谱柱DB-5MS；载气为氦气，流速为1.0ml/min；进样模式为SPME手动进样；进样口温度为270℃；程序化升温：50℃保持3min，随后以5℃/min的速率上升至250℃，保持5min；

质谱条件如下：EI离子源；电离电压70eV；离子源温度230℃；四级杆温度150℃；接口温度280℃；扫描模式为全扫，m/z 35-450。

在其中一些实施例中，所述色谱柱的规格参数为60m×0.32mm×0.25μm。

在其中一些实施例中，所述样品预处理步骤中的冷冻干燥为在-45～-55℃的温度以及压力≤100pa的条件下冻干46～50小时。

在其中一些实施例中，所述干燥粉状样品的粒径为＜0.5mm。

本发明相较现有技术的优点和有益效果为：

发明人通过大量研究，利用气相色谱-质谱联用技术，通过香芋南瓜与其它普通南瓜相比较，获得香芋南瓜的特征物质成分：2-乙酰基-1-吡咯啉，化学式为C₆H₉NO，又被称为古吗啉，为淡黄色液体，是一种天然香物质，易溶于热水、乙醇和乙醚，上述特征物质成分的确定为香芋南瓜的鉴定筛选提供能够量化的物质。进一步地，发明人所优选的检测条件，可以快速、准确的鉴定香芋南瓜中上述特征化合物的有无。

附图说明

图1为香芋南瓜编号为YJ-1的样品的总离子流图；

图2为香芋南瓜编号为YJ-2的样品的总离子流图；

图3为香芋南瓜编号为YJ-3的样品的总离子流图；

图4为香芋南瓜编号为YJ-4的样品的总离子流图；

图5为香芋南瓜编号为YJ-5的样品的总离子流图；

图6为香芋南瓜编号为YJ-6的样品的总离子流图；

图7为非香芋南瓜编号为EY-1的样品的总离子流图；

图8为非香芋南瓜编号为EY-2的样品的总离子流图；

图9为非香芋南瓜编号为EY-3的样品的总离子流图；

图10为非香芋南瓜编号为EY-4的样品的总离子流图；

图11为非香芋南瓜编号为EY-5的样品的总离子流图；

图12为非香芋南瓜编号为EY-6的样品的总离子流图；

图13为香芋南瓜编号为YJ-7的样品的总离子流图；

图14为非香芋南瓜编号为BX-1的样品的总离子流图；

图15为香芋南瓜编号YJ-8的样品的总离子流图；

图16为香芋南瓜编号为HS-1的样品的总离子流图；

图17为香芋南瓜编号为HS-2的样品的总离子流图；

图18为香芋南瓜编号为HS-3的样品的总离子流图；

图19为香芋南瓜编号为HS-4的样品的总离子流图；

图20为香芋南瓜编号为HS-5的样品的总离子流图；

图21为香芋南瓜编号为HS-6的样品的总离子流图。

具体实施方式

以下通过实施例进一步说明本发明。

本发明实施例中所用样品均为广东省农业科学院蔬菜研究所选育的香芋南瓜以及非香芋南瓜，所用设备、试剂均为市售普通产品，其中：

香芋南瓜样品为两类广东省农业科学院蔬菜研究所选育的香芋南瓜材料，均为多代自交纯合自交系材料，性状稳定，样品编号为YJ-1～YJ-8和HS-1～HS-6。

非香芋南瓜样品为两类广东省农业科学院蔬菜研究所选育的不具有香芋南瓜香味性状的南瓜材料，均为多代自交纯合自交系材料，性状稳定，分别编号为EY-1～EY-6和BX-1。

气相色谱质谱联用仪为7890A-7000C气相色谱质谱联用仪，购自美国Agilent公司。

固相微萃取装置50/30μm DVB/CAR/PDMS萃取头，购自美国Supleco公司。

烷烃标准品(C₇-C₄₀)购自sigma。

实验例1香芋南瓜特征化合物确定

选取编号为YJ-1～YJ-6的一类香芋南瓜材料，共从6个成熟的瓜上取样，另外选取一类编号为EY-1～EY-6的非香芋南瓜材料6个瓜，按照以下步骤进行检测：

将上述南瓜果肉取样，切薄片，然后迅速液氮冷冻，放置-80℃超低温冰箱待处理。

将保存的南瓜样品进行冷冻干燥(-50℃，压力≤100pa,冻干48小时)，冷冻干燥后，将南瓜样本加入液氮中研磨成粉，液氮挥发后得到干燥的粉状样品(粒径＜0.5mm)，用于后期检测。

准确称取1g粉状样品，放入20ml顶空瓶中，加入1μL 3-壬酮(4μg/μL)作为内标物，溶剂为乙醇，迅速拧紧顶空瓶瓶盖，放入70℃水浴中。迅速插入固相微萃取装置(50/30μm DVB/CAR/PDMS萃取头，美国Supleco公司)，平衡2min，70℃吸附35min。吸附后，把萃取头插入安捷伦7890A气相色谱串联7000C质谱仪中的色谱仪的进样口进行解吸附，进样口温度为270℃，解吸附时间为4.5min。利用安捷伦7890A气相色谱串联7000C质谱仪对样品挥发性成分进行数据采集和分析。

气相条件：气相色谱柱DB-5MS(60m×0.32mm×0.25μm)；载气为氦气，流速为1.0ml/min；进样模式为SPME手动进样；进样口温度为270℃；程序化升温：50℃保持3min，随后以5℃/min的速率上升至250℃，保持5min。质谱条件：EI离子源；电离电压70eV；离子源温度230℃；四级杆温度150℃；接口温度280℃；扫描模式为全扫，m/z 35-450。

对采集到的数据进行分析。根据各样本的总离子流图能初步判断YJ和EY之间的差异化合物(图1～12)。利用Masshunter定性分析软件(Agilent Masshunter Qualitative Analysis B.07.00)对采集到的全扫数据进行解卷积，RT窗口比例系数100.00；排除m/z 28；信噪比阈值2.0；提取窗口：左侧m/z变化量0.3amu，右侧m/z变化量0.7amu；绝对峰高≥300；绝对峰面积≥1000。

解卷积后的数据文件转化为.cef文件后直接导入MPP分析软件(Mass Profile Professional Software Package 13.1)进行分析。

化合物初步过滤：最小绝对丰度2000counts；保留时间范围4.5-46min；质量数范围35.0-450.0；碎片离子数目≥5。

化合物对齐参数：保留时间偏差范围0.05min；匹配因子0.3；最低分辨率0.2；基线设定为所有样品的一半。

化合物筛选分析参数：至少在一个处理组中出现60％；至少在一组样品中的变异系数<30％；显著性检验(ANOVA)p<0.05。

利用Masshunter定性分析软件对差异化合物进行核实，根据烷烃标准品(C₇-C₄₀)提供的可靠信息计算保留指数，根据化合物保留指数及NIST MS分析结果进行定性，所使用的数据库为NIST 14，保留的定性化合物至少在一组内的平均得分≥80分。

根据差异化合物的定性结果从而获得香芋南瓜的特征化合物2-乙酰基-1-吡咯啉，这类化合物在非香芋南瓜材料的样品中均没有检测到，并且在香芋南瓜材料共6个样品中都能检测到，且在检测到的各类香气化合物中含量偏高(请见表1以及图1～12)。在后续的香芋南瓜选育过程中，通过检测这一特征化合物的有无及高低来鉴定、筛选香芋南瓜种质。

表1：2-乙酰基-1-吡咯啉在香芋南瓜YJ-1～YJ-6与非香芋南瓜EY-1～EY-6中的峰面积比较

从表1以及图1～6样品总离子流图可以看出，YJ-1～YJ-6样品在保留时间11.75分钟附近都能检测到较大峰面积的单峰，经定性分析为化合物2-乙酰基-1-吡咯啉，而非香芋南瓜EY1～EY6种质不能检测到该化合物(请见图7～12)。初步断定该化合物为香芋南瓜的香气特征化合物。

实验例2

为验证实验例1所得香芋南瓜的特征化合物2-乙酰基-1-吡咯啉，选取编号为YJ-7的一类香芋南瓜材料以及另外一类编号为BX-1的非香芋南瓜材料来进行实验：

实验步骤如下：

分别以YJ-7和BX-1材料为研究对象，将上述南瓜果肉取样，切薄片，然后迅速液氮冷冻，放置-80℃超低温冰箱待处理。

将保存的南瓜样品进行冷冻干燥，脱水。待干燥后，将南瓜样本加入液氮中研磨成粉，液氮挥发后得到南瓜干燥的粉样，用于后期检测。

准确称取1g粉状样品，放入20ml顶空瓶中，加入1μL 3-壬酮(4μg/μL)作为内标物，迅速拧紧顶空瓶瓶盖，放入70℃水浴中。迅速插入固相微萃取装置，平衡2min，70℃吸附35min。随后，把萃取头插入安捷伦7890A气相色谱串联7000C质谱仪的色谱仪的进样口进行解吸附，进样口温度为270℃，解吸附时间为4.5min。利用安捷伦7890A气相色谱串联7000C质谱仪对样品挥发性成分进行数据采集和分析。

气相条件：气相色谱柱DB-5MS(60m×0.32mm×0.25μm)；载气为氦气，流速为1.0ml/min；进样模式为SPME手动进样；进样口温度为270℃；程序化升温：50℃保持3min，随后以5℃/min的速率上升至250℃，保持5min。质谱条件：EI离子源；电离电压70eV；离子源温度230℃；四级杆温度150℃；接口温度280℃；扫描模式为全扫，m/z 35-450。

对采集到的数据进行分析。利用Masshunter定性分析软件(Agilent Masshunter Qualitative Analysis B.07.00)对采集到的全扫数据进行解卷积，RT窗口比例系数100.00；排除m/z 28；信噪比阈值2.0；提取窗口：左侧m/z变化量0.3amu，右侧m/z变化量0.7amu；绝对峰高≥300；绝对峰面积≥1000。

首先根据出峰差异，确定两类材料中具有差异的化合物，主要关注峰的有无(图13，图14)。利用Masshunter定性分析软件对差异化合物进行识别，根据烷烃标准品(C₇-C₄₀)提供的可靠信息计算保留指数，根据化合物保留指数及NIST MS分析结果进行定性，所使用的数据库为NIST 14。

在非香芋南瓜样品BX-1中同样未检测到化合物2-乙酰基-1-吡咯啉(保留时间约为11.75分钟)，进一步验证香芋南瓜香味的特征化合物为2-乙酰基-1-吡咯啉。

实验例3

为验证实验例1所得香芋南瓜的特征化合物2-乙酰基-1-吡咯啉，以编号为YJ-8的南瓜材料为样本，在不同的萃取温度，平衡时间、以及吸附时间条件下再次进行实验：

将上述南瓜果肉取样，切薄片，然后迅速液氮冷冻，放置-80℃超低温冰箱待处理。

将保存的南瓜样品进行冷冻干燥，脱水。待干燥后，将南瓜样本加入液氮中研磨成粉，液氮挥发后得到南瓜干燥的粉样，用于后期检测。

准确称取1g粉状样品，放入20ml顶空瓶中，加入1μL 3-壬酮(4μg/μL)作为内标物，迅速拧紧顶空瓶瓶盖，放入50℃水浴中。迅速插入固相微萃取装置，平衡5min，50℃吸附40min。随后，把萃取头插入安捷伦7890A气相色谱串联7000C质谱仪的色谱仪的进样口进行解吸附，进样口温度为270℃，解吸附时间为4.5min。利用安捷伦7890A气相色谱串联7000C质谱仪对样品挥发性成分进行数据采集和分析。

气相条件：气相色谱柱DB-5MS(60m×0.32mm×0.25μm)；载气为氦气，流速为1.0ml/min；进样模式为SPME手动进样；进样口温度为270℃；程序化升温：50℃保持3min，随后以5℃/min的速率上升至250℃，保持5min。质谱条件：EI离子源；电离电压70eV；离子源温度230℃；四级杆温度150℃；接口温度280℃；扫描模式为全扫，m/z 35-450。

首先在总离子流图发现在保留时间11.75分钟处有单一峰(请见图15)。然后对采集到的数据进行分析。利用Masshunter定性分析软件(Agilent Masshunter Qualitative Analysis B.07.00)对采集到的全扫数据进行解卷积，RT窗口比例系数100.00；排除m/z 28；信噪比阈值2.0；提取窗口：左侧m/z变化量0.3amu，右侧m/z变化量0.7amu；绝对峰高≥300；绝对峰面积≥1000。

利用Masshunter定性分析软件对化合物进行识别，根据烷烃标准品(C₇-C₄₀)提供的可靠信息计算保留指数，根据化合物保留指数及NIST MS分析结果进行定性，所使用的数据库为NIST 14。

根据定性结果表明，在保留时间11.75分钟测到的化合物为2-乙酰基-1-吡咯啉，说明该化合物在不同的萃取温度、平衡时间、以及吸附时间下，能够被稳定检测到，进一步验证香芋南瓜香味的特征化合物为2-乙酰基-1-吡咯啉。

实施例1

一种香芋南瓜的筛选方法，包括以下步骤：

样品预处理：以编号为HS-1-HS-6的一类香芋南瓜材料作为测试样品，共6个供试成熟果实，取样时期为2016年6月。取南瓜果肉切薄片，液氮冷冻，在-80℃保存；将保存的南瓜样品进行冷冻干燥(-50℃，压力≤100pa,冻干48小时)，干燥后，将南瓜样本加入液氮中研磨成粉，液氮挥发后得到南瓜干燥的粉状样品(＜0.5mm)，用于后期检测。

检测：准确称取1g粉状样品，放入20ml顶空瓶中，加入1μL 3-壬酮(4μg/μL)作为内标物，溶剂为乙醇，迅速拧紧顶空瓶瓶盖，放入70℃水浴中。迅速插入固相微萃取装置，平衡2min，70℃吸附35min。随后，把萃取头插入安捷伦7890A气相色谱串联7000C质谱仪中色谱仪的进样口进行解吸附，进样口温度为270℃，解吸附时间为4.5min。利用安捷伦7890A气相色谱串联7000C质谱仪对样品挥发性成分进行数据采集和分析。

气相条件：气相色谱柱DB-5MS(60m×0.32mm×0.25μm)；载气为氦气，流速为1.0ml/min；进样模式为SPME手动进样；进样口温度为270℃；程序化升温：50℃保持3min，随后以5℃/min的速率上升至250℃，保持5min。质谱条件：EI离子源；电离电压70eV；离子源温度230℃；四级杆温度150℃；接口温度280℃；扫描模式为全扫，m/z35-450。

对采集到的数据进行分析。首先根据各重复样本的总离子流图(请见图16～21)，可以发现约在11.75分钟有单一峰出现，并且该化合物分离较好。随后，利用Masshunter定性分析软件(Agilent Masshunter Qualitative Analysis B.07.00)对6个供试样本采集到的全扫数据进行解卷积，RT窗口比例系数100.00；排除m/z 28；信噪比阈值2.0；提取窗口：左侧m/z变化量0.3amu，右侧m/z变化量0.7amu；绝对峰高≥300；绝对峰面积≥1000。

利用Masshunter定性分析软件对6个供试样本中的化合物进行核实，并根据烷烃标准品(C₇-C₄₀)提供的可靠信息计算保留指数，根据化合物保留指数及NIST MS分析结果进行定性，所使用的数据库为NIST 14，保留的定性化合物平均得分≥80分。

根据定性结果从而进一步确定在11.75分钟出现的化合物为香芋南瓜种质HS的特征化合物2-乙酰基-1-吡咯啉。并且该化合物出峰保留时间稳定，能够与其他化合物很好的分离(请见图16-21)。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。