一种防治鸡传染性支气管炎的中药制剂的检测方法与流程

本发明涉及一种防治鸡传染性支气管炎的中药的中药制剂的检测方法，属于药物检测的技术领域。

背景技术：

鸡传染性支气管炎(IB)是靠传染性支气管炎病毒(IBV)引起的一种急性的高度接触性呼吸道传染病，因传染性支气管炎早期仅见鸡感染，所以叫鸡传染性支气管炎。目前对于鸡传染性支气管炎尚无有效的治疗方法，主要采用预防免疫手段来保护鸡群，但由于该病毒血清类型较多，临床疫苗免疫时有失败，且病毒常会产生新的变异株，造成疫苗免疫失败风险高，对IB预防效果差，加之抗生素容易产生耐药性，易残留等。对于临床发病鸡群目前主要采用对症治疗，传统中药主要是粉散剂，制剂工艺简单，产品可控性较差，临床使用效果时好时坏。

本发明涉及的一种防治鸡传染性支气管炎的中药组合物，功能疏散风热、利咽消肿、清肺止咳，主要用于IB的治疗。该药的开发，大大弥补了国内治疗IB市场的不足。该中药组合物由以下原料药制备而成的：黄芩、连翘、栀子、金银花、广藿香、柴胡、浙贝母；按照制药领域常规方法制成片剂、胶囊剂、颗粒剂等口服剂型。中药复方制剂，成分复杂，质量受药材来源、加工、贮藏等影响，易造成批间差异大等，对兽药养殖带来一定的影响。由于中药材因产地或收获季节的不同，其有效成分的含量存在较大差异，为更好的控制本药物的质量，稳定药物的疗效，对该中药组合物的质量指标和质量检测方法进行研究。薄层色谱法操作简单，专属性强，近年来被作为药品定性分析的常用方法，应用十分广泛。高效液相色谱法因其精密度高、专属性强，重复性、回收率良好，近年来被作为非挥发性成分定量分析的常用方法。故本研究拟采用薄层色谱法对各药味进行定性鉴别，采用HPLC法测定方中君药黄芩中黄芩苷的含量。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种能定量控制制剂的产品质量，又操作简便的防治鸡传染性支气管炎的中药制剂的检测方法

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

一种防治鸡传染性支气管炎的中药制剂的检测方法，该中药制剂由以下重量份数的原料药制备而成的：10-20份黄芩、10-20份连翘、10-20份栀子、10-20份广藿香、5-15份金银花、5-15份浙贝母、1-10份柴胡，其特征在于，所述检测方法包括薄层色谱鉴别和含量测定项目，其中，鉴别是对制剂中黄芩和金银花，连翘，栀子，广藿香，柴胡，浙贝母的薄层色谱鉴别，具体为：

1)黄芩、金银花薄层色谱鉴别

取含黄芩生药材量0.3g或含金银花生药材量0.2g的样品，加甲醇溶解并稀释至10mL，摇匀，过滤，滤液作为供试品溶液；另取黄芩苷对照品适量，加70％乙醇制成浓度为1.0mg/mL的黄芩苷对照品溶液；取绿原酸对照品适量，加乙醇制成浓度为0.1mg/mL绿原酸对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述黄芩苷对照品溶液4μl、绿原酸对照品溶液1μl、供试品溶液2μl，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以醋酸为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上显相同颜色的荧光斑点。

2)连翘薄层色谱鉴别

当连翘为提取入药时，取相当于含连翘生药材量1.5g的样品固体，加样品量2倍量热水使溶解，离心，取上清液，加水饱和的正丁醇萃取2次，30mL/次，合并正丁醇萃取液，再用氨试液洗2次，20mL/次，用水洗2次，20mL/次，正丁醇液蒸干，残渣用甲醇2mL溶解，用中性氧化铝(100～200目，3g)拌匀，加40％甲醇50mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加1mL甲醇使溶解，作为供试品溶液；

当连翘为提取入药时，取相当于含连翘生药材量1.5g的样品液体，加水饱和的正丁醇萃取2次，30mL/次，合并正丁醇萃取液，再用氨试液洗2次，20mL/次，用水洗2次，20mL/次，正丁醇液蒸干，残渣用甲醇2mL溶解，用中性氧化铝(100～200目，3g)拌匀，加40％甲醇50mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加1mL甲醇使溶解，作为供试品溶液；

当连翘为原粉入药时，取相当于含连翘生药材量1.5g的样品固体，加样品量5倍量热水煎煮30分钟，过滤，滤液浓缩至15mL，加水饱和的正丁醇萃取2次，30mL/次，合并正丁醇萃取液，再用氨试液洗2次，20mL/次，用水洗2次，20mL/次，正丁醇液蒸干，残渣用甲醇2mL溶解，用中性氧化铝(100～200目，3g)拌匀，加40％甲醇50mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加1mL甲醇使溶解，作为供试品溶液；

另取连翘对照药材1.5g，用150mL水煎煮30分钟，过滤液浓缩至15mL，用水饱和的正丁醇萃取2次，30mL/次，合并正丁醇提取液，蒸干，残渣加1mL甲醇使溶解，作为对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述二种溶液各4μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-丙酮-乙酸乙酯-甲酸-水(4∶5∶6∶0.6∶0.6)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上显相同颜色的斑点；

3)栀子薄层色谱鉴别

取步骤2)中连翘薄层色谱鉴别下供试品溶液；另取栀子苷对照品适量，加乙醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述二种溶液各4μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水(5∶5∶1∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上显相同颜色的斑点；

4)广藿香薄层色谱鉴别

当广藿香为原粉入药时，取相当于含广藿香生药材1g的样品固体，加样品量2倍量的正己烷，超声提取15分钟，滤过，滤液浓缩至1mL，作为供试品溶液；当广藿香为提取后入药时，取相当于含广藿香生药材4.5g的样品液体，加正己烷萃取两次，每次加样品量的2倍量，合并正己烷液，挥至1mL，作为供试品溶液；当广藿香为提取后入药时，取相当于含广藿香生药材4.5g的样品固体，加正己烷50mL，超声提取15分钟，滤过，滤液浓缩至1mL，作为供试品溶液；

另取广藿香对照药材1g，加正己烷30mL，超声提取15分钟，滤过，滤液浓缩至1mL，作为对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取对照药材溶液、供试品溶液各2～5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90℃)-丙酮(9∶2)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上显相同颜色的斑点；

5)柴胡薄层色谱鉴别

取步骤2)中连翘薄层色谱鉴别下供试品溶液；取柴胡对照药材0.5g，加水30mL回流1.5小时，过滤，滤液按供试品溶液制备方法制备，作为对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取对照药材溶液、供试品溶液各3μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)零下20℃以下放置1小时的下层溶液为展开剂，在10℃以下展开，取出，晾干，喷以10％对二甲氨基苯甲醛的10％硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰。置日光下和紫外光灯365nm下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上显相同颜色的斑点；

6)浙贝母薄层鉴别

当样品为固体时，取相当于含浙贝母生药材1g的样品粉末，加样品重量1倍的浓氨试液，混匀，放置0.5小时，加样品量2～10倍量三氯甲烷，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇溶解至1mL，作为供试品溶液；

当样品为液体时，取相当于含浙贝母生药材1g的样品液体，加浓氨试液5mL，混匀，放置0.5小时，加三氯甲烷萃取两次，每次25mL，合并三氯甲烷液，蒸干，残渣加乙醇溶解至1mL，作为供试品溶液；

另取浙贝母对照药材1g，加浓氨试液5mL，混匀，放置0.5小时，加三氯甲烷30mL，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇溶解至1mL，作为对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述二种溶液各10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-氨水(17∶2∶0.5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上显相同颜色的斑点。

更进一步的，所述检测方法包括含量测定项目，含量测定是采用高效液相色谱法测定组合物中黄芩所含黄芩苷的量，具体步骤为：

(1)色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以体积比为47∶53的甲醇-0.4％磷酸为流动相，检测波长为280nm，理论塔板数以黄芩苷峰计应不低于4000。

(2)对照品溶液制备：取黄芩苷对照品6mg，精密称定，置于100ml容量瓶中，加50％甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即制成每1毫升含60μg的对照品溶液；

(3)供试品溶液制备：

精密量取口服液样品1mL，置50mL量瓶中，加入50％甲醇至刻度，摇匀，过滤，取续滤液作为供试品溶液；或精密量取含黄芩生药材量0.15g的样品，置50ml量瓶中，加入50％甲醇适量超声提取10-30分钟，加入50％甲醇稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液作为供试品溶液；

(4)测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，记录峰面积，以外标法计算，即得。

一种防治鸡传染性支气管炎的中药组合物，其特征在于该中药组合物由以下重量份数的原料药制备而成的：100-200份黄芩、100-200份连翘、100-200份栀子、50-150份金银花、100-200份广藿香、10-100份柴胡、50-150份浙贝母。优选的，该中药组合物由以下重量份数的原料药制备而成的：120-180份黄芩、120-180份连翘、120-180份栀子、60-140份金银花、120-180份广藿香、20-80份柴胡、60-140份浙贝母。更优选的，该中药组合物由以下重量份数的原料药制备而成的：140-160份黄芩、140-160份连翘、140-160份栀子、80-120份金银花、140-160份广藿香、40-60份柴胡、80-120份浙贝母。所述中药组合物为散剂、胶囊剂、口服液、颗粒剂、注射液或片剂。

本发明还提供了一种防治鸡传染性支气管炎的中药组合物的制备方法，其特征在于步骤如下：称取处方量的黄芩、金银花、连翘、栀子、广藿香、柴胡和浙贝母，粉碎成细粉，过80-100目筛，混匀，分装，制得散剂。

本发明还提供了一种防治鸡传染性支气管炎的中药组合物的制备方法，其特征在于步骤如下：称取处方量的黄芩、金银花、连翘、栀子、广藿香、柴胡和浙贝母，除黄芩外的药材先加处方全部重量8-12倍量的水浸泡0.5-3小时，煎煮2-3次，其中黄芩待首煎药液煮沸后下，每次1-2小时，合并煎液，减压浓缩至稠膏，真空干燥或喷雾干燥，粉碎成细粉，过100目筛，加入适量辅料，混匀，制备散剂、胶囊剂、颗粒剂或片剂。

本发明还提供了一种防治鸡传染性支气管炎的中药组合物的制备方法，其特征在于步骤如下：称取处方量的黄芩、金银花、连翘、栀子、广藿香、柴胡和浙贝母，除黄芩外的药材先加处方全部重量8-12倍量的水浸泡0.5-3小时，煎煮2-3次，其中黄芩待首煎药液煮沸后下，每次1-2小时，合并煎液，减压浓缩至相对密度1.05～1.10(50℃)，加乙醇使含醇量达50-70％；10℃以下放置24-72小时，滤取上清液，回收乙醇至无醇味，加入防腐剂，加水稀释至每1mL的口服液含原生药材0.6～1.0g，滤过，灌装，灭菌，即得口服液制剂。

优选的，提取工艺参数为：加水10倍量，煎煮3次，第一次2小时，第二次、第三次各1小时。除杂工艺参数为：提取液浓缩至相对密度1.05～1.10(50℃)，加乙醇使含醇量达60％。

本发明的有益效果是：

1)本发明中药制剂建立黄芩、金银花、连翘、栀子、广藿香、柴胡、浙贝母的薄层色谱鉴别方法，其专属性强，分离效果好，斑点清晰，重现性好，阴性无干扰，可作为本中药组合物的质量控制方法。

2)本发明通过反复试验选择色谱条件，采用高效液相色谱法测定本品中黄芩苷的含量，黄芩苷与其他组份分离度好，阴性无干扰，方法精密度高，重现性、回收率均好，回收率在95％～105％之间，精密度、重复性、回收率RSD均小于2％。可有效的控制产品的质量，从而确保其临床疗效。

附图说明

下面结合附图对本发明作进一步的说明。

图1为本发明中药制剂的黄芩、金银花薄层色谱图；其中，1.黄芩苷对照品、2.阴性样品(缺黄芩)、3.实施例一、4.实施例二、5.实施例三、6.阴性样品(缺金银花)、7.绿原酸对照品。

图2为本发明中药制剂的连翘薄层色谱图；其中，1.连翘对照药材、2.实施例一、3.实施例二、4.实施例三、5.阴性样品(缺连翘)。

图3为本发明中药制剂的栀子薄层色谱图；其中，1.栀子苷对照品、2.实施例一、3.实施例二、4.实施例三、5.阴性样品(缺栀子)。

图4为本发明中药制剂的广藿香薄层色谱图；其中，1.广藿香对照药材、2.实施例一、3.实施例二、4.实施例三、5.阴性样品(缺广藿香)。

图5为本发明中药制剂的柴胡薄层色谱图；其中，上图为在日光下的柴胡薄层色谱图，下图为在紫外光下的柴胡薄层色谱图，1.柴胡对照药材、2.实施例一、3.实施例二、4.实施例三、5.阴性样品(缺柴胡)。

图6为本发明中药制剂的浙贝母薄层色谱图；其中，1.浙贝母对照药材、2.实施例一、3.实施例二、4.实施例三、5.阴性样品(缺浙贝母)。

图7为本发明中药制剂的黄芩苷HPLC图谱；其中，a.黄芩苷对照品，b.供试品，c.阴性(缺黄芩)样品。

图8为本发明中药制剂的含量测定的黄芩苷标准曲线。

具体实施方式

基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例一：散剂的制备

一种防治鸡传染性支气管炎的中药组合物，由以下重量份数的原料药制备而成的：400g黄芩、400g连翘、400g栀子、400g广藿香、300g金银花、300g浙贝母、200g柴胡。

制备工艺：称取处方量的黄芩、金银花、连翘、栀子、广藿香、柴胡和浙贝母，除黄芩外的药材先加处方全部重量12倍量的水浸泡1小时，煎煮2次，其中黄芩待首煎药液煮沸后下，每次2小时，合并煎液，减压浓缩至稠膏，真空干燥或喷雾干燥，粉碎成细粉，过100目筛，加入淀粉至1000g，混匀，制备散剂。

实施例二：颗粒剂的制备

一种防治鸡传染性支气管炎的中药组合物，由以下重量份数的原料药制备而成的：400g黄芩、400g连翘、400g栀子、400g广藿香、200g金银花、200g浙贝母、40g柴胡。

制备工艺：称取处方量的黄芩、金银花、连翘、栀子、广藿香、柴胡和浙贝母，除黄芩外的药材先加处方全部重量12倍量的水浸泡1小时，煎煮2次，其中黄芩待首煎药液煮沸后下，每次2小时，合并煎液，减压浓缩至相对密度1.05～1.10(50℃)，加乙醇使含醇量达50％；10℃以下放置24小时，滤取上清液，回收乙醇至无醇味，减压浓缩至稠膏，真空干燥或喷雾干燥，粉碎成细粉，过100目筛，加入淀粉200g和微晶纤维素400g，制粒，干燥，整粒，制得1000g颗粒剂。

实施例三：口服液的制备

一种防治鸡传染性支气管炎的中药组合物，由以下重量份数的原料药制备而成的：150g黄芩、150g连翘、150g栀子、150g广藿香、100g金银花、100g浙贝母、50g柴胡。

制备工艺：称取处方量的黄芩、金银花、连翘、栀子、广藿香、柴胡和浙贝母，除黄芩外的药材先加处方全部重量8-12倍量的水浸泡0.5-3小时，煎煮2-3次，其中黄芩待首煎药液煮沸后下，每次1-2小时，合并煎液，减压浓缩至相对密度1.05～1.10(50℃)，加乙醇使含醇量达50-70％；10℃以下放置24-72小时，滤取上清液，回收乙醇至无醇味，加入2g防腐剂山梨酸钾，加水稀释至1000mL，滤过，灌装，灭菌，即得口服液制剂。

实施例四：片剂的制备

一种防治鸡传染性支气管炎的中药组合物，由以下重量份数的原料药制备而成的：180g黄芩、180g连翘、180g栀子、180g广藿香、140g金银花、80g柴胡、140g浙贝母。

制备工艺：称取处方量的黄芩、金银花、连翘、栀子、广藿香、柴胡和浙贝母，除黄芩外的药材先加处方全部重量8倍量的水浸泡1小时，煎煮3次，其中黄芩待首煎药液煮沸后下，每次2小时，合并煎液，减压浓缩至相对密度1.05～1.10(50℃)，加乙醇使含醇量达70％；10℃以下放置24-72小时，滤取上清液，回收乙醇至无醇味，减压浓缩至稠膏，真空干燥或喷雾干燥，粉碎成细粉，过100目筛，加入糊精90g和微晶纤维素200g，制粒，干燥，加入硬脂酸镁10g，制得片剂1000片，每片0.5g。

实施例五：胶囊剂的制备

一种防治鸡传染性支气管炎的中药组合物，由以下重量份数的原料药制备而成的：120g黄芩、120g连翘、120g栀子、120g广藿香、60g金银花、60g浙贝母、20g柴胡。

制备工艺：称取处方量的黄芩、金银花、连翘、栀子、广藿香、柴胡和浙贝母，除黄芩外的药材先加处方全部重量12倍量的水浸泡1小时，煎煮2次，其中黄芩待首煎药液煮沸后下，每次2小时，合并煎液，减压浓缩至相对密度1.05～1.10(50℃)，加乙醇使含醇量达60％；10℃以下放置48小时，滤取上清液，回收乙醇至无醇味，减压浓缩至稠膏，真空干燥或喷雾干燥，粉碎成细粉，过100目筛，加入淀粉75g和微晶纤维素200g，制粒，干燥，加入少量硬脂酸镁，灌装，制得1000粒胶囊剂，0.4g/粒。

实验例：质量标准研究

1 试验材料

仪器：

高效液相色谱仪：安捷伦1200泵，安捷伦二极管阵列检测器，安捷伦自动进样器；

数控超声波清洗器：KQ-250DB型，昆山市超声仪器有限公司；

电子天平：FA2004，上海舜宇恒平科学仪器有限公司。

试药：黄芩苷对照品(批号110715-201318)，连翘对照药材(批号120908-201216)，栀子苷对照品(批号110749-201115)，广藿香对照药材(批号121135-201005)，柴胡对照药材(批号120992-201108)，浙贝母对照药材(批号120972-200404)，中国药品生物制品检定所提供；绿原酸对照品(中国兽医药品监察所，批号z0260611)。

实施例一至五的小试样品和按实施例三的工艺由本实验室中试生产样品(批号：20140701、20140702、20140703、20140704、20140705)。

甲醇(色谱纯，Firsher公司)，水为双蒸水，其余试剂为分析纯。

2 方法

2.1 薄层色谱鉴别研究

2.1.1 黄芩、金银花薄层色谱鉴别

①供试品溶液的制备

取实施例一的散剂1g或实施例二的颗粒剂1g，加适量甲醇超声30分钟使溶解，稀释至10mL，摇匀，过滤，滤液作为供试品溶液。

取实施例三的口服液2mL，加甲醇稀释至10mL，摇匀，过滤，滤液作为供试品溶液。

②对照品溶液的制备

另取黄芩苷对照品适量，加70％乙醇制成的黄芩苷对照品溶液(浓度：1.0mg/mL)；取绿原酸对照品适量，加乙醇制成绿原酸对照品溶液(浓度：0.1mg/mL)。

③阴性样品溶液的制备

取按处方比例同法制备不含黄芩的样品，按供试品溶液制备方法制备，即得阴性样品(缺黄芩)溶液；取按处方比例同法制备不含金银花的样品，按供试品溶液制备方法制备，即得阴性样品(缺金银花)溶液。

④点样、展开、检视

照薄层色谱法(《中国兽药典》2010年版·二部附录32页)试验，吸取上述黄芩苷对照品溶液4μl、绿原酸对照品溶液1μl、供试品溶液及阴性样品溶液各2μl，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以醋酸为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。斑点清晰，分离效果好，阴性无干扰。结果见图1。

2.1.2 连翘薄层色谱鉴别

①供试品溶液的制备

取实施例一的散剂3.75g或实施例二的颗粒剂3.75g，加20m L热水使溶解，离心，取上清液，加水饱和的正丁醇萃取2次(30mL/次)，合并正丁醇萃取液，再用氨试液洗2次(20mL/次)，用水洗2次(20mL/次)，正丁醇液蒸干，残渣用甲醇2mL溶解，用中性氧化铝(100～200目，3g)拌匀，加40％甲醇洗脱(50mL)，收集洗脱液，蒸干，残渣加1mL甲醇使溶解，作为供试品溶液。

取实施例三的口服液10mL，加水饱和的正丁醇萃取2次(30mL/次)，合并正丁醇萃取液，再用氨试液洗2次(20mL/次)，用水洗2次(20mL/次)，正丁醇液蒸干，残渣用甲醇2mL溶解，用中性氧化铝(100～200目，3g)拌匀，加40％甲醇洗脱(50mL)，收集洗脱液，蒸干，残渣加1mL甲醇使溶解，作为供试品溶液。

②对照药材溶液的制备

另取连翘对照药材1.5g，用150mL水煎煮30分钟，过滤液浓缩至约15mL，用水饱和的正丁醇萃取2次(30mL/次)，合并正丁醇提取液，蒸干，残渣加1mL甲醇使溶解，作为对照药材溶液。

③阴性样品溶液的制备

取按处方比例同法制备不含连翘的样品，按供试品溶液制备方法制备，即得阴性样品(缺连翘)溶液。

④点样、展开、检视

照薄层色谱法(《中国兽药典》2010年版·二部附录32页)，吸取上述三种溶液各4μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-丙酮-乙酸乙酯-甲酸-水(4∶5∶6∶0.6∶0.6)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。斑点清晰，分离效果好，阴性无干扰。结果见图2。

2.1.3 栀子薄层色谱鉴别

①供试品溶液的制备

取2.1.2连翘薄层色谱鉴别下供试品溶液。

②对照品溶液的制备

取栀子苷对照品适量，加乙醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液。

③阴性样品溶液的制备

取按处方比例同法制备不含栀子的样品，按供试品溶液制备方法制备，即得阴性样品(缺栀子)溶液。

④点样、展开、检视

照薄层色谱法(《中国兽药典》2010年版·二部附录32页)试验，吸取上述三种溶液各4μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水(5∶5∶1∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。斑点清晰，分离效果好，阴性无干扰。结果见图3。

2.1.4广藿香薄层色谱鉴别

①供试品溶液的制备

取实施例一的散剂11.25g或实施例二的颗粒剂11.25g，加50m L正己烷超声30分钟，过滤，滤液挥至1mL，作为供试品溶液。

取实施例三的口服液30mL，加正己烷萃取两次(50mL/次)，合并正己烷液，挥至1mL，作为供试品溶液。

②对照药材溶液的制备

取广藿香对照药材1g，加正己烷30mL，超声提取15分钟，滤过，滤液浓缩至1mL，作为对照药材溶液。

③阴性样品溶液的制备

取按处方比例同法制备不含广藿香的样品，按供试品溶液制备方法制备，即得阴性样品(缺广藿香)溶液。

④点样、展开、检视

照薄层色谱法(《中国兽药典》2010年版·二部附录32页)试验，吸取对照药材溶液、供试品溶液及阴性样品溶液各2～5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90℃)-丙酮(9∶2)为展开剂，展开，取出，晾干。置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的蓝色荧光斑点。斑点清晰，分离效果好，阴性无干扰。结果见图4。

2.1.5 柴胡薄层色谱鉴别

①供试品溶液的制备

取2.1.2连翘薄层色谱鉴别下供试品溶液。

②对照药材溶液的制备

取柴胡对照药材0.5g，加水30mL回流1.5小时，过滤，滤液按供试品溶液制备方法制备，作为对照药材溶液。

③阴性样品溶液的制备

取按处方比例同法制备不含柴胡的样品，按供试品溶液制备方法制备，即得阴性样品(缺柴胡)溶液。

④点样、展开、检视

照薄层色谱法(《中国兽药典》2010年版·二部附录32页)试验，吸取对照药材溶液、供试品溶液及阴性样品溶液各3μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)零下20℃以下放置1小时的下层溶液为展开剂，在10℃以下展开，取出，晾干，喷以10％对二甲氨基苯甲醛的10％硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰。置日光下和紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。斑点清晰，分离效果好，阴性无干扰。结果见图5。

2.1.6 浙贝母薄层鉴别

①供试品溶液的制备

取实施例一的散剂3.3g或实施例二的颗粒剂5g，加浓氨试液5ml，混匀，放置0.5小时，加30ml三氯甲烷，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇溶解至1mL，作为供试品溶液；

取实施例三的口服液10mL，加浓氨试液5mL，混匀，放置0.5小时，加三氯甲烷萃取两次，每次25mL，合并三氯甲烷液，蒸干，残渣加乙醇溶解至1mL，作为供试品溶液。

②对照品溶液的制备

另取浙贝母对照药材1g，加浓氨试液5mL，混匀，放置0.5小时，加三氯甲烷30mL，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇溶解至1mL，作为对照药材溶液。

③阴性样品溶液的制备

取按处方比例同法制备不含浙贝母的样品，按供试品溶液制备方法制备，即得阴性样品(缺浙贝母)溶液。

④点样、展开、检视

照薄层色谱法(《中国兽药典》2010年版·二部附录32页)，吸取上述三种溶液各10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-氨水(17∶2∶0.5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。斑点清晰，分离效果好，阴性无干扰。结果见图6。

2.1.7 薄层色谱鉴别优选试验

参考药典中双黄连口服鉴别项下黄芩和金银花的鉴别方法，对黄芩和金银花同时鉴别，结果分离效果理想，阴性无干扰，专属性强，表明该法在本处方中重现性高，适于本品中这两味药的鉴别。连翘鉴别中先后试了三氯甲垸-甲醇(5∶1)、三氯甲垸-甲醇(8∶1)为展开剂，分离效果均不理想，最后以甲苯-丙酮-乙酸乙酯-甲酸-水(4∶5∶6∶0.6∶0.6)为展开剂时，斑点分离效果好，阴性无干扰，专属性强。连翘、栀子、柴胡的鉴别，供试品首先采用蒸干后甲醇溶解的处理方法，结果杂质斑点太多，分离效果不好，考虑到这三味药均是鉴别性质相似的皂苷类成分，故参照药典中黄芪鉴别项下供试品溶液的处理方法，结果，分离效果好，斑点清晰，阴性无干扰，专属性强，故连翘、栀子、柴胡采用同一供试品溶液。

广藿香鉴别研究首先参考中国药典广藿香鉴别方法，对百秋醇进行鉴别，结果供试品及阴性样品色谱中，均无百秋李醇斑点。考虑到百秋李醇为广藿香挥发油中成分，本品中广藿香采用水煮的提取方法，百秋李醇含量甚微，薄层色谱法很难检出，故选择对其他成分进行研究。经多次反复研究，发现广藿香采用正己烷提取，石油醚(60～90℃)-丙酮(9∶2)为展开剂，紫外光灯(365nm)下检视，斑点分离效果好，阴性无干扰，专属性强。该法为本研究首次发现，为广藿香中某荧光成分的薄层色谱鉴别方法，具体成分有待进一步研究。

浙贝母的鉴别方法首先参考《中国药典》2010年版一部“浙贝母”鉴别(2)，斑点清晰，但浙贝母有一成分与杂质斑点未分开，后经对展开剂比例进行调整，先后试了乙酸乙酯-甲醇-氨水(17∶2∶1)、乙酸乙酯-甲醇-氨水(17∶2∶2)，当采用乙酸乙酯-甲醇-氨水(17∶2∶0.5)时，斑点分离效果好，阴性无干扰，专属性强。

2.2 含量测定方法学研究

2.2.1 检测波长的确定

参考《中国兽药典》2010年版二部黄芩中黄芩苷含量测定项下检测波长280nm。

2.2.2 色谱条件与系统适用性

选择C18柱，参考《中国兽药典》2010年版二部黄芩中黄芩苷含量测定项下流动相，根据分离情况进行调整，流速1.0mL/分钟。

色谱条件

色谱柱：安捷伦Eclipse XDB-C18(150×4.6mm)；流动相：甲醇-0.4％磷酸(47∶53)；流速：1mL/分钟；检测波长：280nm；理论塔板数以黄芩苷峰计应不低于4000。

系统适用性

按上述色谱条件，进样分析对照品、供试品、阴性样品(缺黄芩)溶液，见图7。结果主峰保留时间8分钟左右，阴性无干扰，供试品色谱中，主峰与杂质峰分离度均大于5，对称因子0.85-1.05之间，理论塔板数大于4000。

2.2.3 供试品溶液的制备

精密量取实施例三的口服液1mL，共三份，分别置50mL量瓶中，加入50％甲醇、甲醇、乙醇至刻度，摇匀，过滤，取续滤液作为供试品溶液。进样分析。

结果：采用乙醇为溶剂时，主峰峰形差，50％甲醇和甲醇为溶剂，峰形对称，含量结果相差不大，考虑到节约成本，选择50％甲醇为溶剂。

即：精密量取实施例三的口服液1mL，置50mL量瓶中，加入50％甲醇至刻度，摇匀，过滤，取续滤液作为供试品溶液。

或精密量取实施例一的散剂0.5g或实施例二的颗粒剂0.5g，置50mL量瓶中，加50％甲醇45ml，超声30分钟使溶解，加入50％甲醇至刻度，摇匀，过滤，取续滤液作为供试品溶液。

2.2.4 专属性

取缺黄芩的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备，进样分析。

2.2.5 线性关系

精密称取黄芩苷对照品13.6mg，置100mL量瓶中，加50％甲醇溶解至刻度，摇匀，作为母液(浓度：136μg/mL)，精密量取母液1、2、4、6、8、10mL，分别置10mL量瓶中，加50％甲醇制成13.6、27.2、54.4、81.6、108.8、136μg/mL的对照品溶液，摇匀，即得。分别精密吸取各对照品溶液10μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件，进样分析，记录色谱图及峰面积值。以峰面积值为纵坐标Y，浓度为横坐标X，绘制标准曲线，计算标准方程及标准系数r。

得黄芩苷回归方程为：y＝22.67x+11.154，R²＝0.9999。数据结果见表1，黄芩苷标准曲线图见图8。

表1 黄芩苷含量测定的线性关系数据结果表

以上结果表明黄芩苷在13.6～136μg/mL范围内，峰面积值与浓度有良好的线性关系，实际样品测定结果准确、可靠。

2.2.6 精密度试验

取黄芩苷对照品，精密称定，加50％甲醇制成的对照品溶液(浓度：73μg/mL)。精密吸取对照品溶液10μL，在上述色谱条件下，重复进样6次，计算黄芩苷面积值的RSD(％)。数据结果见表2。

表2 黄芩苷精密度试验结果表

结果：黄芩苷面积值的RSD＝0.30％，表明仪器精密度良好。

2.2.7 溶液稳定性试验

按供试品溶液制备方法，制备1份供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、12小时，进样10μL，测定峰面积，计算样品中黄芩苷面积值的RSD(％)。数据结果见表3。

表3 稳定性试验结果表

结果表明，供试品溶液在12小时内基本稳定。

2.2.8 重复性试验

取同一批样品(批号：20140703)1mL，共6份，按拟定的含量测定方法，制备成供试品溶液，分别进样10μL，测定峰面积，计算含量RSD(％)。数据结果见表4。

表4 重复性试验结果表

结果：含量RSD为1.58％，表明该法重复性良好。

2.2.9 回收率试验

取实施例三的口服液(批号：20140703，已知含量：2.27mg/mL)0.5mL，共6份，分别置50mL量瓶中，分别精密加入对照品溶液(浓度：0.3107mg/mL)4mL，加50％甲醇至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，作为供试品溶液，依法进样，测定峰面积，计算回收率及回收率RSD(％)。数据结果见表5。

表5 回收率试验结果表

结果平均回收率为99.07％，回收率RSD＝1.61％，表明加样回收率良好。

2.2.10 样品测定

精密移取本品不同批号的样品，按拟定的含量测定方法进行测定。含量测定结果见表6。

表6 十批样品中黄芩苷含量测定结果

2.2.11 色谱柱耐用性

按供试品溶液制备方法制备一份供试品，采用四种不同型号的色谱柱，按含量测定方法进行分离测定。

按供试品溶液制备方法制备一份供试品，采用Syncronis C18(4.6×150mm)、Agilent Eclipse XDB-C18(4.6×150mm)、Agilent Extend-C18(4.6×250mm)、Agilent Eclipse XDB-C18(4.6×250mm)四种型号及规格的色谱柱，按含量测定方法进行分离测定。结果显示，分离效果均符合要求，保留时间适中，保留时间均小于15分钟，分离度均大于5，理论塔板数均大于4000，表明这四种型号的色谱柱，均适合本品中黄芩苷的测定。

上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。