一种用于表征鲳鲹巨噬细胞吞噬微生物的方法与流程

文档序号:11109903阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种用于表征鲳鲹巨噬细胞吞噬微生物的方法,其特征在于,所述鲳鲹巨噬细胞吞噬所述微生物是通过下面步骤进行的:

1).用无水乙醇洗涤显微镜载玻片,并用蜡笔在所述显微镜的干净的区域上圈画圆形区域,所述圆形区域的直径为1.5cm;

2).将鲳鲹巨噬细胞悬液滴加在所述圆形区域,所述鲳鯵巨噬细胞悬液的用量为50μl,所述鲳鲹巨噬细胞浓度为2×106细胞/ml;

3).将所述载玻片放入铺有湿润滤纸的培养皿中并加盖,25oC条件下培养1-2小时;

4).所述鲳鲹巨噬细胞孵育完毕后,用25oC左右的L-15洗涤所述载玻片;

5).将50μl微生物细胞悬液加入所述圆形区域,巨噬细胞:微生物细胞为1:10的比例;

6).将所述载玻片放铺有湿润滤纸的加盖培养皿中,25℃培养60min;

7).用磷酸盐缓冲液或L-15洗所述载玻片5次;

8).用100μl 100%甲醇固定所述载玻片上的所有细胞5min,用70%甲醇冲洗所述载玻片5次;

9).用迪夫快速染色液染色所述载玻片后,空气干燥,滴加封片剂后用盖玻片封片;

10).用油镜观察计数所述鲳鲹巨噬细胞吞噬所述微生物细胞的情况。

2.如权利要求1所述的用于表征鲳鲹巨噬细胞吞噬微生物的方法,其特征在于,

所述微生物细胞为鰤鱼诺卡氏菌细胞,步骤5)中用含20%(v/v)鲳鲹血清的L-15制备鰤鱼诺卡氏菌悬液,浓度为1×107cfu/ml,在20℃,孵育30分钟;用PBS洗菌2次,3000rpm,10min;用含5%(v/v)卵形鲳鲹血清的L-15将所述鰤鱼诺卡氏菌悬液浓度调整到2×107cfu/ml。

3.如权利要求1所述的用于表征鲳鲹巨噬细胞吞噬微生物的方法,其特征在于,

所述微生物细胞为酵母菌细胞,步骤5)中酵母悬液的制备方法为:酵母干粉按0.5%(w/v)溶解于含20%(v/v)卵形鲳鲹血清或小牛血清的L-15。

4.如权利要求1所述的用于表征鲳鲹巨噬细胞吞噬微生物的方法,其特征在于,所述鲳鲹巨噬细胞是按照下面的步骤制备的:

a.解剖鲳鲹,取出头肾;

b.将所述头肾放置在一个无菌的100目细胞筛上,该细胞筛下放置一个装含有20i.u./ml肝素的装有5ml L-15培养基的培养皿;

c.将所述培养皿放置冰块上,在所述细胞筛的网格上摩擦所述头肾,使所述头肾细胞落入所述含L-15的培养皿中形成鲳鯵细胞悬液;

d.将细胞悬液贴壁轻柔的转移到Percoll梯度离心管的34%Percoll层之上;

e.移动加样完毕的所述Percoll梯度离心管,于4℃,400g,离心25分钟;

f.用无菌吸管小心吸取并弃去所述Percoll梯度离心管的上层34%Percoll液体,再用无菌吸管吸取临近34%Percoll/51%Percoll界面处的细胞悬液层,即得到鲳鲹头肾巨噬细胞;

g.加入1ml L-15到所述鲳鲹头肾巨噬细胞悬液,然后在4℃,2000rpm条件下离心7min,弃上清;

h.取沉淀加入1ml灭菌双蒸水冲洗所述鲳鲹头肾巨噬细胞15-30s,4℃,2000rpm离心7min,弃上清。

5.如权利要求4所述的用于表征鲳鲹巨噬细胞吞噬微生物的方法,其特征在于,

在进行步骤h后,用1ml-15培养基重悬所述鲳鲹头肾巨噬细胞,用台盼蓝溶液染色,用血球计数板计数细胞。

6.如权利要求4所述的用于表征鲳鲹巨噬细胞吞噬微生物的方法,其特征在于,

在进行步骤a之前,用针筒对所述鲳鲹进行抽血,抽血体积为15-30mL血/Kg鲳鲹体重。

7.如权利要求4所述的用于表征鲳鲹巨噬细胞吞噬微生物的方法,其特征在于,所述Percoll梯度离心管是按照下面步骤制备的:

i.用10×HBSS和灭菌双蒸水稀释Percoll溶液至34%浓度的34%Percoll;

ii.用10×HBSS和灭菌双蒸水稀释Percoll溶液至51%浓度的51%Percoll;将51%Percoll加入0.01g/L酚红,或将34%Percoll加入0.01g/L酚红;

iii.取离心管,加入34%Percoll;

iv.用吸管将51%Percoll缓慢注入所述离心管的34%Percoll的底部;

其中,所述34%Percoll溶液和所述51%Percoll溶液的体积百分比范围分别为35-65%和35-65%。

8.如权利要求4所述的用于表征鲳鲹巨噬细胞吞噬微生物的方法,其特征在于,

步骤h所获得的所述鲳鲹巨噬细胞进行如下步骤的培养:

A.用L-15培养基重悬所述鲳鲹巨噬细胞沉淀形成巨噬细胞悬液后用血球计数板,显微镜观察,计数所述鲳鲹巨噬细胞;

B.根据鲳鲹巨噬细胞计数结果用L-15培养基调整所述鲳鲹巨噬细胞浓度为1×107细胞/ml,用含钾青霉素/链霉素硫酸盐的无血清L-15培养液进行稀释,其中钾青霉素/链霉素硫酸盐用量:每100mlL-15培养基中青霉素和链霉素各100i.u;

C.将所述巨噬细胞悬液转入细胞培养板或细胞瓶,无血清L-15培养液中25℃培养2h;

D.待头所述肾巨噬细胞贴壁后,吸弃无血清L-15培养液,加入含10%小牛血清、含钾青霉素/链霉素硫酸盐的L-15培养液,继续培养。

9.如权利要求1-8中任一项所述的用于表征鲳鲹巨噬细胞吞噬微生物的方法在检测鲳鲹巨噬细胞浓度或数量中的应用。

10.如权利要求1-8中任一项所述的用于表征鲳鲹巨噬细胞吞噬微生物的方法在研究鲳鲹巨噬细胞与微生物细胞相互作用中的应用。

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