本发明涉及的一种方法，尤其涉及一种建立脓肿分枝杆菌RUO数据库和构建亚型的超级图谱的方法。
背景技术：
脓肿分枝杆菌感染近年来呈明显的上升态势。过去的十几年中，尽管全球范围内结核病的防治已使其传播和流行有所控制，但非结核分枝杆菌(non-tuberculous mycobacteria，NTM)感染的发病率却迅速增长，尤其是免疫功能低下，以及内镜、手术、移植等侵入性操作增加，患者NTM感染率上升，成为临床不可忽视的疾病。NTM分为快速生长型(rapidly growing mycobacteria，RGM)和缓慢生长型，其中RGM被认为是更重要的人类致病菌。RGM感染中约65-80％是由脓肿分枝杆菌感染引起的。
美国的研究显示超过80％的RGM是由脓肿分枝杆菌引起，台湾地区、韩国NTM临床分离菌株中脓肿分枝杆菌在RGM中居首。脓肿分枝杆菌感染主要包括肺部和皮肤软组织感染。另外淋巴结、神经系统和骨关节感染也有报道。更为严重的是脓肿分枝杆菌可以导致手术后伤口的暴发感染，以及肺囊性纤维化患者的移植后播散性感染，2004年至2008年间，巴西政府报道了约2000名患者手术部位脓肿分枝杆菌感染，一度出现脓肿分枝杆菌暴发流行。
脓肿分枝杆菌不仅致病性和播散性极强，也是RGM中耐药性最强的病原体，被称为“抗生素的噩梦(antibiotic nightmare)”，它对大多数一线抗生素耐药，对抗结核药物天然耐药，一度缺乏有效的治疗手段。
新一代的大环内酯类药物克拉霉素是目前较为公认的脓肿分枝杆菌感染治疗的核心药物，也是唯一证明口服有效的抗生素，2007年美国胸科医师协会(American Thoracic Society，ATS)关于脓肿分枝杆菌感染的治疗指南中，克拉霉素被推荐作为治疗脓肿分枝杆菌感染联合用药的基础，如克拉霉素联合阿米卡星、头孢西丁、利奈唑胺等。因此在脓肿分枝杆菌复合耐药机制当中，对大环内酯类抗生素的耐药性尤其值得注意。
目前的研究表明，脓肿分枝杆菌对以克拉霉素为代表的大环内酯类的获得性耐药往往与23SrRNA基因的突变有关，而其对克拉霉素的天然耐药则主要与红霉素甲基化酶(erythromycin methylase，erm)基因相关。因此目前认为其相关基因表达决定了其药物敏感性，而脓肿分枝杆菌复合群的抗生素耐药与它的生物分类学密切相关。
脓肿分枝杆菌复合群可被分为3个亚型，分别为：脓肿分枝杆菌马赛亚种，脓肿分枝杆菌bolletii亚种，和脓肿分枝杆菌脓肿亚种。在基因方面，3个亚种间最值得关注的区别在于，脓肿亚种和bolletii亚种具有完整的erm基因，而马赛亚种所具有的erm基因在两个位置发生了276bps的缺失突变，使它的erm基因相较另2个亚种是不完整的。在药物敏感性方面，3个亚种都会因为23S rRNA基因A2085位置的突变而产生获得性克拉霉素耐药，这一突变在马赛亚种中更为常见。然而，马赛亚种由于其具有的不完整而无法被激活的erm基因，不会在应用大环内酯类抗生素后产生诱导性耐药，而脓肿亚种则会在暴露于大环内酯类抗生素一段时间后发生诱导性耐药。因此，对于不同的亚种所导致的肺部疾病，应用以大环内酯类抗生素为基础的治疗方案会取得截然不同的治疗效果。由此可知，在脓肿分枝杆菌的治疗策略的制定中，深入到亚种层面的菌种鉴定和体外药敏实验同样非常重要。
但是，目前为止，将脓肿分枝杆菌复合群鉴定到亚种层面依旧是个颇具争论性的议题。虽然现在使用PCR方法对erm基因进行扩增，已经可以将马赛亚种与脓肿亚种和bolletii亚种区分开来，但仍然需要应用各种分子学方法对几个管家基因，如rpoB基因、hsp65基因等进行序列分析。
这些以基因分析为基础的分子学分型方法，都比较昂贵且需要较长的时间得出结果，所以在一般的微生物实验室中显得不是非常实用且难以普及。
技术实现要素：
本发明的目的是解决现有技术中的问题，提供一种建立脓肿分枝杆菌RUO(研究用)数据库和构建亚型的超级图谱的方法。
本发明的技术方案是：建立脓肿分枝杆菌RUO数据库和构建亚型的超级图谱的方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤1：脓肿分枝杆菌菌株收集和DNA抽提
1-1、脓肿分枝杆菌菌株的收集
收集脓肿分枝杆菌菌株300株，菌株由痰标本和肺泡灌洗液中分离并收集；
从患者处获得的检测样本在经过NaOH简化处理后，被接种到斜面罗氏培养基上，生长出的菌落在显微镜下确认为抗酸杆菌；
接下来，筛选出的阳性菌落转接种于改良罗氏培养基上，并在37℃条件下培养3至7天；
1-2、DNA抽提
将10微升生长在罗氏培养基上的菌环转移到含有1毫升TE【即10毫摩尔的三(羟甲基)氨基甲烷与1毫摩尔的乙二胺四乙酸组成的混合液】和玻璃念珠的离心管中；将离心管置于漩涡振荡机上振荡10分钟使细菌充分悬浮；吸取400微升的细菌悬液至新的离心管中，加入溶菌酶至终浓度1mg/ml，在温度为37℃的环境下过夜；
加入70微升十二烷基硫酸钠和10微升蛋白分解酶，在温度为65℃的环境下孵育20分钟，加入100微升十六烷基三甲基溴化铵和氯化钠的混合物，然后迅速加入100μ微升氯化钠；
吹打悬液至牛奶状，然后在温度为65℃的环境下孵育10分钟；加入750微升氯仿-异戊醇(24:1)的混合液，漩涡振荡，室温13000转离心5分钟；
吸取上清至新的离心管中，加入0.6倍体积的异戊醇，在-20℃孵育20分钟，然后13000转离心15分钟；弃上清，用乙醇洗涤，13000转离心5分钟；
用200微升TE溶解沉淀，使用微量分光光度计对DNA进行定量，OD260/280值在1.8～2.0区间，浓度>6ug的DNA用来扩增使用；
步骤2：基因文库制备和illumina HiSeq(illumina是公司名字，HiSeq是高通量测序的简写，代表测序平台，这两个在一起就代表这个公司的测序平台)测序
至少3μg DNA用来Illumina双末端测序的文库制备，据Illumina标准的基因DNA文库制备流程，400bp长度的DNA片段用来双末端测序；
利用样品处理系统将DNA剪切成需要的DNA小片段；然后对DNA片段的3’末端添加一个“A”，两端加接头；DNA片段可以通过凝胶电泳提纯，并且通过PCR(聚合酶链式反应)扩增以达到上样量；最后，对定量的Illumina双末端文库进行Illumina Hiseq测序；
步骤3：基因组建立与系统进化树构建
计算实验菌株与标准菌株之间的基因差异；菌种的系统生成树则应用非加权组平均法构建而成；通用标准株序列ATCC19977、CIP18297和CIP108541作为脓肿分枝杆菌亚型的参照序列，而H37Rv则作为其他菌种的参照序列；
步骤4：样本准备和对菌株的检测
吸取1微升含分枝杆菌的罗氏培养基至含有800微升乙醇和250微升玻璃念珠的微量离心管中；
将混悬液转移至新的离心管中，13000转离心5分钟；移除上清，干燥10分钟，用10微升甲酸溶解沉淀，室温孵育2到5分钟；加入10微升乙腈，10000转离心3分钟；吸取1微升上清液至目标板上，充分干燥，并用1微升CHCA(α-氰基-4-羟基肉桂酸)基质液覆盖；
每一块样本板在进行检测之前，都提前使用大肠杆菌的标准株进行仪器参数校准和器械调整；在收集到质谱图信号后，数据即由收集站传输至分析系统，数据由此以峰值信号的形式展现出来；收集到的质谱图数据与RUO数据库进行比对后，生成菌种的鉴定结果；
在收集到的临床菌株质谱数据中，经过挑选的40株脓肿亚种和20株马赛亚种的图谱数据分别按照亚种分组并输入RUO数据库中；在数据库原有的微生物分类树中的脓肿分枝杆菌下新建了2个亚种的文件夹，并分别将导入的质谱数据加入新建的文件夹中；
随后，分别在2个亚种间，挑选出40个100％出现在亚种图谱数据之内的峰值信号， 以此为基础创建了2个亚种的超级图谱，所有新导入的图谱数据和新构建的超级图谱都被激活以用于随后的鉴定工作；
步骤5：准确性的确认
更新后的数据库，包括了新导入的质谱图数据组和2个新创建的超级图谱，准确性的评估由余下的240株临床菌株的盲测完成；此300株临床菌株样本，包括已导入数据库的60株和240株盲测菌株，都通过WGS(全基因组测序)鉴定到亚种层面。
本发明通过分析明确脓肿分枝杆菌亚种；通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测亚种信息，建立RUO数据库和构建出的超级图谱，并通过菌株盲测检验其敏感性和特异性，制定用于亚种层面实验室鉴定的操作流程及诊断标准，并加入微生物标准体外诊断流程的工作链，提高了各微生物实验室对脓肿分枝杆菌亚型鉴定的效率。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、技术特征、发明目的与技术效果易于明白了解，下面进一步阐述本发明。
建立脓肿分枝杆菌RUO数据库和构建亚型的超级图谱的方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤1：菌株收集和DNA抽提
1.1菌株收集
收集脓肿分枝杆菌菌株300株，菌株由痰标本和肺泡灌洗液中分离并收集。
收集的临床菌株均以MGIT960培养基和对硝基甲苯酸(PNB)试验筛选为非结核分枝杆菌，所有样本均通过rpoB基因测序分析进一步坚定为脓肿分枝杆菌复合群。
从患者处获得的检测样本在经过4％NaOH简化处理后，被接种到斜面罗氏培养基(L-J medium)上，生长出的菌落在显微镜下确认为抗酸杆菌。
接下来，筛选出的阳性菌落转接种于改良罗氏培养基上，并在37℃条件下培养3至7天，用于随后的DNA抽提分析和MALDI-TOF MS鉴定检测。
1.2DNA抽提
将10微升生长在罗氏培养基(L-J培养基)上的菌环转移到含有1毫升TE(10mMTris10,1mMEDTA[pH 8.0])和250微升0.5mm玻璃念珠的离心管中。
将离心管置于漩涡振荡机上振荡10分钟使细菌充分悬浮。
吸取400微升的细菌悬液至新的离心管中，加入溶菌酶至终浓度1mg/ml，37°过夜。
加入70微升10％十二烷基硫酸钠和10微升蛋白分解酶K(10mg/ml)，65°孵育20分钟。加入100微升,十六烷基三甲基溴化铵(10％CTAB)和氯化钠(0.7M)的混合物，然后迅速加入100μ微升氯化钠(0.5M)。
吹打悬液至牛奶状，然后65°孵育10分钟。加入750微升氯仿-异戊醇(24:1)的混合液，漩涡振荡，室温13000转离心5分钟。
吸取上清至新的离心管中，加入0.6倍体积的异戊醇。-20°孵育20分钟，然后13000转离心15分钟。弃上清，用70％乙醇洗涤，13000转离心5分钟。
用200微升TE(10mMTris 10,1mMEDTA[pH 8.0])溶解沉淀。使用微量分光光度计(NanoDrop？2000/2000c Spectrophotometers(Thermo Fisher Scientific.,Delaware,USA))对DNA进行定量。OD260/280值在1.8～2.0区间，浓度>6ug的DNA用来扩增(350to450bp)使用。
步骤2：基因文库制备和illumina HiSeq测序
至少3μgDNA用来Illumina双末端测序的文库制备。根据Illumina标准的基因DNA文库制备流程，400bp长度的DNA片段用来双末端测序。
利用高性能样品处理系统将DNA剪切成需要的DNA小片段，用T4DNA聚合酶 将DNA链突出末端平滑化。然后对平滑化的DNA片段的3’末端添加一个“A”，两端加接头。DNA片段可以通过凝胶电泳提纯，并且通过PCR扩增以达到上样量。最后，对定量的Illumina双末端文库进行Illumina Hiseq测序(150*2)。
步骤3：基因组建立与系统进化树构建
利用相关软件计算实验菌株与标准菌株之间的基因差异。菌种的系统生成树则应用非加权组平均法(UPGMA)构建而成。通用标准株序列ATCC19977、CIP18297和CIP108541作为脓肿分枝杆菌亚型的参照序列，而H37Rv则作为其他菌种的参照序列。
步骤4：基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)
4.1样本准备
首先制备样本，吸取1微升含分枝杆菌的罗氏培养基(L-J培养基)至含有800微升70％乙醇和250微升玻璃念珠的微量离心管中。漩涡振荡15分钟，然后室温孵育10分钟，漩涡振荡10s。将混悬液转移至新的离心管中，13000转离心5分钟。移除上清，干燥10分钟，用10微升70％甲酸溶解沉淀，室温孵育2到5分钟。加入10微升乙腈，10000转离心3分钟。吸取1微升上清液至目标板上，充分干燥，并用1微升CHCA基质液覆盖。
4.2采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)对菌株的检测对菌株的检测
使用Vitek MS Plus system(bioMérieux SA,Marcy l’Etoile,France)系统进行检测。Vitek MS系统应用50Hz线性正离子模式的激光收集2000至20000m/z的图谱数据。每一块样本板在进行检测之前，都提前使用大肠杆菌的标准株ACTT8739进行仪器参数校准和器械调整。在收集到质谱图信号后，数据即由Vitek MS收集站传输至SARAMIS分析系统，数据由此以峰值信号的形式展现出来。收集到的质谱图数据与SARAMIS 4.12research use only(RUO)数据库进行比对后，生成菌种的鉴定结果。
4.3质谱数据库的更新
质谱图的分析应用research-use-only(RUO)Saramis Knowledge Base(bioMérieuxSA) database V.4.12数据库完成。在收集到的临床菌株质谱数据中，经过挑选的40株脓肿亚种和20株马赛亚种的图谱数据分别按照亚种分组并输入RUO数据库中。我们在数据库原有的微生物分类树中的脓肿分枝杆菌下新建了2个亚种的文件夹，并分别将导入的质谱数据加入新建的文件夹中。随后，我们分别在2个亚种间，挑选出40个100％出现在亚种图谱数据之内的峰值信号，以此为基础创建了2个亚种的超级图谱(Superspectrum)。所有新导入的图谱数据和新构建的超级图谱都被激活以用于随后的鉴定工作。
步骤5：准确性确认
更新后的数据库，包括了新导入的质谱图数据组和2个新创建的超级图谱，准确性的评估由余下的240株临床菌株的盲测完成。此300株临床菌株样本，包括已导入数据库的60株和240株盲测菌株，都通过WGS鉴定到亚种层面。
本发明通过分析明确脓肿分枝杆菌亚种；通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测亚种信息，建立RUO数据库和构建出的超级图谱，并通过菌株盲测检验其敏感性和特异性，制定用于亚种层面实验室鉴定的操作流程及诊断标准，并加入微生物标准体外诊断流程的工作链，提高了各微生物实验室对脓肿分枝杆菌亚型鉴定的效率。
综上所述仅为本发明较佳的实施例，并非用来限定本发明的实施范围。即凡依本发明申请专利范围的内容所作的等效变化及修饰，皆应属于本发明的技术范畴。