一种微藻类生长曲线的测定方法及应用与流程

本发明属于微藻生物领域，涉及一种微藻类生长曲线的测定方法，具体涉及一种利用微量热法测定微藻类生长曲线的方法及应用。

背景技术：

一切生命过程都伴随着热效应。微量热法可对这些热效应进行精确的跟踪，并表征其过程，而为解决现实问题的需要而发展起来的自动量热技术则主要应用于测量生物化学反应所产生的热效应。目前，微量热法已广泛应用于药理、生物化学、细胞学等研究领域，但对于水生微藻类生长曲线热效应的研究却鲜有应用。目前国内外所使用的所有自动量热计或自动量热装置，如TAMⅢ，C80 calorimeter等，均为封闭装置，其内部均不带有光源，装置内部的工作过程是在完全黑暗的条件下进行的，并不能满足活的微生物在自然环境中生存所需要的必要的光源要求，因此，不能检测出微藻类在自然状态下的原始、动态、准确的数据，如专利号102232184B，名称为自动等温滴定微量热(ITC)系统，其详细介绍了微量热系统的构造和使用方法，在目前的技术条件下已属比较先进测量微量热的装置，但因其内部未安装光源，不能为微藻类的正常代谢提供必要光源，更无法实现对活体藻类的实时监测和其自然状态下生长曲线的制作；又如专利号201610403227.X，名称为一种用于测定微藻类生长曲线的自动量热装置，其详细介绍了一种实时测定微藻类生长曲线的量热装置，但因其温度传感器的灵敏度有限，以及不能提供一个稳定的恒温环境，无法保证监测数据的真实性和有效性。

微藻(micro-algae)是一种能有效利用光能和二氧化碳的水生低等植物，其种类繁多、分布广泛，具有生物量大、生长周期短、易于培养及脂质含量高等特点，被国际认为是一种最有潜力替代石油的生物资源，其规模化培养是解决当前能源短缺和环境污染问题的有效手段。因此快速检测微藻生长情况，对及时了解微藻生态位，及批量培养是十分必要的。

技术实现要素：

针对现有的技术存在的不足，本发明提供了一种微藻类生长曲线的测定方法，该方法利用一个光自动等温微量热装置，确定了一种程序简单、检测快速、精度高的微藻类生长曲线的测定方法。光自动等温微量热装置能够在满足提供微藻类所需的自然生长条件下，实时、准确、动态地监测并记录微藻类正常生长过程中所产生的热效应和生长曲线，对样品本身不造成任何破坏，最大程度地呈现出微藻类在自然状态下所具有的生理状态和生长曲线，由于其样品池置于高精度恒温槽中，大大提高了测定微藻类生长曲线热效应的精确度，保证了数据的真实性和准确性。

为实现上述目的，具体技术方案为，一种微藻类生长曲线的测定方法，包括如下步骤：

步骤一，测量添加培养液的微藻溶液所释放的热量Q_(C)；

1)向微藻溶液中加入碳源，该碳源为固体CO₂片剂，震荡摇匀，得到待测微藻溶液；

2)向光自动等温微量热装置内的带有光源的自动量热组件中加入一定量的待测微藻溶液，测得添加培养液的微藻溶液所释放的热量Q_(C)；

步骤二，测量空白对照组所释放的热量Q_(E)(1)；

向带有光源的自动量热组件中，加入与步骤一中待测微藻溶液相同剂量的蒸馏水作为空白对照组，测得空白对照组所释放的热量Q_(E)(1)；

步骤三，计算微藻样品生长过程中所释放的代谢热Q_(algae)；

将测得添加培养液的微藻溶液所释放的热量Q_(C)减去空白对照组所释放的热量Q_(E)(1)后，得到待测微藻样品生长过程中所释放的代谢热Q_(algae)，根据代谢热值绘制曲线即为微藻生长的热曲线。

上述步骤一中向微藻溶液中加入碳源和氮源，其中氮源为NaNO₃溶液，NaNO₃溶液浓度为1mol/L。加入氮源为微藻生长提供充足的营养，并且所测得的微量热曲线区分度更加明显，有利于判别哪一浓度的碳源对微藻生长更有利。

上述步骤一中带有光源的自动量热组件包括安瓿瓶和LED电池灯。

上述的LED电池灯的波长范围为500-700nm，色温为3000-3300k，更加利于微藻进行光合作用，有利于微藻的生长。

上述步骤一中微藻溶液的微藻处于对数生长期。所用的微藻预先培养在光照培养箱内，待生长到对数生长期时，进行微量热测量，所得微量热曲线最高，测量效果最好。

上述的光自动等温微量热装置内温度恒定为28℃。该温度是藻类最适生长温度，在这温度条件下，微藻生长最快，利于快速检测。

一种微藻类生长曲线的测定方法的应用，基于上述测量方法同时等温测量添加不同剂量碳源的微藻样品生长过程中所释放的代谢热，绘制出与之对应的微藻生长的热曲线，比较得出适合微藻生长的碳源浓度。

本发明的有益效果：解决了现有技术中，封闭式测量，内部完全黑暗，导致无法检测微藻类等光合微生物生长情况的问题。本发明应用改进功能的微量热计，既保证了测量的准确性又扩大了微量热计的应用范围。与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1)本发明为研究微藻类的生长情况提供了一种更为便捷、快速、准确的测定方法。微量热法研究微生物还可扩展到其它环境体系，如土壤、废弃物等，应用范围广。

2)本发明在原有微量热计的基础上进行了改进，在监测样品的安瓿瓶中加入LED光源，提供微藻类生长所需的条件，保证了待测微藻类样品可以在测量过程中正常生长，保证了数据的真实性和可靠性，既克服了对活体样品的长时间监测的难题，又保存了待测样品的完整性。

3)本发明将微量热技术应用到微藻类生长曲线的监测上，应用微量热技术来监测微藻类的生长情况，为了解微藻类生态位信息提供依据。

然后分别用微量热仪监测加入不同碳源剂量的微藻类样品的微量热变化曲线，不同生长阶段的微藻样品的生长速率不同，生物量不同，产生的热量也不同，不同产热阶段分别对应微藻生长的不同时期。

附图说明

图1为微量热仪工作原理图。

图2为不锈钢安瓿瓶的剖面图。

图3为海洋中肋骨条形藻的微量热变化曲线图。

图4为淡水小球藻的微量热变化曲线图。

图中：1安瓿瓶瓶盖；2LED纽扣电池灯；3不锈钢瓶体；4纽扣电池；5微量热计外壳；6隔热层；7量热计通道；8安瓿瓶。

具体实施方式

以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。

实施例1

一种微藻类生长曲线的测定方法包括如下步骤：

第一步，预处理

(1)微量热仪安瓿瓶改进如图1和图2：将纽扣电池与LED灯组装，然后使用热熔固体胶将LED纽扣电池灯固定在安瓿瓶的瓶盖顶端，LED电池灯的高度约占安瓿瓶瓶高度的1/4。

(2)供测试微藻样品的培养：以淡水小球藻和海洋中肋骨条形藻为待测藻种，分别以BG11培养基和f/2培养基来培养，配置微藻培养基100ml置于250ml锥形瓶中，于120℃条件下灭菌20分钟，待凉至室温后，接种5ml微藻原液于培养基中，生长期内培养在自制的光照培养箱内，光暗比为12:12，培养温度为28℃，待微藻处于对数生长期时进行测定。

第二步，分别取2ml微藻培养液，加入NaNO₃ 1mol/L,CO₂片剂分别为0g/L、7.48g/L、14.96g/L、29.92g/L、74.8g/L，加入到微量热仪的安瓿瓶中，震荡摇匀后，拧紧瓶盖，放入微量热仪内置的量热室内进行培养，保持恒温28℃，培养48小时。温度稳定后，开始监测。

每组微藻溶液至少做3组平行试验。

第三步，利用微量热仪监测出的样品的微量热变化曲线，是一条以绝对时间为横坐标、以热流为纵坐标的曲线，如图3、图4所示。测得添加培养液的微藻溶液所释放的热量Q_(C)和空白对照组所释放的热量Q_(E)(1)；根据公式(1)计算微藻样品生长过程中所释放的代谢热Q_(algae)；

Q_(algae)＝Q_(C)-Q_(E)(1) (1)

同时等温测量添加不同剂量碳源的微藻样品生长过程中所释放的代谢热，各参数结果如表1和表2所示，其中：

Q_t--培养过程所产生的总热量，单位J；

P_max--培养过程中的最大热功率，单位μW；

t_max--培养过程中最大热功率出现的相对时间，单位h；

I_(100％)--培养过程中，不同剂量碳源对微藻生长的一直率；

N₀--所培养微藻的初始数量，单位个；

J_Q/N--培养过程中每个微藻细胞所产生的热量的均值，单位J。

表1不同浓度CO₂条件下，淡水小球藻的热力学参数

表2不同浓度CO₂条件下，海洋中肋骨条形藻的热力学参数

从表1和表2中可以看出，在加入不同剂量的碳源后，虽然初始的微藻数目一致，但是不同浓度的碳源分别对微藻的生长产生了促进或抑制作用，其中微藻的生长状况越好，其生物量越多，产生的热量Q_t和P_max值就越高，其热力学参数可作为微藻生长状况的指示参数，为微藻的批量培养提供依据。

综上，利用微量热法可以测定微藻类的生长曲线，本发明为研究微藻类的代谢生长提供了一种更为快捷、准确的检测方法，能够避开繁琐的实验过程。