专利名称：用于测定待测物中所含的微生物的活菌数的悬浮用稀释液和活菌数测定方法
技术领域：
本发明涉及一种在测定 待测物中所含的微生物的活菌数时、为了将该待测物制成 悬浮液而使用的悬浮用稀释液和使用上述悬浮用稀释液的活菌数测定方法。本申请基于2008年6月24日在日本申请的日本特愿2008-164226号要求优先权， 将其内容援引于此。
背景技术：
双歧杆菌作为有用的肠内细菌的一种而众所周知，有很多关于其生理学意义的报 告，在肠内产生乳酸、醋酸等有机酸并抑制有害菌增殖的作用、维生素的产生、免疫力的激 活等已被弄清楚(非专利文献1)。因此，为了摄取双歧杆菌从而维持健康，正在开发酸奶、 糕点类、饮料类、健康食品类等含有双歧杆菌的各种食品(非专利文献2)。另外，在婴幼儿 时期，母乳喂养的婴幼儿双歧杆菌占优势，因此在日本以外，也正在开发含有双歧杆菌的婴 幼儿奶粉等。像这样，为了显示该食品中含有多少菌数，对含有双歧杆菌的各种食品进行活菌 数测定。作为以往微生物的活菌数测定中使用的方法，通常使用以下方法制备含有待 测物的悬浮液，然后用稀释液(生理盐水等)逐级稀释上述悬浮液，将其用倾注法(pour method)、平板涂布培养法等培养法进行培养，对培养基中形成的菌落数计数。待测物为粉 末状(例如微生物的菌末、或奶粉等粉末制品)时，向该待测物中添加稀释液并搅拌从而制 备悬浮液。所述以往方法直接对双歧杆菌末进行活菌数测定时不存在问题，但当测定食品中 配合的双歧杆菌的活菌数时，得到的测定值偏差较大，并且，存在上述测定值为低于实际上 所含的活菌数(实际菌数)的值的问题。所述问题在测定粉末制品、尤其是奶粉中配合的双 歧杆菌的活菌数时较为显著。例如用以往方法测定奶粉中所含的双歧杆菌的活菌数时，得 到的测定值为大幅度低于实际上所含的活菌数(实际菌数)的值(例如实际菌数的60 70%左右)。像这样，由于无法准确地测定各种食品中配合的双歧杆菌的活菌数，因此期待分 析机构开发能够得到准确的活菌数测定值的测定方法。从上述情况来看，虽然没有关于各种食品中双歧杆菌的活菌数测定的法定方法， 但非专利文献3中作为发酵乳/乳酸菌饮料中双歧杆菌的活菌数测定方法记载了社团法人 全国发酵乳乳酸菌饮料协会推荐的方法。上述方法中，关于稀释液，推荐使用食品卫生检查 指南中记载的厌氧性待测物稀释液(以下称为稀释液(A)。)。另外，上述非专利文献3中 还记载了可以利用生理盐水代替稀释液(A)。稀释液(A)是由KH2PO4 4. 5g,Na2HPO4 6. 0g、L_半胱氨酸HCL ·Η20 0. 5g,Tween80 0. 5g、琼脂1. 0g、纯化水1000mL组成的液体，在检测肠道菌群中存在的厌氧性菌时被广泛使用。现有技术文献非专利文献非专利文献1 光冈知足编著，“Bifidus Research”，第1章，第9 14页，Japan Bifidus Foundation (1994 年)非专利文献2 光R知足编著，“Bifidus Research”，第7章，第267页和第282页，Japan Bifidus Foundation (1994 年)非专禾Ij文献 3 ,Enumeration method for bifidobacterium within fermented milk and lactobacillus beverages，，，第 6 页，the Bifidobacterium Testing Methods Review Committee of the Japanese Association of Fermented Milks and Fermented Milk Drinks (2000 年)
发明内容
发明要解决的问题然而，粉末制品的情况下，即使使用如上所述的稀释液(A)或生理盐水作为稀释 液，奶粉等粉末制品中配合的双歧杆菌的活菌数的测定值也与上述一样为大幅度低于实际 菌数的值。活菌数的检测值偏低，从而，例如向婴幼儿奶粉等粉末制品中配合双歧杆菌时，需 要向该粉末制品中加入标准值的数倍以上的双歧杆菌等，从经济方面来看也存在问题。本发明是为了解决上述课题而进行的，其目的在于提供一种悬浮用稀释液和活菌 数测定方法，其在含有微生物的待测物、尤其是奶粉等粉末制品中所含的微生物的活菌数 测定中能够得到比以往更准确的测定值。用于解决问题的方案本发明人进行了深入研究，结果发现，通过使将含有微生物的待测物制成悬浮液 时使用的稀释液(悬浮用稀释液)中含有规定量以上的聚山梨酯类，从而能够解决上述课 题，从而完成了本发明。解决上述课题的本发明具有以下的方式。[1] 一种悬浮用稀释液，其特征在于，其是对待测物中所含的微生物的活菌数进行 测定时、为了将该待测物制成悬浮液而使用的悬浮用稀释液，以0. 5%以上的浓度含有聚山 梨酯类。[2]根据[1]所述的悬浮用稀释液，其中，上述聚山梨酯类的浓度为0.5% 30%。[3]根据[1]或[2]所述的悬浮用稀释液，其中，上述聚山梨酯类为选自由 Tween40、Tween60禾口 Tween80所组成的组中的至少1种。[4]根据[1] [3]中任一项所述的悬浮用稀释液，其中，上述微生物为双歧杆菌。[5] 一种活菌数测定方法，其特征在于，其是待测物中所含的微生物的活菌数测定 方法，包括以下工序用[1] [4]中任一项所述的悬浮用稀释液将上述待测物制成悬浮液 的工序；和测定上述悬浮液中含有的微生物的活菌数的工序。[6]根据[5]所述的活菌数测定方法，其中，上述微生物为双歧杆菌。[7]根据[5]或[6]所述的活菌数测定方法，其中，上述待测物为粉末状。
[8]根据[7]所述的活菌数测定方法，其中，上述待测物为婴幼儿奶粉。本说明书和权利要求书中，浓度(％ )为w/v(质量/体积)的值。将双歧杆菌粉末化而得到的物质称为“双歧杆菌末”，将双歧杆菌以外的乳酸菌类 称为“乳酸菌”，将乳酸菌粉末化而得到的物质称为“乳酸菌末”。另外，有时将微生物的细 胞或菌体统一记为“菌体”。在此，“双歧杆菌”表示属于双歧杆菌属(Bifidobacterium)的微生物。“乳酸菌 类”表示通过发酵产生乳酸的厌氧性细菌。发明的效果根据本发明，能够提供一种悬浮用稀释液和活菌数测定方法，其在含有微生物的 待测物、尤其是奶粉等粉末制品中所含的微生物的活菌数测定中能够得到比以往更准确的 测定值。
具体实施例方式<悬浮用稀释液>本发明的悬浮用稀释液以0. 5%以上的浓度含有聚山梨酯类。聚山梨酯类为山梨糖醇酐脂肪酸酯与环氧乙烷缩合而得到的物质(聚氧乙烯山 梨糖醇酐脂肪酸酯)。与山梨糖醇酐脂肪酸酯缩合的环氧乙烷的数量通常为约20分子。山梨糖醇酐脂肪酸酯由山梨糖醇和脂肪酸反应而得到，作为脂肪酸，通常R-COOH 中的R为碳原子数11 17的饱和或不饱和烃基。作为脂肪酸的具体例子，可列举出月桂 酸、硬脂酸、棕榈酸、油酸等。作为聚山梨酯类，具体而言，可列举出吐温(以下，记为“Tween”。)20、Tween40, Tween60> Tween65> Tween80 等。Tween20也被称为聚山梨酯20、聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯 (Polyoxyethylene Sorbitan Monolaurate)0Tween40也被称为聚山梨酯40、聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕榈酸酯 (Polyoxyethylene Sorbitan Monopalmitate)0Tween60也被称为聚山梨酯60、聚氧乙烯山梨糖醇酐单硬脂酸酯 (Polyoxyethylene Sorbitan Monostearate)0Tween65也被称为聚山梨酯65、聚氧乙烯山梨糖醇酐三硬脂酸酯 (Polyoxyethylene Sorbitan Tristearate)0TweenSO也被称为聚山梨酯80、聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯(Polyoxyethylene Sorbitan Monooleate)。这些聚山梨酯类均可使用市售品。关于本发明中使用的聚山梨酯类，从本发明的效果优异方面来看，优选为选自由 Tween40、Tween60禾口 Tween80所组成的组中的至少1种。悬浮用稀释液中，聚山梨酯类的浓度为0.5%以上，优选为以上。聚山梨酯类 的浓度不足0.5%时，无法得到本发明的效果。另外，聚山梨酯类的浓度超过30 %时，溶解性降低，因此悬浮用稀释液中的聚山梨 酯类的浓度优选为0. 5 30%。若考虑经济性，则上述浓度更优选为2%以下。
在不损害本发明的效果的范围内，本发明的悬浮用稀释液还可以任意地含有除聚 山梨酯类以外的其他成分。上述其他成分没有特别限定，可以添加通常添加到稀释液中的成分。作为所述成 分，具体而言，可列举出氯化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、L-半胱氨酸盐酸盐一水合物、琼 月旨、大豆肽、L-抗坏血酸钠、蛋白胨、酵母膏、林格氏液(Ringer' s solution)等。本发明的悬浮用稀释液可使聚山梨酯类和任意的成分与水混合从而调制。上述本发明的悬浮用稀释液可在对待测物中所含的微生物的活菌数进行测定时、 用于将该待测物制成悬浮液。关于待测物和活菌数的测定方法，详细情况在以下的本发明 的活菌数测定方法中进行说明。<活菌数测定方法>本发明的活菌数测定方法包括以下工序使用上述本发明的悬浮用稀释液将含有 微生物的待测物制成悬浮液的工序；和测定上述悬浮液中含有的微生物的活菌数的工序。作为微生物，可列举出例如双歧杆菌、乳酸菌等。这些中优选双歧杆菌。双歧杆菌没有特别限定，但可列举出例如长双歧杆菌(Bifidobacterium Iongum subsp. longum)、长双歧杆菌婴」匕亚禾中(Bifidobacterium longum subsp. infantis)、青 春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve) > 两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、动物双歧杆菌乳酸亚种(Bifidobacterium animal is subsp. lactis)等。这些均为市售或能够容易地从保藏机构获得的菌株。另外， 粉末制品、健康食品也是能够容易买到的产品。作为乳酸菌，可列举出乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、肠 球菌属(Enterococcus)、链球菌属(Streptococcus)等。作为利用本发明测定活菌数的待测物，只要含有微生物即可，没有特别限定，但如 果考虑到制备悬浮液的容易度等，优选为粉末状。作为粉末状的待测物，具体而言，可列举出配合有双歧杆菌、乳酸菌等微生物的菌 体的粉末制品。作为粉末制品，可列举出例如婴幼儿奶粉、孕妇奶粉等奶粉。此外，还可以 是对配合有微生物菌体的固态的待测物进行粉碎处理而制成的粉末状物质。本发明中，作为待测物，优选婴幼儿奶粉、尤其是含有双歧杆菌的婴幼儿奶粉。关于上述待测物的悬浮液，为了悬浮而使用本发明的悬浮用稀释液，除此以外，可 利用以往用于制备悬浮液的公知的方法进行制备，例如待测物为粉末状时，通过将上述待 测物和本发明的悬浮用稀释液混合、搅拌从而制备。悬浮液中含有的微生物的活菌数的测定可通过利用了在琼脂培养基上进行培养 的培养法(固体培养法)的方法来实施。关于上述方法，具体而言，可通过以下方式来实施逐级稀释悬浮液，在琼脂培养 基上培养各稀释物，对形成的菌落数计数。此时形成的菌落数相当于该琼脂培养基中培养 的稀释物中含有的微生物的活菌数。因此，由菌落数的值和稀释倍率可求出悬浮液中含有 的微生物的活菌数。由这样求得的悬浮液中的活菌数和该悬浮液中含有的待测物的量可求 出该待测物中所含的微生物的活菌数(/g)。上述方法中，逐级稀释悬浮液时可使用稀释液(二次稀释液)。本发明中，作为制备悬浮液时使用的稀释液，只要使用本发明的悬浮用稀释液即可，关于二次稀释液的种类没有特别限定。作为二次稀释液，可利用生理盐水、上述的稀释液(A)(食品卫生检查指南 中记载的厌氧性待测物稀释液)等公知的稀释液。作为培养法，具体而言，可列举出倾注法、平板涂布培养法等。倾注法是将适当稀 释后的悬浮液与加热熔化了的琼脂培养基混和、冷却固化而进行培养的方法。平板涂布培 养法是将适当稀释后的悬浮液涂抹在琼脂培养基上而进行培养的方法。关于培养中 使用的琼脂培养基的种类、培养条件(培养温度、培养时间等)，可根 据测定对象的微生物而利用公知的培养条件，例如作为琼脂培养基，只要测定对象的微生 物能够繁殖即可。例如作为能够繁殖双歧杆菌的培养基，可列举出强化梭菌琼脂培养基、 TOS(Transgalactosylated Oligosaccharides，转半乳寡糖)丙酸琼脂培养基等。另外，双 歧杆菌的情况下，菌落数的计数主要在37°C下进行了 72小时厌氧培养之后进行。实施例接着，示出试验例和实施例对本发明进行更加详细的说明，但本发明不限定于以 下的实施例。<试验例1>该试验将双歧杆菌末在奶粉中倍散后测定活菌数，是为了观察由倍散剂所导致的 菌数降低而实施的。1)试验试样的制备作为双歧杆菌末(原末)，准备了 BB536菌末(森永乳业公司制，活菌8. IXlO10/ g含有品)。在上述原末中以1 1000 (w/w)的比例混合森永Follow Up Milk Ghil-Mil (森 永乳业公司制)，制备试样(1000倍散)，作为倍散试样。以下，将原末的活菌数(实际菌数)除以1000而得到的值用作倍散试样的实际菌数。[表 1]
一试验试样菌末倍散比例实际菌数
—原末 —BB536 菌末一—
倍散试样 BB536 菌末 /^^t^、 B.lxl07/g ___C Ghil-Mil)__2)悬浮用稀释液的制备向以下表2所示各成分中分别添加纯水使总量达到IOOOml并进行混合，从而制备 生理盐水、稀释液(A)和含TweenSO的液体作为悬浮用稀释液。另外，各悬浮用稀释液 经高压灭菌器进行121°C、15分钟的灭菌。[表 2]
权利要求
1.一种悬浮用稀释液，其特征在于，其是对待测物中所含的微生物的活菌数进行测定 时、为了将该待测物制成悬浮液而使用的悬浮用稀释液，以0. 5%以上的浓度含有聚山梨酯类。
2.根据权利要求1所述的悬浮用稀释液，其中，上述聚山梨酯类的浓度为0.5% 30%。
3.根据权利要求1或2所述的悬浮用稀释液，其中，上述聚山梨酯类为选自由 Tween40、Tween60禾口 Tween80所组成的组中的至少1种。
4.根据权利要求1 3中任一项所述的悬浮用稀释液，其中，上述微生物为双歧杆菌。
5.一种活菌数测定方法，其特征在于，其是待测物中所含的微生物的活菌数测定方法， 包括以下工序用权利要求1 4中任一项所述的悬浮用稀释液将上述待测物制成悬浮液 的工序；和测定上述悬浮液中含有的微生物的活菌数的工序。
6.根据权利要求5所述的活菌数测定方法，其中，上述微生物为双歧杆菌。
7.根据权利要求5或6所述的活菌数测定方法，其中，上述待测物为粉末状。
8.根据权利要求7所述的活菌数测定方法，其中，上述待测物为婴幼儿奶粉。
全文摘要
本发明提供一种悬浮用稀释液和活菌数测定方法，其在含有微生物的待测物、尤其是奶粉等粉末制品所含有的微生物的活菌数测定中能够得到比以往更准确的测定值。一种悬浮用稀释液，其特征在于，其是对待测物中所含的微生物的活菌数进行测定时、为了将该待测物制成悬浮液而使用的悬浮用稀释液，以0.5％以上的浓度含有聚山梨酯类。一种活菌数测定方法，其特征在于，其是待测物中所含的微生物的活菌数测定方法，包括以下工序用以0.5％以上的浓度含有聚山梨酯类的悬浮用稀释液将上述待测物制成悬浮液的工序；和测定上述悬浮液中含有的微生物的活菌数的工序。
文档编号C12Q1/02GK102131937SQ20098013294
公开日2011年7月20日 申请日期2009年6月11日 优先权日2008年6月24日
发明者武藤正达 申请人:森永乳业株式会社