多孔生物测定衬底以及用于生产这种衬底的方法和设备的制作方法

专利名称：多孔生物测定衬底以及用于生产这种衬底的方法和设备的制作方法
技术领域：
本发明涉及针对某些分析物来分析生物样本流体的领域，并且尤 其涉及适于在生物样本流体中检测至少一个分析物的多孔生物测定 衬底。具体来说，本发明允许对生物样本流体进行准确且高效的分析。 本发明进一步涉及一种用于通过将多种物质沉积到该衬底上来生产 生物测定衬底的方法，并且涉及一种可通过该方法获得的生物测定衬 底。本发明还涉及一种用于针对样本流体中存在的一个或多个分析物 分子来分析样本流体的方法。所述分析物可以包括能够结合到衬底上
的捕获探针的任何化合物(compound)，包括目标生物化合物、蛋白 质、DNA等。该方法可以用于分子诊断试验，例如用于测量传染病的 病原体和抗病基因的存在。
背景技术：
分析物生物流体(如人类的血液或组织样本)中的某种细菌、病毒和 /或真菌的存在和/或浓度。捕获探针具有对预定指示因子的选择性结 合能力，所述指示因子例如为蛋白质、属于特定细菌、病毒或真菌的 DNA或RM序列。在微阵列技术中， 一组特定捕获探针例如通过印刷 固定在生物传感器固体衬底的特定位置处，其中这组捕获探针中的每 一个被选择来特别地与一个特定的目标生物化合物相互作用(例如在 DNA微阵列的情况下的杂交)。合适的探针可以包括含有特定指示因 子(indicative factor )的生物5危体，例々口特定DNA序歹寸和/或抗体 的溶液。在衬底已经装配了这样的捕获探针之后，强制分析物流体流 过(flow through)该衬底，或强制析物流体在该衬底上流过(flow over)。为了能够在分析物流体中使得指示因子的存在可视化，分析 物流体的分子可以例如具有焚光和/或磁性标记。在ELISA(酶联免 疫吸附法)的情况下，将酶而不是放射性标记附着到第二抗体。随后 通过该酶的催化作用形成强烈的有色或荧光化合物。分析物流体的(标记)分子附着到衬底中的那些对所考虑的分子具有结合能力的捕 获探针上。至少在使用荧光标记时，这使得在特定因子附着到的斑点 上产生可检测的荧光。所捕获的分子典型地通过利用光源的照明以及
例如在CCD相机的辅助下记录的荧光图案来读取。所述记录的图案是 细菌或一组细菌存在的特征。通过向捕获探针提供对于不同因子的不 同特异性，所述阵列可以用于同时对多种不同的因子进行测定。使用 这样的阵列使得能够在单次运行中实现用于大量因子的分析物流体 的高通量篩选。
为了确保高通量筛选的良好质量和效率，所希望的是将分析物流 体的尽可能多的标记分子结合到衬底的那些对所考虑的分子具有结 合能力的探针上。当分子的结合(或在DNA链的情况下的杂交)不够 时，可能漏掉某些指示因子并且/或者荧光图案不可以被清楚地区分 并且/或者在某种其它意义下是有缺陷的。虽然已知的生物测定衬底 以及用于生成这种生物测定衬底的方法产生了令人满意的结合效率，
种生物测定衬底的方法。而且，具有增加的分析速度的快速筛选是所 希望的，特别是在临床诊断领域中更是如此。

发明内容
本发明的目的是提供一种具有改进的结合效率的多孔生物测定 衬底，其包括用于PCR和/或电泳的衬底。本发明的另一个目的是提
法。本发明的另」个目的是提供^"种用于生产这种衬底的设备，其能 够将多种物质沉积到所述衬底上。本发明的另一个目的是提供一种用 于检查分析物流体(如人类的血液或組织样本)中的某些细菌、病毒 和/或真菌的存在的方法，该方法具有改进的分析效率。
可以通过包括一个或多个捕获探针的多孔生物测定衬底来实现 上述目的，该捕获探针的每一个能够特定地结合至少一个目标分析 物，其中在尺寸大于衬底孔径分布05。的孔中的捕获探针的平均浓度 至少等于尺寸小于05。的孔中的捕获探针的平均浓度。广义地说，通 过提供其中平均来说较大孔包括较高浓度的捕获探针的衬底，与已知 的生物测定衬底相比，获得了结合效率增加的衬底。本发明的另一个优点在于，对于流过和流过其上的配置二者，都可以更快地执行分析。 当施加了外部压力时，尤其如此。
在根据本发明的多孔生物测定衬底的优选实施例中，尺寸大于
05。的孔中的捕获探针的平均浓度至少是尺寸小于05。的孔中的捕获探
针的平均浓度的两倍，甚至更优选地至少是尺寸小于0s。的孔中的捕
获探针的平均浓度的5倍，以及最优选地至少是尺寸小于05。的孔中 的捕获探针的平均浓度的10倍。
本发明的优点对于具有宽孔径分布的衬底尤其显著。特别优选的 衬底具有这样的孔径分布使得(09。-01()) > 205Q。更优选的生物测 定衬底具有这样的孔径分布使得(09。-0,。) > 505。。另一个优选的 生物测定衬底具有这样的孔径分布使得(09。-05。) > 205。且(05。-010) > 2010。
根据本发明，还提供一种用于生产这种生物测定衬底的方法。在 该方法中，多个捕获分子溶液例如从喷墨印刷设备的印刷头释放到该 多孔衬底上，并且该衬底具有失活(activating)介质，其具有比捕 获分子溶液的溶剂更低的蒸发率和/或更高的沸点。优选地，在将捕 获探针分子溶液释放到该衬底上之前，向该衬底提供失活的介质。而 且，特别优选的方法还包括另一个步骤处理该衬底使得在将捕获分 子溶液释放到该衬底上之前使部分所述失活介质从衬底蒸发。通过用 带有指示特征(indicated characteristics)的失活介质来处理衬 底，衬底的至少部分孔被(暂时)阻挡。然而，该失活介质将更容易 从较大的孔蒸发。当失活介质的被迫蒸发或自然蒸发发生时，衬底中 的较小的孔将至少部分地保持被阻挡。当将捕获探针溶液施加到或进 入衬底时，所述(被阻挡的)较小的孔将在较小程度上可用于摄入 (uptake)捕获探针溶液，因此捕获探针溶液优选地渗透并附着到较 大孔的表面。因为分析物流体更容易渗透所述多孔衬底中的较大的 孔，这就导致本发明的生物测定衬底的所期望的增长的结合效率。这 个优点在流过配置中特别显著，在流过配置中，流动受到毛细管力的 影响比受到压降的影响更小。
具有比捕获分子溶液的溶剂更低的蒸发率和/或更高的沸点的任 何失活介质在原则上可以用于根据本发明的方法。优选地，所述失活 介质包括具有比捕获分子溶液的溶剂更低的蒸发率和/或更高的沸点的液体。更优选的是，失活液体包括丙烯醇、醚以及从中获得的酯、 和/或其混合物。
根据本发明的方法和测定衬底的额外的优点在于，与迄今已知的 相比，对于相似的吞吐量，它需要更少的要被印刷的捕获探针并且/ 或者需要更少的分析物流体。两个优点都降低了分析的成本。而且， 为了改进检测限制，可能要执行更多的流体混合和杂交的步骤，由此 增加分析时间。然而根据本发明的优选实施例，与本领域公知的方法 相比，显著减少了分析时间。
本发明进一步提供一种设备，并且具体地提供一种用于生产这种
生物测定衬底的喷墨设备。根据本发明的喷墨设备包括用于容纳要 印刷到衬底上的物质的容器，该设备包括至少一个印刷头；以及分别 用于印刷头和衬底的安装装置，其中该设备包括用于向衬底提供具有 比捕获分子溶液的溶剂更低蒸发率的失活介质的装置。下面将更详细 地描述该设备的特别优选的实施例。
本发明还提供一种用于检查分析物流体中的某些细菌、病毒和/ 或真菌的存在的方法，所述分析物流体诸如为人类的血液或组织样 本。在该方法中，强制分析物流体流过根据本发明的衬底或者流过该 衬底之上。由于所述衬底材料是多孔的，所以流过是可能的。目标生 物化合物的结合是样本流体自由和/或被迫流过生物测定衬底(即从 下表面到上表面或反之亦然)和/或通过在衬底上从位置A到位置B 的横向流动的结果。为了增加结合的机会，可以重复流过若干次。本 发明的衬底具有额外的优点对于相似的结合效率，这样的泵吸周期 的数量可以更少。
如这里所使用的且除非另外声明，术语《微阵列测定》表示这样 的测定其中涉嫌(suspect)包括目标生物化合物的样本流体(优 选地为生物流体样本(可选地包括悬浮在其中的较少数量的固体或胶 体颗粒))与生物传感器固体衬底相接触(即，流过其上或流过)， 其中该生物传感器衬底包括跨越其表面的多个离散和孤立的区域，每 一个所述区域都具有一个或多个施加到其上的探针，并且针对探针的 特定地与目标生物化合物结合的能力来选择每一个所述探针。显然， 不是每一种沉积在衬底上的流体都需要成为探针，即具有结合特定分 析物的能力。所述测定还可以包括其他流体，如用于校准目的的流体、网格标识器等等。这种流体可能已经包括标记。
如这里所使用的且除非另外声明，术语《分析物》或《目标生物 化合物》表示被确定作为分析目标或分析点的生物分子化合物。它包
括生物分子化合物，诸如但不限于核酸及其相关化合物(例如DNA、 RNA、寡核苷酸及其相似物、PCR产物、基因组DNA、细菌人工染色体、 质粒等等)、蛋白质及其相关化合物(例如多肽、肽、单克隆抗体或 多克隆抗体、可溶性或结合受体、转录因子等等)、抗原、配体、半 抗原、碳水化合物及其相关化合物(例如，多糖、寡糖等等)、诸如 薄膜片段的细胞片段(cellular fragment)、细胞器、完整细胞、 细菌、病毒、原生生物等等。
如这里使用的且除非另外声明，术语《捕获探针》表示一种生物 制剂，其能够在存在所述目标生物化合物或与之反应时特定地与《目 标生物化合物》或《分析物》相结合，并且用于检测所述目标生物化 合物的存在。探针包括生物分子化合物，诸如但不限于核酸及其相关 化合物(例如DNA、 RNA、寡核苷酸及其相似物、PCR产物、基因组 DNA、细菌人工染色体、质粒等等)、蛋白质及其相关化合物(例如 多肽、单克隆抗体、受体、转录因子等等)、抗原、配体、半抗原、 碳水化合物及其相关化合物(例如，多糖、寡糖等等)、细胞器、完 整细胞等等。探针还可以包括特定物质，如目标化合物与之结合的某 些生物聚合物。
如这里所使用的且除非另外声明，术语《标记》表示生物或化学 的制剂，其具有可通过适当的装置来检测的至少一个物理属性(比如 但不限于放射性(radioactivity)、光学属性、磁性)，从而使得 能够确定其空间位置和/或所述可检测物理属性的强度，所述标记诸 如但不限于发光分子(例如荧光剂、磷光剂、化学发光剂、电学发光 剂、生物学发光剂等等)、有色分子、在反应时产生颜色的分子、酶、 磁珠、放射性同位素、可特定结合的配体、可由声波共振检测的微泡 等等。
参照下面所描述的实施例并结合通过实例示出本发明原理的附 图，本发明的这些和其他方面将变得显然并被阐明。


在附图中
图1示意性示出了根据本发明的可通过将捕获探针印刷到衬底 上而获得的生物试验阵列；
图2示意性示出了根据本发明的具有多孔衬底的生物测定设备； 图3表示根据本发明的多孔衬底的照片；
图4示意性示出了根据本发明的多孔衬底的实施例的开孔孔径 分布。
具体实施例方式
将通过特定实施例并参考某些附图来描述本发明，但是本发明不 限于此，而仅仅受权利要求的限定。权利要求中的任何附图标记不应 被解释为限制其范围。所描述的附图仅仅是示意性的而非限制性的。 在附图中，为了说明性的目的， 一些元件的尺寸被夸大并且不是按比 例绘制。在术语"包括"用于本说明书和权利要求的地方，它不排除 其他元件或步骤。在指示单数名词时使用定冠词或不定冠词如"一"、 "一个"或"这"的地方，除非另外特别地声明，这包括多个该名词。
而且，说明书和权利要求中使用的术语第一、第二、第三等被用 于区分相似的元件，但不一定用于描述先后顺序或时间顺序。应当理 解，如此使用的术语在适当情况下是可交换的，并且这里所描述的本 发明的实施例能够以除这里所描述和示出的顺序之外的顺序来操作。
图1示出通过将多个捕获探针斑点(2)沉积(优选地通过将其 喷墨印刷)在多孔衬底(102)(比如薄膜)上而获得的生物试验阵 列(1)。根据本发明的方法，在印刷捕获斑点(2)之前已经用失活 介质(并且在该特定实例中用乙二醇)处理了村底(102)。在所示 的实例中，试验阵列(1)被128个斑点(2)的图案覆盖，该图案包 括以预定图案印刷的43种不同的生物流体。斑点(2)被编号，并且 每个编号表示唯一的基因序列或包括参考材料。注意到，基因序列在 阵列(1)中的多个相互距离较远的位置上多次重复出现。多孔衬底 (102)被安装在支持结构(4)上。具有支持结构或支架(4)的多 孔衬底(102)被放置在药筒(cartridge) (5)中。图2中示出了 典型的设置。在外壳(10)中，要被分析的样本流体(16)在腔(15 ) 中提供并且在入口 (3)处施加压力。该压力迫使样本流体(16)向下通过多孔固体衬底(102)。如果希望的话，玻璃板(7)允许对固 体衬底(102)的光学分析。提供了用于分析固体衬底(102)关于一 个或多个目标生物混合物的存在的分析装置(25 )。所述分析装置(25 ) 可以包括光源和光学检测路径、透镜、滤波器、数码相机等，以测量 所述光学荧光图案。可以存在其他装置(26)，例如用于分析固体衬 底温度、填充孔容积以及其他想要监测的参数。虚线表示装置U5) 和(26)可以最终组合为单一的设备(例如光学检测装置，如CCD相 机或其他任何种类的光学检测设备，其中相机仅仅是一种可能的装 置。其他可能的装置包括光电检测器或显微镜)。可以规定样本流体
(16)多次循环通过腔(15)和衬底(102)。优选地，衬底(102) 连续地或间歇地但是有规则地被样本流体(16)浸湿。通过强迫分析 物流体通过多孔衬底来分析该分析物流体中的某种细菌、病毒和/或 真菌的存在。样本流体自由和/或被迫流过生物测定衬底的表面(即 从下表面流到上表面或反之亦然)使得分析物流体与捕获探针相接 触，这允许目标生物混合物结合到这些能够与其结合的捕获探针。更 特别地，使得包括具有对于不同细菌的DNA的不同基因序列特征的样 本流体(比如PCR产物)与包括斑点(2)阵列的多孔衬底(102)相 接触。不同的MA类型(基因序列)附着到不同的印刷的捕获探针。 在图l所示的实施例中，不同的斑点是可视化的。编号1到18表示 9个不同的病原体和9个阻力。为了测量的可靠性，相同的生物选择 性捕获材料可以被印刷在薄膜(102)的四个不同象限(11， 12， 13， 14)中。在每一个象限(11， 12， 13， 14)中，相同编号的斑点具有 不同的相邻斑点，从而防止不太强烈的斑点(2)因为过度暴露
(overexposure )于相邻的斑点而不被检测。可以将强度校准斑点(Rl 到RIO)印刷在薄膜(102)上，以及将四个斑点(D)印刷在薄膜的 角落以用于在薄膜(102)上的强度校准分布。也印刷了 PCR控制斑 点(Pl， P2)以通过PCR验证合适的DNA放大。
如图1所示，根据本发明的生物试验阵列优选地包括总共130个 斑点，但也可以包括更多的斑点，例如超过1000个。斑点的典型直 径低于100-300jum，但还可以甚至更低，并且它们;故定位为间距典 型小于400jam的图案中，所述间距优选地小于300 n m。所述斑点优 选地以周期性图案来印刷，例如以正方形、矩形或六边形的结构来印刷。此外，典型地将大量的不同生物流体(优选地为ioo个或更多)
印刷到薄膜上(102)。
根据本发明，提供一种多孔生物测定衬底，其包括一个或多个能 够分别特定地结合一个目标分析物的捕获探针，其中在尺寸大于衬底 的孔径分布05。的孔中的捕获探针的平均浓度至少等于尺寸小于05。 的孔中的捕获探针的平均浓度。广义地说，通过提供其中平均来说更 大的孔包括更高浓度的捕获探针的衬底，与已知的生物测定衬底相 比，获得了结合效率增加的衬底。生物测定衬底通常由多孔材料制成， 该多孔材料具有带有孔径分布的内孔。图3示出具有优选的宽孔径分 布的合适生物测定衬底的照片。从图3容易推断出，典型的多孔衬底 包括处于从几纳米(nm)到微米(iLiin)范围内的开口孔径。当向已 知的薄膜提供捕获探针时，由于毛细管力、溶剂的蒸发以及由于表面 张力的作用等等，所述探针优选地附着到较小的孔的内表面。然而， 分析物流体的流动输运(特别是在湿润的薄膜的情况下)更容易通过 较大的孔发生，这是因为这些孔对于流过的阻力更低。由于平均来说， 已知衬底中的较大孔包括较少的捕获探针分子，捕获探针分子与分析 物流体特定结合的可能性将低于预期，并且因此将出现下降的结合效 率。发明人已经首次设计了一种生产衬底(在该衬底中，平均来说与 较小的孔相比，较大的孔包括更多的捕获探针分子)方法，并且因此 获得了增加的结合效率和筛选方法，。
在本发明的上下文中，并参照图4，尺寸0i。、 05。和09。是孔径分 布的特征尺寸。如图4所示，由在y轴上表示的一些度量30 (其表 示某一尺寸的孔的量、或相对表面、或体积分数)相对于在x轴上表 示的开口孔径31的曲线图来表示孔径分布。度量30当然依赖于用于 估计孔径分布的特定测量技术。这样定义特征尺寸Ow、 05()和09。使 得孔体积的10%小于或等于0lfl，孔体积的50。/。的小于或等于05。，以及 孔体积的90%的小于或等于09。。已知的若干方法本身可以用于估计所 述多孔衬底的孔隙度和孔径分布。用于测量和/或量化孔径和孔径分 布的公知方法包括成像分析技术、气体吸附以及侵入方法(如汞侵入 方法)。除其他因素之外，要使用的合适方法依赖于平均孔径，例如 汞入侵是更合适的用于测量较大孔的方法。这些方法是众所周知的并 且本领域技术人员将能够没有任何困难地选择合适的测量方法。在孔中的捕获探针的浓度也可以通过本领域中众所周知的方法来估计。合 适的方法包括成像技术(光学和/或电子显微镜)与标准标记法的结 合使用。典型地，荧光或放射性标记或包括金属纳米颗粒的标记使用
允许分别通过(共焦的)荧光显微镜、通过x射线图像板、和/或在
电子显微镜下检测捕获探针和它们的平均浓度。
在多孔生物测定衬底的优选实施例中，在尺寸大于0s。的孔中的
捕获探针的平均浓度至少是尺寸小于05。的孔中的捕获探针的平均浓
度的两倍。所述多孔生物测定衬底的更优选实施例的特征在于，在尺
寸大于05。的孔中的捕获探针的平均浓度至少是尺寸小于05。的孔中的
捕获探针的平均浓度的五倍。如下面将变得显而易见的那样，在较大 的孔中的捕获探针的平均浓度可能受到较小孔的体积百分比的影响， 其中所述较小的孔(暂时)在将捕获探针溶液提供给衬底时不能访问。 与现有技术的衬底相比，当村底本身具有相对较宽的孔径分布 时，本发明的衬底的结合效率方面的可被观察到的改进更大。因此特
别优选的多孔生物衬底具有这样的孔径分布使得(09。-0le) > 205。， 以及更优选地为使得(09。-0m) > 505Q。另一个优选的生物测定衬 底具有这样的孔孔径分布使得(090-05。) > 205。且(05。-010) >2010。
口和/或通道的网络。口多孔衬底可以是纳米多^或'微孔的，'即孔、开 口和/或通道的平均尺寸(以0"的值表征)可以适当地包含在大约 0. 05 jam到10. 0 jum之间。在一个实施例中，这个平均孔径可以在0. 1 pm到3. Oium之间。在另一个实施例中，平均孔径可以在大约0.2 jum到1/im之间。术语"孔隙度"通常意指或包括某一材料中的所 有孔或孔洞(void)相对于整个材料的体积的比率。换句话说，孑L隙 度通常是非固体体积占材料的总体积的比例。在本发明的意义中，术 语"开口孔隙度"(也被称为有效的孔隙度)尤其意指或包括其中有 效地发生流体的流动的总体积中的部分。由于所述开口孔隙度本身在 本申请的上下文中是重要的(封闭的孔对于捕获探针和样本流体都不 可访问)，所以除非另外明确地指出，术语"孔隙度"和"开口孔隙 度，，可交换地在本申请中使用。在本发明的意义中，孔隙度尤其是 0%体积到100 / 体积之间的分数。根据优选实施例，所述孔隙度的范 围从20%体积到98%体积，更优选地为从30%体积到80%体积，并且更优选地为从40%体积到70%体积。
根据本发明的优选实施例，所述多孔衬底材料选自包括下列的
组
-非晶态聚合物，其优选地来自包括下列的组PC(聚碳酸酯)、 PS (聚苯乙烯)、P固A (聚曱基丙烯酸曱酯)、聚丙烯酸酯、聚醚、 纤维素酯、硝酸纤维素、醋酸纤维素、纤维素或其混合物，
-半结晶聚合物，其优选地来自包括下列的组PA(聚酰胺-尼 龙材料)、PTFE (聚四氟乙烯)、聚三氟乙烯、PE (聚乙烯)、PP (聚丙烯)、或其混合物，
-橡胶，其优选地来自包括下列的组PU(聚氨酯)、聚丙烯酸 酯、基于硅烷的聚合物(如PDMS (聚二曱基硅氧烷))、或其混合 物，
-凝胶(-具有流体溶剂矩阵的聚合物网络)，其优选地来自包 括下列的组琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、或其混合物
-金属(如铝、钽、钛)、两种或更多金属的合金，掺杂的金属 或合金、金属氧化物、金属合金氧化物、或其混合物
或上述这些的混合物。这些材料已经示出了本发明内的合适材料。
根据本发明的实施例，固体的多孔衬底材料的内表面区域比该区 域的尺寸大X倍，其中因子X〉100。根据另一个实施例，因子X〉1000， 根据可替代实施例X>10000，以及根据又一个实施例，X>100000。
衬底的厚度不是本发明的限制性特征，并且该厚度可以在从大约
50nm到高达大约3jum或更高(例如高达lmm )之间变化。如果薄膜 是自由无束縳的，例如在流过(flow-through)设备(如上所述)的 情况下，衬底厚度可以处于这样的范围中从liim到数百jum，例如 从20lum至ij 400jam，或从50 p m至'J 200 ji m。
衬底(例如薄膜)的形状和/或尺寸不应当被认为是本发明的限 制性特征。它可以是例如直径范围在大约3mm到15mm之间的圆形， 但是任何其它衬底形状(矩形，正方形，椭圆形，…)和/或尺寸也 可以是合适的。来适当选择。例如，如果目标生物化合物是DNA,则探针可以是但不 限于合成的寡核苷酸、其类似物、或特定抗体。目标生物化合物的合 适修改的非限制性实例是置换了生物素的目标生物化合物，在该情况 下，探针可以承载抗生物素蛋白的功能。
在本发明的特定实施例中，若干不同的探针被沉积到衬底中和/ 或衬底上。在更具体的实施例中，在沿着所述固体衬底的一个表面的 物理上不同的位置上以阵列的方式定位(spotted)多个不同的探针， 以允许并行地测量不同的目标生物化合物。该实施例通常被称为微阵 列。
为了更容易地支持随后的检查和识别， 一个或多个附加的斑点 (例如用于强度校准和/或位置检测)也可定位到衬底材料的表面上。 定位可以由本领域中已知的任何方法来实施，所述方法例如但不限 于，喷墨印刷、压电定位、机器人接触印刷、微量吸管吸允等等。在 定位之后，由于衬底(例如薄膜)固有的或(例如经激活)所获得的 属性自发地，或通过附加的物理处理步骤(比如但不限于例如通过烘 干、加热、温度处理步骤的交联、或通过暴露于光源)，将探针固定 到衬底材料的表面上。
根据本发明，提供一种用于生产生物测定衬底的方法，其中多个 捕获分子溶液从至少一个印刷头释放到多孔衬底上，该方法包括以下
高的沸i的失J介质。通过处理具有所指示特征的失^介质的衬^底， 可以获得改进的结合效率并且因此可以获得改进的筛选方法。
虽然发明人不知道所述改进的准确原因，但是下面提供了尝试性 的解释。生物测定衬底由具有孔径分布的内部孔的多孔材料制成。当 向已知的薄膜提供捕获分子溶液时，似乎合理的是，捕获探针优选附 着到较小探针的内表面。事实上，捕获分子溶剂被认为首先从较大的 孔蒸发，由此在较小的孔中局部地增加捕获探针的浓度。特别地，当 薄膜是电荷中性的，则缺乏使得捕获探针附着到薄膜表面的驱动力。 在捕获分子溶液的溶剂的蒸发期间，溶解的捕获分子在剩余流体中曰 益结块直到它们形成凝胶。而且，由于毛细管力和表面张力，剩余流 体具有对最小孔的偏好。因此，凝胶化、沉降(分子到孔壁的)和最 终结晶和/或固定优选地发生在最小的孔中。然而，分析物流体的流动输运优选地通过较大的孔发生。因为平均来说，越大的孔包括越少 的捕获探针分子，所以将导致捕获探针分子与分析物流体在流过期间 特定结合的可能性的降低，并且因此导致降低的结合效率。根据本发
质的衬底，可以相信，衬底中的较小孔被失活介质有效地(至少是部 分地和/或暂时地)填充或阻挡，并且长时间保持如此，并且优选地 至少直到向衬底提供捕获分子溶液和/或强迫分析物流体通过薄膜为 止。
在根据本发明的优选方法中，在将捕获分子溶液释放到衬底上之 前，向衬底提供失活介质。虽然这对于根据本发明的方法不是必不可 少的，但是用失活介质来预处理衬底通常产生比在将捕获分子溶液释 放到衬底上期间或之后用失活介质来处理衬底的结合效率更高的结 合效率。
在根据本发明的另 一个优选实施例中，在将捕获分子溶液释放到
衬底上之前，在5秒到90分钟之间的时限内向衬底提供失活介质。 甚至更优选的是，在30秒到60分钟之间的时限进行。最优选的是在 l分钟到30分钟的时限进行。
根据本发明，在根据本发明的方法中可以使用与捕获分子溶液的 溶剂相比蒸发更慢或在更高温度时沸腾的任何介质。所述介质可以是 气态的或流体。在本方法的优选实施例中，失活介质包括流体。这种 流体可以容易地通过任何适当的方法施加到衬底，如通过印刷技术活 通过浸涂。特别合适的失活流体包括丙烯醇化合物，从其获得的乙醚 和/或酯，或它们的混合。合适的示例一般包括例如乙二醇、二甘醇、 三甘醇、四甘醇以及聚乙二醇，和/或它们与水的混合物。而且可有 利地使用(聚)丙二醇、丙二醇、二丙二醇等等，例如与具有极性的 聚乙二醇相比，后者是更低极性的溶剂。其他合适的示例包括对本二 酸酯或邻苯二甲酸二辛酯。 一些失活流体可能需要附加的清洗步骤。
当实施根据本发明的优选方法时，在捕获分子的实际印刷的步骤 之前，衬底中的较小孔至少部分地被直接填充(临时)了失活介质。 这样选择失活介质以使得其蒸发更慢并且优选地明显比用于印刷捕 获分子的溶剂更慢，或在更高温度下(高于沸点)蒸发。因此，捕获 分子溶液优选地采用具有比失活介质更好溶解性的溶剂。在本发明的上下文内，当第一蒸发率比第二蒸发率低至少10%,优选地低至少 30%,并且最优选地低至少50%时，认为第一蒸发率显著低于第二蒸 发率。虽然根据本发明的方法不限于此，但是当前使用的大多数捕获 分子溶液是水溶液。这意味着在这种情况下的合适的失活介质以比在 相同温度和压力条件的水更慢的速率蒸发。根据一般物理原理，毛细 管力与孔半径成反比，并且因此其在最小的孔中最大。然而流动阻力 与孔半径的四次方成反比，并且因此与毛细管力相比，随着孔直径的 降低，流动阻力增加得快得多。因此，将要花费一些时间来用失活介 质填充衬底中的孔，并且特别地填充较小的孔。因此，在用失活介质 处理村底的时间和已经填充了失活介质的孔的体积百分比(vol. -%) 之间存在折中。失活液体存在或与多孔衬底接触的越长，则越多的孔 将最终填充有失活液体。
根据本发明的优选方法的特征在于，向衬底提供失活介质，以使 得衬底中的孔的大约50°/。的体积填充有失活介质。优选地，孔的超过 80%的体积填充有失活介质。在本方法的甚至更优选的实施例中，向 衬底提供失活介质以使得基本上衬底中的所有开口孔都被失活介质 所填充。
为了加速处理，根据本发明来执行另一个附加(可选的)的处理， 如清洗、温度处理步骤、光照或暴露于气流。
优选地，在多孔衬底中的至少部分孔已经填充了失活介质之后， 向该村底提供合适的生物流体的捕获探针阵列。根据本发明，使用适 合于该目的的喷墨设备来将多个捕获分子溶液从至少一个印刷头释 放到该多孔衬底上。当捕获分子溶液的液滴撞击衬底表面时，至少部 分液滴材料由衬底的多孔结构所占据，即进入衬底的至少一些孔中。
根据本发明的特别优选的方法包括另一个步骤使得该衬底受到 这样的处理以便在将捕获分子溶液释放到衬底上之前使部分失活介 质从衬底蒸发。该处理可以例如包括在压力下施加空气和/或其他 气态介质的流。这些流的施加导致较大的孔首先打开，即释放那里存 在的任何物质-如失活介质。事实上，对于这些(较大的)孔来说， 毛细管力最低。在至少一些失活液体已经蒸发了之后，将捕获探针印 刷到衬底上。由于在捕获分子溶液的溶剂与失活介质之间的蒸发率的 不同，捕获分子优选地附着和/或开始附着到较大的孔的内表面。由于分析物在其通过/沿着衬底被抽运时也优选通过较大的孔，所以该 措施改进了杂交效率。本发明的方法提供对于在多孔衬底上和/或中 的分析物流体分布的改进的控制。而且，所述方法通过匹配孔(基于 尺寸选择)来增强生物流体流动的捕获可能性，其中捕获探针优选地 位于其中分析物优选地正在流动的孔处。
在根据本发明的方法中，原则上可以使用具有任何孔隙度的任何 衬底。优选的衬底包括具有宽孔径分布的多孔衬底。甚至更优选的衬
底。这样6 优选衬底通常表现出在某^介质流口过方面的差^,这依赖 于衬底和介质分别是干-湿、湿-湿还是湿-干。衬底的优选种类包括 合适聚合物的薄膜。在本领域中，多向和单向的多孔薄膜是公知的， 而与根据本发明的方法无关，并且其是商业可获得的。此外，根据本 发明，优选地使用带电的和增压的和/或化学功能化的薄膜。
本发明还涉及一种用于生产这种生物测定衬底的喷墨设备，并且 涉及一种可通过该方法获得的生物测定衬底。根据本发明的喷墨设备 包括分别用于印刷头和衬底的安装装置，由此该设备包括用于向衬底
^选实施例中，用于向村底提供失活介^、的装置包括印刷头。更优选 的喷墨设备还包括用于测量在填充由失活介质的衬底中存在的失活
介质的量的装置，最优选的为衬底中的孔的体积百分比(vol.-%)。
此外，根据优选实施例，所述设备包括用于通过控制所述衬底顶部的 局部温度、气流和几何形状来控制所述印刷的流体(特别是所述失活 流体和所述捕获探针流体的印刷溶剂)的蒸发率的装置。
包括生物活性分子的物质优选地溶解在溶液中。该溶液典型地为 流体，如水或不同类型的酒精，并且该溶液还可以包括少量的添加剂， 例如用于调节表面张力、粘度或沸点，从而优化印刷特性、斑点形成、
生物流体的保质期(shelf life)等。
尽管已经针对特定实施例并参照某些附图和前面的描述而说明 并描述了本发明，但是这些说明和描述被认为是说明性的或示范性的 而非限制性的。本发明不限于所描述的实施例。相反地，根据本发明 的喷墨印刷机可以用于液滴到薄膜上的任何布局(placement)。它 特别适合于生产用于分子诊断的生物传感器。诊断包括在复杂的混合物(比如血液或唾液)中迅速并灵敏地检测蛋白质和核酸，以用于现 场试验和用于实验中心的诊断。其他应用在医疗(用于心脏病、传染
病和肿瘤的DNA/蛋白质的诊断)、食品以及环境i貪断领域。
权利要求
1. 一种多孔生物测定衬底，其适合用于检测在至少一种样本流体中的至少一种分析物，该衬底包括一个或多个捕获探针，每一个捕获探针能够特定地结合至少一个目标分析物，其中在尺寸大于050的衬底孔径分布的孔中的捕获探针的平均浓度至少等于尺寸小于050的孔中的捕获探针的平均浓度。
2. 根据权利要求1的多孔生物测定衬底，其中在尺寸大于05。的 孔中的捕获探针的平均浓度至少是尺寸小于05。的孔中的捕获探针的 平均浓度的两倍。
3. 根据权利要求1的多孔生物测定衬底，其中在尺寸大于05。的 孔中的捕获探针的平均浓度至少是尺寸小于05。的孔中的捕获探针的 平均浓度的五倍。
4. 根据前述权利要求中任意一项的多孔生物测定衬底，其中孔径 分布是这样的使得(09。-0h) > 2050。
5. 根据权利要求4的多孔生物测定衬底，其中孔径分布是这样 的使得(09。-010) > 5050。
6. 根据前述权利要求中任意一项的多孔生物测定衬底，其中孔隙 度的范围是从20 vol。/。到98 vol%。
7. 根据权利要求6的多孔生物测定衬底，其中所述孔隙度的范围 是从30 vo"/o到80 vol%。
8. 根据权利要求6的多孔生物测定衬底，其中所述孔隙度的范围 是从40 vo"/o到70 vo"/。。
9. 一种用于生产生物测定衬底的方法，其中多个捕获探针分子溶 液从至少一个印刷头释放到所述多孔衬底上，该方法包括以下步骤活介质。
10. 根据权利要求9的方法，其中在将所述捕获探针分子溶液释 放到所述衬底上之前，向所述衬底提供所述失活介质。
11. 根据权利要求10的方法，其中在将所述捕获分子溶液释放到 所述衬底上之前的5秒到90分钟之间的时限内向所述衬底提供所述 失活介质。
12. 根据权利要求11的方法，其中所述时限是在30秒到60分钟之间。
13. 根据权利要求11的方法，其中所述时限是在l分钟到30分 钟之间。
14. 根据权利要求9到13中任意一项的方法，其中向所述衬底提 供所述失活介质，以使得所述衬底的开口孔的体积的大约50°/。填充了 所述失活介质。
15. 根据权利要求14的方法，其中所述衬底的开口孔的体积的大 约80%填充了所述失活介质。
16. 根据权利要求14的方法，其中基本上所述衬底的所有开口孔 都填充了所述失活介质。
17. 根据权利要求9-16中任意一项的方法，包括另一个步骤使 得所述村底受到这样的处理在将所述捕获分子溶液释i文到所述衬底 之前，使部分失活介质从所述衬底蒸发。
18. 根据权利要求9-17中任意一项的方法，其中所述失活介质包 括液体。
19. 根据权利要求18的方法，其中所述失活液体包括丙烯醇或其 混合物。
20. 根据权利要求9-19中任意一项的方法，其中所述捕获分子溶 液包括生物化学反应物和/或寡核普酸、和/或多肽和/或蛋白质、和/ 或细胞、和/或(部分)RNA/PNA/LNA。
21. —种可通过权利要求9-20中任意一项的方法获得的多孔生 物测定衬底，包括一个或多个捕获探针，每一个捕获探针能够特定地 结合一个目标分析物，其中在尺寸大于Os。的衬底孔径分布的孔中的 捕获探针的平均浓度至少等于尺寸小于05。的孔中的捕获探针的平均 浓度。
22. —种用于检查分析物流体存在某种细菌、病毒和/或真菌的方 法，该分析物流体例如为人类的血液或组织样本，其中迫使所述分析 物流体流过根据权利要求1-8中任意一项的衬底或流过所述衬底之 上。
23. —种用于检查分析物流体存在某种细菌、病毒和/或真菌的 方法，该分析物流体例如为人类的血液或组织样本，其中迫使所述分 析物流体流过根据权利要求9-20中任意一项的方法所获得的衬底或流过所述衬底之上。
24. —种用于通过将多种物质释放到衬底上来生产生物测定衬底 的喷墨设备，该设备包括至少一个印刷头，以及分别用于印刷头和衬 底的安装装置，其中该设备包括用于向衬底提供具有比所述捕获分子 溶液的溶剂更低的蒸发率的失活介质的装置。
25. 根据权利要求24的喷墨设备，其中所述用于向衬底提供失活 介质的装置包括印刷头。
26. 根据权利要求24或25的喷墨设备，其中所述设备进一步包 括用于测量在所述衬底中存在的失活介质的量的装置。
27. 根据权利要求24-26中任意一项的喷墨设备，其中所述设备 进一步包括用于测量在填充了失活介质的衬底中的孔的体积百分比 的装置。
28. 根据权利要求24-27中任意一项的喷墨设备，其中所述设备 进一步包括用于使得该衬底受到处理以便使部分失活介质从所述衬 底蒸发的装置。
29. 根据权利要求28的喷墨设备，其中所述设备进一步包括用于 控制所述失活介质和/或捕获探针溶剂的蒸发率的装置。
全文摘要
本发明提供一种多孔生物测定衬底，其适用于检测在生物样本流体中的至少一个分析物。该衬底包括一个或多个捕获探针，每一个捕获探针能够特定地结合一个目标分析物。在尺寸大于O₅₀的衬底孔径分布的孔中的捕获探针的平均浓度至少等于尺寸小于O₅₀的孔中的捕获探针的平均浓度。因此，该衬底表现出改进的结合效率。本发明还涉及一种用于生产该生物测定衬底的方法和设备，并且涉及一种用于使用该衬底检查分析物流体的方法。
文档编号G01N33/53GK101535806SQ200780040800
公开日2009年9月16日 申请日期2007年10月24日 优先权日2006年10月30日
发明者A·皮里克, J·F·迪克斯曼, R·库特 申请人:皇家飞利浦电子股份有限公司