一种三链DNA生物传感器的制作方法与流程

本发明涉及一种三链DNA生物传感器的制作方法，属于生物传感器制备领域。

背景技术：

生物传感器是指利用生物物质(如酶、蛋白质、DNA、抗体、抗原、生物膜、微生物、细胞等)作为识别元件，将生化反应转变成可定量的物理、化学信号，从而能够进行生命物质和化学物质检测和监控的装置。生物传感器的主要功能性元件是生物活性物质，这种物质能够与目标靶分子产生相互作用，并且将这种相互作用的结果转化成可供检测的物理或化学信息。生物传感器具有高选择性、体积小、响应快、仪器成本低等特点。

DNA传感器的工作原理是将单链DNA作为识别元件固定在电极上,单链DNA与目标DNA杂化产生的生物信号,经转换元件转换成可识别信号。DNA电化学生物传感器具有选择性强、制备简单、反应快速等优点。在没有目标物时，溶液中的单链核酸链的形态是不确定的，它能形成各种空间构象。加入目标物后，由于核酸碱基之间的互补配对，静电作用力，范德华力，氢键作用力等，核酸链折叠成多种空间结构，如发夹型(hairpin)，假结(pseudoknot),G-四分体(G-quartet)，茎环(stem-loop)等结构。

本发明中应用的是三链结构，是在DNA双螺旋结构的基础上形成的，这种结构虽然早就被发现了，但还未见过应用于传感器领域的。形成三链的3条链均为同源嘌呤或同源嘧啶，一般分为两种类型：嘌呤-嘌呤-嘧啶(Pu-Pu-Py)型，嘧啶-嘌呤-嘧啶(Py-Pu-Py)型；Py-Pu-Py型三螺旋的稳定性受到其内部因素(例如长度和序列组成等)、外部因素(如pH、温度和抗衡离子等)的影响。Pu-Pu-Py型三螺旋的稳定性基本上不受pH的影响，金属的一价和二价离子可以增加其热稳定性。本实验中所用三链是Pu-Pu-Py型，通过调节MgCl₂的浓度来调节三链DNA的稳定性，以及三链DNA形成的比例。

本实验中另一种二维材料：氮掺杂石墨烯，具有独特的电学、光学、机械等性能，不仅在结构方面具有可设计性、可调控性，而且其巨大比表面积和易于功能化等特点使其在作为生物传感器材料方面显示出广阔的应用前景。本实验中利用氮掺杂石墨烯对单链DNA比双链DNA吸附作用强的特性，进行DNA的组装。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题在于三链DNA的稳定形成以及三链DNA与电极之间的连接问题。本发明通过调节DNA杂交的条件来形成稳定的三链结构。采用氮掺杂石墨烯作为基底吸附到电极表面，而氮掺杂石墨烯对单链DNA具有很好的吸附作用，对双链DNA吸附作用很弱，从而使得三链DNA能够很好地站立在电极表面，三段单链形成三角结构使得DNA在电极表面更稳定。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种三链DNA生物传感器的制作方法，包括以下步骤：

1)确定三条单链DNA：ssDNA-1、ssDNA-2、ssDNA-3。其中ssDNA-1与ssDNA-2部分互补配对；三条连符合Pu-Pu-Py型结构；其余不配对碱基完全相同。

2)设计好的ssDNA-1和ssDNA-2杂交，比例是1:1，形成dsDNA，杂交条件：杂交条件：95℃变性5min，温度降至20℃。

3)dsDNA和ssDNA-3杂交，杂交条件：MgCl₂的浓度是5mM，于冰箱4℃杂交12h，杂交完成后冷冻备用。

4)准备玻碳电极：打磨玻碳电极，依次用二次水、乙醇、二次水进行超声清洗，用氮气吹干电极表面，滴加3μL氮掺杂石墨烯溶液，静置晾干，用二次水冲洗，氮气吹干。

5)滴加15μL三链DNA到电极表面，湿润条件下放置1h，得到三链DNA传感器。

优选的是，设计的ssDNA自身不会杂交缠绕，不会形成发卡或者其他结构，结构最小自由能为零，具有相当稳定的单链结构。

优选的是，DNA的储备液是PBS缓冲液，浓度为5mM，pH＝7.4。

优选的是，所述ssDNA-1和ssDNA-2的杂交的浓度比例是1:1。

优选的是，dsDNA与ssDNA-3杂交浓度比例是1:1，缓冲液是PBS，含有5mM的MgCl₂，PBS浓度为5mM，pH＝7.4。

优选的是，所用氮掺杂石墨烯溶剂是乙醇，浓度是1μg/mL，所用体积是3μL。

优选的是，所用三链DNA的浓度是15μM，体积是15μL。

本发明具有以下优点：

1)新颖：本发明采用三链DNA，是其他发明专利没有用过的。

2)稳定：这种三链结构吸附在电极表面的单链部分在电极表面形成三角形，具有很好的稳定性。

3)无污染：整个检测过程不需要用到有机溶剂或有毒试剂。

附图说明

图1为本发明三链DNA传感器的构建示意图。

图2不同修饰过程的阻抗图(A)和循环伏安图(B)

具体实施方式

为了使本发明的内容、目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合说明书附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本领域内的技术人员所熟知的一般替换也涵盖在本发明的保护范围内。

实施例1

1.三链DNA结构中单链DNA的设计

选定的三链DNA为

ssDNA-1：5’AAAAAAAAAATCTCTCTCTCTCT 3’

ssDNA-2：5’AGAGAGAGAGAGAAAAAAAAAAA3’

ssDNA-3：5’AAAAAAAAAAAGAGAGAGAGAGA3’

其中，需要说明的是，设计的ssDNA自身不会缠绕在一起，不会形成发卡或者其他结构，结构最小自由能为零，具有相当稳定的单链结构。未配对的单链碱基序列可以吸附在氮掺杂石墨烯表面，使得DNA和电极组装到一起。

2.实验部分

1)将订购的单链DNA干粉离心5min，转速设置为6000转/分钟，加入适量5mM PBS缓冲液(pH＝7.4)，配成50μM的浓度，震荡3min至溶液充分均匀。

2)ssDNA-1和ssDNA-2浓度1:1杂交，杂交条件：95℃变性5min，温度以恒定速度降至20℃，形成dsDNA。

3)dsDNA和ssDNA-3浓度1:1杂交，最终三链DNA浓度为15μM，杂交条件：MgCl₂的浓度经过调节优化，最终浓度是5mM，于冰箱4℃杂交12h，杂交完成后冷冻备用。

4)用0.05μm Al₂O₃粉末打磨玻碳电极，依次用二次水、乙醇、二次水进行超声清洗，氮气吹干电极表面后立即滴加3μL 1μg/mL的氮掺杂石墨烯溶液，静置晾干，用二次水冲洗，氮气吹干。

5)滴加15μL 15μM三链DNA到电极表面，湿润条件下放置1h，得到三链DNA传感器。

6)为了验证传感器的组装，每一步都用阻抗和循环伏安进行验证(附图2)。

尽管本发明已以较佳实施例公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，所述实施例仅为了便于说明而已，对于熟悉本领域的人员而言，在不脱离本发明精神和范围的前提下可作若干的更动与润饰，本发明所主张的保护范围应以权利要求书所述为准。