本发明涉及一种唾液中烟碱含量的测定方法，特别是涉及一种高效液相色谱法测定唾液中烟碱含量的检测方法。
背景技术：
口含烟是一种无烟气烟草制品，是将磨碎的烟草颗粒经过加工后直接放在口腔中消费的一种烟草制品，使用时将其放置在嘴唇与牙龈之间，烟碱等烟草成分经唾液溶解后通过口腔黏膜吸收。作为口含烟中的关键成分，烟草释放出的烟碱可使消费者植物神经和中枢神经系统感受到刺激兴奋作用，因而口含烟也会导致成瘾。相比于传统卷烟，口含烟不发生燃烧和裂解，不产生燃烧产物和裂解产物，因此被认为对人体的危害性更小。近年来，随着世界反吸烟运动的不断推进，口含烟作为烟草消费的补充形式日益受到关注。
口含烟直接在人体口腔中消费，其中的烟碱需要转移到唾液中才能被口腔黏膜吸收。因此，唾液中的烟碱含量直接关系着消费者的使用体验。唾液中烟碱含量随时间的变化趋势对口含烟性能也起着关键作用。目前关于唾液中烟碱含量的测定方法还未见报道。
技术实现要素：
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种唾液中烟碱含量的测定方法，用于解决现有技术的不足问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明一方面提供一种唾液中烟碱含量的测定方法，至少包括以下步骤：
(1)采用微孔滤膜对唾液进行过滤，得滤液；
(2)采用高效液相色谱法测定滤液中烟碱的含量，其中所述高效液相色谱法中使用的色谱柱为c18柱，色谱柱的柱温是36℃～37℃，使用的流动相采用甲醇和磷酸盐缓冲液，所述甲醇和磷酸盐缓冲液的体积比是50～70:30～50，所述磷酸盐缓冲液在使用前加入三乙胺并调节ph到6.2～7。
所述滤液也可以是续滤液。
优选地，所述步骤(1)中的微孔滤膜的孔直径是小于等于0.22μm。
所述色谱柱可以是agilentextendc18(4.6×250mm，5μm)，pn：770450-902，sn：ushr009587。
优选地，所述步骤(2)所述甲醇和磷酸盐缓冲液的体积比是60:40。
所述磷酸盐缓冲液调节ph为6.5。
优选地，所述步骤(2)中高效液相色谱法中检测波长为259nm。
优选地，所述步骤(2)中磷酸盐缓冲液为na2hpo4缓冲液，所述na2hpo4浓度为0.02-0.03mol/l。
具体测定时，先配制7个浓度梯度的烟碱标准品唾液，按照色谱条件，分别测定峰面积，每个浓度测定2次，取平均值进行线性回归。然后以相同方法供测试品唾液进行测定，将供测试品唾液色谱峰面积带入标准曲线的回归方程中得到供测试品唾液中的烟碱的浓度。
本发明另一方面还提供了上述烟碱含量的测定方法用于测定唾液中烟碱含量的用途。
如上所述，本发明的一种唾液中烟碱含量的测定方法，具有以下有益效果：
本发明的测定方法烟碱专属性高、抗干扰性强，准确性高、重复性好、稳定性高，回收率97.21％～98.50％。
附图说明
图1是空白唾液色谱图。
图2是烟碱唾液色谱图。
图3是使用口含烟的唾液色谱图。
图4是实施例1条件下的峰面积与烟碱浓度的关系图。
图5是实施例2条件下的峰面积与烟碱浓度的关系图。
图6是实施例3条件下的峰面积与烟碱浓度的关系图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。须知，下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置。此外应理解，本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤，除非另有说明；还应理解，本发明中提到的一个或多个设备/装置之间的组合连接关系并不排斥在所述组合设备/装置前后还可以存在其他设备/装置或在这些明确提到的两个设备/装置之间还可以插入其他设备/装置，除非另有说明。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。
仪器与试剂
烟碱标准品(纯度98.54％，上海雅吉生物科技有限公司)，甲醇(色谱纯，rcilabscan)，nah2po4·2h2o(分析纯，湖州湖诚化学试剂有限公司)，nah2po4(分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司)，h3po4(分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司)，高效液相色谱仪(agilent1260，安捷伦科技有限公司)。
实施例1：
检测步骤：
(1)取样
用导管分别取出使用0.1g口含烟时的唾液。
(2)样品前处理
该唾液经0.22μm微孔滤膜过滤。
(3)用高效液相色谱法测定续滤液的烟碱含量。
采用的液相色谱条件如下：
色谱柱：agilentextendc18(4.6×250mm，5μm)，pn：770450-902，sn：ushr009587；流动相：甲醇：磷酸盐缓冲液(0.02mol/lna2hpo4，加入0.2％三乙胺后，磷酸调ph至6.5)＝60：40；(体积比)流速：1ml/min；检测波长：259nm；柱温：36℃；进样量：20μl。
如图1～图3所示，烟碱色谱峰的保留时间为4.2min左右，唾液中的其它成分没有干扰。往空白唾液中加入一定量烟碱(烟碱唾液)，连续进样6次，重复性数据见表1。rsd值为0.29％，说明高效液相色谱法重复性优异。
表1
取同一口含烟唾液样品，过滤后在不同的时间点(8小时以内)测定烟碱峰面积，结果如表2所示。rsd值仅为0.22％，说明口含烟唾液稳定性优异。
表2
配制7个浓度梯度的烟碱唾液，分别测定峰面积，每个浓度测定2次，取平均值进行线性回归，试验结果如图4所示。回归方程式为y＝16.91x-3.24(n＝2，r2＝0.9999)，说明烟碱浓度在0.70～44.65μg/ml区间内线性关系良好。
分别往空白唾液中加入浓度为507.2μg/ml、50.72μg/ml和5.072μg/ml的烟碱，经0.22μm微孔滤膜过滤，测定滤液的烟碱含量，计算回收率，结果如表3所示，回收率处于97.21％-98.50％之间，表明该方法有效。
表3
以相同方法对供测试品唾液进行测定，将供测试品唾液色谱峰面积带入标准曲线的回归方程y＝16.91x-3.24中得到供测试品唾液中的烟碱的浓度为10ug/ml。
实施例2：
检测步骤：
(1)取样
用导管从实施例1的样品中取出使用0.1g口含烟时的唾液。
(2)样品前处理
该唾液经0.22μm微孔滤膜过滤。
(3)用高效液相色谱法测定续滤液的烟碱含量。
采用的液相色谱条件如下：
色谱柱：agilentextendc18(4.6×250mm，5μm)，pn：770450-902，sn：ushr009587；流动相：甲醇：磷酸盐缓冲液(0.025mol/lna2hpo4，加入0.2％三乙胺后，磷酸调ph至6.2)＝50：50；(体积比)流速：1ml/min；检测波长：259nm；柱温：37℃；进样量：20μl。
类似图1～图3，烟碱色谱峰的保留时间为4.2min左右，唾液中的其它成分没有干扰。往空白唾液中加入一定量烟碱(烟碱唾液)，连续进样6次，重复性数据见表4。rsd值为0.83％，说明高效液相色谱法重复性良好。
表4
取同一口含烟唾液样品，过滤后在不同的时间点(8小时以内)测定烟碱峰面积，结果如表5所示。rsd值仅为0.24％，说明口含烟唾液稳定性优异。
表5
配制7个浓度梯度的烟碱唾液，分别测定峰面积，每个浓度测定2次，取平均值进行线性回归，试验结果如图5所示。回归方程式为y＝16.91x–3.26(n＝2，r2＝0.9991)，说明烟碱浓度在0.70～44.65μg/ml区间内线性关系良好。
分别往空白唾液中加入浓度为507.2μg/ml、50.72μg/ml和5.072μg/ml的烟碱，经0.22μm微孔滤膜过滤，测定滤液的烟碱含量，计算回收率，结果如表6所示，回收率处于98.21％-99.80％之间，表明该方法有效。
表6
以相同方法对供测试品唾液进行测定，将供测试品唾液色谱峰面积带入标准曲线的回归方程y＝16.91x–3.26中得到供测试品唾液中的烟碱的浓度为10.5ug/ml。
实施例3：
检测步骤：
(1)取样
用导管从实施例1的样品取出使用0.1g口含烟时的唾液。
(2)样品前处理
该唾液经0.22μm微孔滤膜过滤。
(3)用高效液相色谱法测定续滤液的烟碱含量。
采用的液相色谱条件如下：
色谱柱：agilentextendc18(4.6×250mm，5μm)，pn：770450-902，sn：ushr009587；流动相：甲醇：磷酸盐缓冲液(0.03mol/lna2hpo4，加入0.2％三乙胺后，磷酸调ph至7)＝70：30；(体积比)流速：1ml/min；检测波长：259nm；柱温：36.5℃；进样量：20μl。
类似图1～图3，烟碱色谱峰的保留时间为4.2min左右，唾液中的其它成分没有干扰。往空白唾液中加入一定量烟碱(烟碱唾液)，连续进样6次，重复性数据见表7。rsd值为0.71％，说明高效液相色谱法重复性优异。
表7
取同一口含烟唾液样品，过滤后在不同的时间点(8小时以内)测定烟碱峰面积，结果如表8所示。rsd值仅为0.18％，说明口含烟唾液稳定性优异。
表8
配制7个浓度梯度的烟碱唾液，分别测定峰面积，每个浓度测定2次，取平均值进行线性回归，试验结果如图6所示。回归方程式为y＝17.43x–8.04(n＝2，r2＝0.9986)，说明烟碱浓度在0.70～44.65μg/ml区间内线性关系良好。
分别往空白唾液中加入浓度为507.2μg/ml、50.72μg/ml和5.072μg/ml的烟碱，经0.22μm微孔滤膜过滤，测定滤液的烟碱含量，计算回收率，结果如表9所示，回收率处于95.22％-99.29％之间，表明该方法有效。
表9
以相同方法对供测试品唾液进行测定，将供测试品唾液色谱峰面积带入标准曲线的回归方程y＝17.43x–8.04中得到供测试品唾液中的烟碱的浓度为11.2ug/ml。
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。